Name: 에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두 바이러스 감염 Drosophila 전지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-25T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 배우세요 RNAi 스크리닝을 사용하여 Drosophila 세포에서 바이러스 감염에 관여하는 호스트 요인을 식별하는 방법을. 면역형광 현미경으로 감염을 정량화하고 자동 이미지 분석으로 후보 유전자를 선별할 수 있습니다.

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이 작품은 NIAID (R01AI074951, U54AI057168)와 SC에 펜 게놈 프론티어 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다; NIH T32HG000046에서 TSM로, NIH T32GM07229과 T32AI007324에서 LRS 수 있습니다.

1 부 : 384 자 플레이트에서 RNAi <ol><li> 검사에 사용되는 시약의 표준화가 필수적입니다. 우리는 슈나이더의 미디어의 개별 많은, 태아 소 혈청 및 얼룩의 시약을 테스트합니다. 그럼 우리가 화면 전체에 대해 동일한 많이 나누어지는하고 사용합니다. </li><li> 어떤 분석 들어, 읽기 밖으로 생물 학적 가장 의무가 어떤 결정하기 위해 몇 가지 다른 세포 라인을 테스트하는 것이 좋습니다. 우리는 일반적으로 S2 - DRSC 라인을 사용합니다. </li><li> 25 ° C 전체 슈나이더의 미디어에 Drosophila 세포를 성장. <ol class="lalpha"><li> 슈나이더의 미디어 </li><li> 10% 열 inactivated FBS </li><li> 1X L - 글루타민 </li><li> 1X 펜 / strep 항생제 </li></ol></li><li> Drosophila 세포는 반 자기편하며 flasks에서 세포를 pipetting하고 신선한 플라스크에 1시 10분 세포를 diluting하여 모든 사일 trypsinization없이 passaged 있습니다. 세포 실험에 대한 로그 단계에서해야합니다. </li><li> 판 - 투 - 플레이트와 일상적인 변화는 다중 잘 접시 모든 액체 추가에 대한 자동 액체 처리의 사용을 통해 최소화하고 있습니다. 우리는 WellMate (매트릭스)를 사용합니다. </li><li> WellMate 튜빙을 준비합니다. <ol class="lalpha"><li> 70 % 에탄올로 스프레이 후드와 WellMate. </li><li> 70 % 에탄올로 패키징과 스프레이에서 튜브를 제거합니다. </li><li> WellMate에 위치를 분배에 튜브 카세트를 넣습니다. </li><li> 70 % 에탄올 25 ML과 프라임 튜빙. </li><li> 에탄올의 다른 25 ML과 다음 주요 15 분에 대한 에탄올의 튜빙을 소독. </li><li> 멸균 PBS 50 ML과 프라이밍하여 튜빙을 씻어. </li></ol></li><li> 술병과 카운트에서 세포를 이동시키다. 펠렛 세포가 그래서 당신은 (300xg, 5 분) 필요보다 25 % 더있다. 잘마다 씨앗을 품고 세포의 숫자는 분석 기간에 따라 최적화되어야합니다. 자동 이미지 분석을 실시하는 경우에는 셀 clumping로 단일 monolayer 이미지 세분화에 이상적입니다. </li><li> 1.7x10 6 셀 / ML에서 혈청 무료 슈나이더의 미디어 pelleted 세포를 Resuspend. </li><li> 우리는 384 잘 접시 250ng/well의 농도에 dsRNA의 상용 라이브러리로 사전 aliquoted에서 화면을 수행합니다. 각 접시의 여러 우물을 수동으로 추가하는, 컨트롤에 빈 남아 있습니다. 우리는 부정적인 제어로 루시페라제하는 dsRNA를 사용합니다. 우리는 강력한 RNAi를 제어하는​​ 등 실 (dIAP)에 대한 dsRNA를 사용합니다. 극적인 세포 죽음이 안티 apoptotic 요소 결과의 허물고 다운 노크의 품질을 평가하는 간단한 시각적 방법입니다. 마지막으로, 우리는 우리의 분석을 읽고 아웃 사용하여 바이러스 감염을 억제 수 확인하는 긍정적인 제어로,이 경우 베타 galacosidase에서 바이러스 기자에 대한 dsRNA를 사용합니다. 세포 심는 쉽게 시각화 수 있도록 잘의 모퉁이에 나누어지는 1 μl dsRNA시 판으로 dsRNA을 찾을 경우, 전지를 추가하기 전에 우물의 바닥 (300xg, 1 분)에 dsRNA를 원심 분리기. </li><li> 각 물론 위의 준비를 10 μL 세포를 추가할 수 WellMate 사용합니다. </li><li> 300xg, 1 분 centrifuging하여 접시에 세포를 스핀. </li><li> 45 분 동안 25 ° C 배양기에서 알을 품다. </li><li> 20 μL 전체 슈나이더의 미디어를 추가하고 300xg 1 분 원심 분리기. </li><li> humidified 유리 섬유 복합 용기에 넣어 접시 물에 젖었을 종이 타월로 늘어서. 384의 볼륨이 잘 작습니다, 따라서 증발이 차례로 가장자리 우물의 읽기 아웃에 artifactual 변화로 이어질 수있는 생물에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 이것을 극복하기 위해, 접시는 높은 습도에 따라 유지되어야합니다. </li><li> 강력한 최저 수 있도록 사흘 동안 품어. 미디어를 변경하거나이 시간 동안 humidified 용기를 열 필요가 없습니다. </li></ol> 2 부 : 우두 바이러스에 감염 <ol><li> 15 분 Quatricide에 소독 멀티 채널 흡인기, 다음 70 % 에탄올로 헹굼. </li><li> 위에서 설명한 WellMate를 준비합니다. </li><li> 혈청 무료 미디어 전체 미디어 1:5 diluting에 의해 감염 2퍼센트 FBS와 슈나이더의 미디어를 준비합니다. </li><li> 세포 파편을 제거하거나 정화 바이러스를 사용하는 필터 0.8 음 주사기를 통해 필터 원유 바이러스 주식. </li><li> 2 감염의 다중성을 (뫄)을 구하는 2퍼센트 혈청 슈나이더의 미디어에 우두 바이러스를 희석. </li><li> WellMate 튜브에서 PBS를 제거하고, 튜브 기포가 무료 때까지 희석 바이러스와 프라임. </li><li> 부드럽게 dsRNA - 대우 Drosophila 세포의 접시에서 미디어를 제거하는 소독 다중 채널 흡인기 및 진공 매니폴드를 사용하십시오. </li><li> WellMate를 사용하여 접시에 잘 30 μL 바이러스를 분배. </li><li> 300xg에서 접시 1 분 원심 분리기. </li><li> WellMate 튜빙을 소독. 10 % 블리 25 ML과 프라임채널, 10 분 기다려야하고, 또 다른 25 ML 10 % 표백제와 프라임. </li><li> 50 ML의 물로 프라임 튜브 50 ML 70 % 에탄올로 따라갔다. 자사 포장 튜빙을 반환합니다. </li><li> humidified 유리 섬유 복합 컨테이너에 번호판을 반환합니다. 48 시간 동안 25 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 파트 3 : 스테 이닝 플레이트 <ol><li> 10 분 15 μL 4 % 포름 알데히드 / PBS에 번호판을 수정. 액체는 다중 채널 흡인기 각 단계에서 진공 매니폴드를 사용하여 제거됩니다. 일단 접시는 멸균 장비가 해결되었습니다 및 시약이 더 이상 필요하지 않습니다. </li><li> 삭제 수정 30 μL PBST (PBS + 0.1 % 트리톤 - X)를 추가하는 WellMate를 사용합니다. 10 분 반복 품어. 튜빙은 소독 할 필요가 없다를 제외하고 운영, 위에서 설명한 WellMate. </li><li> 우두 감염을 감지하기 위해 우리는 늦은 / 이른 우두업자에 의한 β - galactosidase의 기자를 사용합니다. </li><li> 10 분 블록에서 액체와 부화 세포를 (2 % BSA와 PBST)를 제거합니다. </li><li> 블록의 기본 항체를 희석, 액체를 제거하고 각 잘 멀티 채널을 사용하여 반복 pipettor (매트릭스) 15 μL 항체를 추가합니다. </li><li> 접시 (300xg, 1 분) 스핀 다운, 맑은 스티커로 커버 4 ° C 하룻밤에 품어. </li><li> 기본 항체를 제거하고, PBST 3 회 10 분 각 우물을 씻어 WellMate을 사용합니다. </li><li> 찬란 표시된 보조 항체 (FITC)와 블록에 얼룩이 핵을 희석하고, 다중 채널 반복 pipettor를 사용하여 우물 15 μL를 추가합니다. </li><li> 부화 플레이트 실온에서 1 시간, 빛으로부터 보호. </li><li> PBST 3 회, WellMate를 사용하여 십분 각 우물 씻으십시오. </li><li> 4 명확한 스티커, 커버, 그리고 저장과 번호판을 봉쇄 ° C를 3 주. </li></ol> 4 부 : 이미징 및 이미지 분석 <ol><li> 이미지 판에 20X 배율에서 자동 현미경을 사용합니다. </li><li> 총 핵 (DAPI)와 감염된 세포 (FITC)의 이미지를 캡처합니다. 동적 범위를 극대화하기 위해서는 개별적으로 각 채널에 대한 노출 시간을 최적화합니다. </li><li> 초점의 예상 비행기 위에서 아래 비행기에 걸쳐 이미지, 간격 간격 1um의 Z 스택을 복용하여 자동 초점 기능을 조정. 최적의 초점 비행기가있는되면, 그에 따라 자동 초점 설정을 조정합니다. </li><li> 이미지 전체 접시, Hoechst 채널 (DAPI)와 바이러스 채널 (FITC) 모두에 잘마다 적어도 세 이미지를 캡처. 전체적으로 잘 나타내는 이미지를 캡처하기 위해서는 잘 하나에 여러 지역에서 사이트를 선택합니다. </li><li> 세그먼트에 이미지를 일기를 작성하고 각 플레이트에 대한 핵 얼룩 (총 셀) 및 감염 (FITC)에 대한 긍정적인 세포의 총 수를 계산 카운트 핵 모듈을 사용하는 소프트웨어를 MetaXpress 사용합니다. </li><li> %의 감염 (100 * FITC 긍정 / 총 세포)을 계산하고 변환 로그인하십시오. </li><li> 지원자를 확인하려면 우리는 각각의 접시의 평균과 interquartile 범위를 기반으로 강력한 Z 점수를 사용합니다. 이 방법은 outliers 및 nonsymmetric 데이터를 구분하지 않습니다, 그래서 심지어는 약하거나 중간 조회수 10 식별 큰 전력을 제공합니다. 각 접시, 중간은 로그 변환된 데이터로부터 빼서 수 있습니다. 그러면 결과 값은 0.74 배 interquartile 범위 (75 번째 백분 위수의 가치와 25 번째 백분 위수 사이의 차이)로 나누어집니다. 0.74 요인은 대략적인 표준 정규 분포하는 데 사용됩니다. </li><li> 강력한 Z 점수는 접시의 평균으로부터 표준 편차의 거리의 측정입니다. 예를 들어, 2의 강력한 Z - 점수는 우물의 %를 감염 플레이트 평균 또는 P &lt;0.05부터 ~ 2 표준 편차 나타냅니다. </li><li> 세포 독성 후보자를 식별하는 휴대폰 번호를 분석합니다. 핵 카운트의 강력한 Z 점수를 계산합니다. 중복 화면에서 강력한 Z &lt;-2과 지원자는 세포 독성 간주됩니다. </li><li> 세포 독성없이 중복 화면에서&gt; 2 또는 &lt;-2 (P는 &lt;0.0025)의 %의 감염에 대한 강력한 Z 점수를 웰스는 기본 화면에서 잠재적인 후보로 간주됩니다. </li><li> 긍정적인 후보자는 독립적인 시약을 사용하여 확인됩니다. dsRNAs는 mRNA의 다른 지역에서 관심의 유전자에 대한 생성하고 위와 같이 테스트합니다. </li><li> 두 개의 독립적인 dsRNAs 같은 표현형을 가지고있는 이들 유전자들은 진학 간주될 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 이미지와 감염률의 해석 <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 잘 감염 대리인으로 immunofluorescence 현미경으로 측정 우두 - 표현 베타 galactosidase (βgal) 단백질에 대한 긍정적인 얼룩 세포를 포함하는 동안 그림 1. 감염되지 않은 우물은 우두 바이러스 단백질에 대한 얼룩을 표시하지 않습니다.바이러스 = 녹색, 핵 = 파란색. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 자동 이미지 분석 소프트웨어는 사용자가 설정한 매개 변수를 사용하여 각 이미지에 감염을 단정. 대표 이미지, 세포 핵 및 바이러스 항원을 표현하는 세포의 수를의 총 숫자는 크기와 지역 배경 위에 얼룩 얼룩의 강도에 따라 계산됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 스레드 (dIAP)의 분해는 대상 유전자의 강력한 RNAi 고갈에 대한 긍정적인 제어 역할을합니다. 이 안티 apoptotic 요소의 최저는 극적인 세포 사망에 이르게한다. 핵 = 파란색. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 루시페라제 그림 4. 최저 감염을 두 번 좌초 RNA 치료의 효과에 대해 부정적인 제어 역할을합니다. 루시페라제의 고갈은 치료 왼쪽 세포에 상대적인 감염에 아무런 영향을 미치지 않습니다. 바이러스 = 녹색, 핵 = 파란색. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 가 감염 밖 읽은 상태로 분석이 βgal 단백질 수준을 사용하고 있기 때문에 그림 5. βgal 단백질의 분해는, 감염의 감소에 대한 긍정적인 제어 역할을합니다. 감염된 세포의 비율에있는 감소 βgal 결과의 고갈. 바이러스 = 녹색, 핵 = 파란색. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 감염된 세포의 비율에있는 감소에 휴대 요소 Rab5 결과 최저. Rab5가 endocytosis에 참여하는 것으로 알려져 있기 때문에,이 요소는 가능성이 우두 바이러스 항목에 기여하고 있습니다. 이 화면에서 예제 국외자를 나타냅니다. 바이러스 = 녹색, 핵 = 파란색.

<ol><li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).</li>
<li>Chotkowski, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus+infection+of+Drosophila+melanogaster+induces+a+protective+RNAi+response%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response.</a> Virology. 377, 197-206 (2008).</li>
<li>Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+in+Drosophila+melanogaster+cells%3A+regulation+of+viral+transcription+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication.</a> J Virol. 62, 277-284 (1988).</li>
<li>Sessions, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+insect+and+human+dengue+virus+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of insect and human dengue virus host factors.</a> Nature. 458, 1047-1050 (2009).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+RNAi+screening+in+Drosophila+S2+cells%3A+what+have+we+learned+about+host-pathogen+interactions%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions?</a> Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).</li>
<li>Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+RNAi+screen+identifies+host+genes+important+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication.</a> Nature. 454, 890-893 (2008).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+activity+coupled+with+fatty+acid+biosynthesis+is+required+for+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication.</a> PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+specific+sensitivity+of+IRES-containing+RNA+viruses+to+host+translation+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition.</a> Genes Dev. 19, 445-452 (2005).</li>
<li>Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Kinome+RNAi+Screen+Identified+AMPK+as+Promoting+Poxvirus+Entry+through+the+Control+of+Actin+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Drosophila의 게놈 - 광범위한 RNAi 검사는 바이러스 감염의 세포 구성 요소를 검토를위한 강력하고 효율적인 방법을 제공합니다. 포유 동물 바이러스의 숫자는 호스트 본질적인 면역 반응의 구성 요소, 그리고 새로운 치료 목표를 나타내는 수 있습니다 바이러스 복제에 필요한 호스트 단백질 요소를 식별하는 데 사용할 수있는 Drosophila 세포를 감염. 화면을 수행하기 전에 분석은 신중하게 셀 타입, 휴대폰 번호, 그리고 감염 수준에 최적화된해야하며, 잘 11 긍정적이고 부정적인 바이러스와 세포의 목표를 ​​모두 포함 제어해야합니다. 분석의 동적 범위를 극대화하기 전에 검사하는 긍정적이고 부정적인 컨트롤 사이에 충분한 간격을 확보하는 것이 중요합니다. 화면이 수행되면 후보자는 호스트 메커니즘이 감염에 기여하는 결정하기 위해 기능적 범주로 나눌 수 있습니다. 같은 우두와 같은 포유 동물의 바이러스 예방 프로그램으로, RNAi의 포유 동물 homologs의 기여는 이차 분석의 일부로 결정되어야합니다. 함께 촬영이 강력한 심사 방법은 우리가 바이러스가 자신의 호스트 세포와 상호 작용하는 복잡한 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;세포 배양&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s media</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11720</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 100X</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin (pen/strep)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>소태아혈청 (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;스크리닝&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>전유전체 dsRNA 라이브러리</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384 웰 플레이트, 투명 바닥 블랙</td><td>Corning</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 씰</td><td>Corning</td><td>6569</td><td></td></tr><tr><td>투명 씰</td><td>Denville Scientific</td><td>B1212-4</td><td></td></tr><tr><td>Well Mate</td><td>Matlab</td><td>201-10001</td><td></td></tr><tr><td>24 핀 매니폴드</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-101</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>형광 표지 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageXpressMicro 자동 현미경</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress 이미지 분석 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

에 관련된 호스트 요인에 대한 rnai 심사 우두</em사용하기> 바이러스 감염 drosophila 전지

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

뿐만 아니라 바이러스는 인간의 질병의 자연적인 유행을 일으킬 수 있지만, bioterrorism 그들의 잠재적인 사용은 또한 관심사입니다, 바이러스성 병원체는 중요한 공중 보건 위협을 나타냅니다. 충격 감염이 많이 - 필요한 치료제의 개발을 용이하게한다고 세포 요인 이해. 여러 생물의 시퀀싱 전체 게놈과 함께 RNA 간섭 (RNAi) 기술의 최근 발전은 게놈 차원, 셀 기반의 손실의 기능 화면의 최적화되었다. Drosophila 세포 때문에의 게놈 규모의 화면에 특히 의무 아르 이 시스템은 1 RNAi의 용이성 및 효율성. 중요한 것은 바이러스의 다양한 의료 및 농업 중요성 2,3,4의 포유 동물 바이러스의 숫자를 포함 Drosophila 세포를 감염시킬 수 있습니다. Drosophila에서 이전 RNAi 화면 항목 번역과 RNA 복제 5 포함한 바이러스 감염의 여러 단계에 필요한 호스트 요인을 확인했습니다. 또한, Drosophila의 세포 배양에서 바이러스 복제에 필요한 세포 요인의 대부분은 이러한 바이러스 4,6,7,8, 9 감염된 인간의 세포에 제한됩니다. 따라서, 바이러스 감염 동안 공동 선택한 호스트 요인의 식별은 항바이러스 치료제에 대한 새로운 목표를 제공합니다. 여기 예로 우두 바이러스를 사용하여 바이러스 감염에 관련된 세포 요소를 식별하는 높은 처리량 RNAi 화면에 대한 일반적인 프로토콜을 제시한다.

바이러스 감염에 관련된 소설 호스트 요소는 기능 RNAi 심사의 셀 기반의 게놈 전체의 손실을 통해 확인할 수 있습니다.<em&gt; Drosophila</em&gt; 세포 배양 모델은 RNAi의 용이성과 효율성으로 인해 이러한 접근 방식에 특히 의무가 있습니다. 우리가 사용하는이 기술을 증명<em&gt; 우두</em예로&gt; 바이러스.

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두</em사용하기> 바이러스 감염 Drosophila 전지

바이러스성 병원체는 공중 보건에 중대한 위협이 됩니다. 바이러스는 인간 질병의 자연적인 유행을 일으킬 수 있을 뿐만 아니라, ...에 이용될 가능성 또한 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 고효율 RNAi 스크리닝을 활용하여 바이러스 감염에 관여하는 숙주 인자를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 384-웰 플레이트에서 RNAi를 통해 관심 유전자를 결핍시킴으로써 수행됩니다. 그다음, 세포에 관심 바이러스를 감염시킨 후 바이러스 단백질을 염색하고 면역형광 현미경으로 바이러스 감염 여부를 측정합니다.마지막으로, 검증 및 추가 연구를 위한 후보 유전자를 식별하기 위해 자동화된 이미지 분석을 수행합니다. 궁극적으로, 면역형광현미경을 사용하여 감염된 세포의 비율을 정량화함으로써 감염의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이를 통해 바이러스 감염에 관여하는 새로운 세포 인자를 발견할 수 있습니다.이 방법은 바이러스와 숙주의 상호작용에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 관심 있는 세포 과정의 시각적 판독 결과가 유용한 모든 시스템 연구에도 적용될 수 있습니다. 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 가파른 학습 곡선을 예상해야 하는데, 이는 변동성을 최소화하면서 재현성 있는 감염을 달성하기 위해 상당한 최적화가 필요하기 때문입니다. 결과의 재현성을 보장하기 위해, 전체 스크리닝에 사용되는 각 시약의 로트 번호를 하나로 통일하여 사용하는 것이 필수적입니다. S 2D RSC 초파리 세포를 25 °C의 Schneider's medium 완결 배지에서 배양하며, 세포는 대수 성장기에 있어야 합니다.층류 후드(laminar flow hood) 내에서 실험을 수행할 경우, 강한 피펫팅을 통해 플라스크에서 반부착 세포를 떼어냅니다. 혈구계수기(hemocytometer)로 세포 수를 측정한 후, 실험에 필요한 세포 양의 125%를 50 mL 원추형 튜브로 옮겨 300 G에서 5분간 원심분리하여 펠렛(pellet)을 형성합니다. 상층액을 흡입하여 제거하고, 혈청이 없는 Schneider's medium을 사용하여 펠렛을 최종 농도 1.7 × 10⁶ cells/mL로 재부유시킵니다.멸균 및 프라이밍 처리가 된 자동 액체 핸들링 시스템을 사용하십시오. 여기서는 플레이트 간 변동성을 최소화하기 위해 matrix well mate를 사용합니다. 250 ng/well의 이중 가닥 RNA가 미리 코팅된 384-well 플레이트의 각 웰에 10 µL의 세포 현탁액을 추가하십시오. 300 ×g에서 1분 동안 플레이트에 세포를 원심 분리하십시오.플레이트를 25 °C에서 45분 동안 배양합니다. 각 웰에 complete Schneider's medium 20 µL를 추가합니다. 증발 영향을 최소화하기 위해 300 ×g에서 1분 동안 배지를 스핀 다운합니다.플레이트와 물에 적신 페이퍼 타월을 깔고 밀폐한 가습 컨테이너에 보관하십시오. BSL 2 생물안전 작업대 내에서 25 °C로 3일 동안 배양하여 강력한 넉다운 효과가 나타나도록 합니다. 세포에 감염시키기 전, 조제된 vaccinia virus 스톡을 0.8 micron 시린지 필터로 여과하십시오.세포 파편을 제거하기 위해, 바이러스를 2% serum이 함유된 Schneider's medium으로 희석하여 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)를 2로 맞춥니다.튜브에 기포가 없을 때까지 멸균된 웰 메이트를 희석된 바이러스로 채웁니다. 진공 매니폴드가 연결된 멸균 멀티채널 흡입기를 사용하여, 이중 가닥 RNA 처리된 초파리 세포 플레이트에서 배지를 조심스럽게 제거합니다. 각 플레이트에 희석된 바이러스 30 µL를 분주합니다.플레이트를 300 G에서 1분 동안 원심 분리합니다. 플레이트를 가습 컨테이너로 다시 옮겨 25 °C에서 48시간 동안 배양합니다. BSL 2 생물안전작업대 내에서 플레이트의 배지를 흡입하여 제거합니다.그런 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 각 플레이트에 15 µL의 4% formaldehyde 고정액을 첨가합니다. 상온에서 15분 동안 배양합니다. 멀티채널 흡입기로 액체를 제거합니다.WELLMADE를 사용하여 각 웰에 PBST 30 µL를 추가합니다. 상온에서 10분 동안 배양합니다. 동일한 방식으로 두 번째 PBST 세척을 10분 동안 수행합니다.인큐베이션 블록 이후의 액체를 제거하고 2% VSA 블로킹 용액이 포함된 PBST 30 µL를 첨가합니다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션합니다. 멀티채널 리피트 피펫을 사용하여 블로킹 용액에 희석한 1차 항체 15 µL를 각각 첨가합니다.플레이트를 300 G에서 1분 동안 원심 분리합니다. 각 플레이트를 투명 실링 필름으로 밀봉하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 웰 메이트(well mate)와 멀티 채널 흡입기를 사용하여 PBST로 세포를 3회 세척하며, 각 세척 단계는 10분 동안 진행합니다.멀티채널 피펫을 사용하여 형광 표지된 2차 항체와 핵 염색 시약을 각 웰에 15 µL씩 첨가합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 웰을 덮고, 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 PBST로 각 10분씩 3회 세포를 세척합니다.세포에 30 µL의 PBST를 추가하고 투명 실링 필름으로 밀봉합니다. 필름 위에 알루미늄 호일로 덮어줍니다. 밀봉된 플레이트를 4 °C에서 최대 3주 동안 보관한 후 자동 현미경으로 이미징합니다.감염되지 않은 웰에서는 백시니아 바이러스 단백질에 대한 염색이 나타나지 않는 반면, 대표적인 감염 웰에는 면역형광현미경으로 측정한 결과 백시니아가 발현된 beta GCSEs 단백질에 대해 양성 반응을 보이는 세포들이 포함되어 있습니다. 자동 이미지 분석 소프트웨어는 사용자가 설정한 파라미터를 사용하여 각 이미지의 감염 정도를 정량화합니다.대표 이미지에서, 국소 배경 이상의 크기와 염색 강도를 기준으로 세포핵의 총 개수와 바이러스 항원을 발현하는 세포의 수를 측정합니다. thread의 염색 넉다운은 표적 유전자의 강력한 RNAi 고갈을 확인하기 위한 양성 대조군으로 사용됩니다. 이 항-세포사멸 인자의 넉다운은 급격한 세포 사멸을 유도합니다.luciferase의 녹다운은 이중 가닥 RNA 처리가 감염에 미치는 영향에 대한 음성 대조군 역할을 합니다. luciferase의 결핍은 처리하지 않은 세포와 비교하여 감염에 영향을 주지 않습니다. beta galacto 단백질의 녹다운은 감염 감소에 대한 양성 대조군 역할을 합니다.본 분석법은 베타 갈락토 단백질 수치를 감염의 판독 지표로 사용하므로, 베타 갈락토가 고갈되면 감염된 세포의 비율이 감소합니다. 세포 인자인 RAB five를 넉다운시키면 감염된 세포의 비율이 감소합니다. RAB five는 엔도사이토시스에 관여하는 것으로 알려져 있으므로, 이 인자가 백시니아 바이러스의 진입에 기여할 가능성이 높습니다.이 영상을 시청한 후, 귀하는 RNAi 수행, vaccinia virus 감염, 염색 이미지 촬영 및 384-well 플레이트 분석을 포함하여 바이러스 감염에 기여하는 호스트 인자를 식별하기 위해 drosophila에서 RNAi 스크리닝을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. DIA 바이러스를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험복과 보호 안경을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 활성 바이러스는 반드시 BSL 2 생물 안전 작업대 내에서만 개봉해야 하며, 활성 바이러스와 접촉한 모든 물건은 폐기 전 10% 표백제로 멸균 처리해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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이 비디오에서는 양성 감각의 단일 가닥 RNA 바이러스를 성인 수컷 초파리에 나노 주입하는 절차를 설명하고 이후 감염으로 인해 시작된 항바이러스 반응을 연구합니다. 중합효소 연쇄 반응 분석은 RNA 간섭 및 JAK/STAT 신호 전달을 포함한 면역 반응 경로의 활성화를 나타내는 감염된 파리의 특정 유전자의 상향 조절을 식별합니다.

성충 파리의 숙주-바이러스 상호작용을 연구하기 위한 흉곽내 바이러스 나노 주사

이 책의 목적은 시각화 및 초파리에서 추출한 RNA에 향상된 북부 얼룩 프로토콜의 동작 단계를 논의 배아, 세포 및 조직을 melanogaster하는 것입니다. 이 프로토콜은 작은 RNA 종의 효율적인 검출에 특히 유용하다.

작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된 초파리 Melanogaster

여기 우리는 프로토콜 설명 높은 처리량 RNAi 심사 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 폭로를 위한, 특히 rhabodvirus 및 vaccinia 바이러스 치료, 하지만 그것은 다른 oncolytic 쉽게 적용할 수 있습니다 바이러스 플랫폼 또는 변조 바이러스 복제를 일반적으로 호스트 유전자 발견.

RNAi 게놈 넓은 검사 Oncolytic 바이러스 치료 변조 호스트 요소를 식별 하

이 메서드는 3 차원 (3D) 모델 곤충 세포로 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 보여 줍니다. 초파리 애벌레에서 hemocytes 바이러스 성 또는 세균성 병원 체, ex vivo 또는 vivo에서감염 되었습니다. 감염 된 hemocytes 다음 고정 되었고 confocal 현미경 및 후속 3D 셀룰러 재건 이미징 스테인드.

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

여기, 선물이 arbovirus 복제 및 arbovirus 복제를 제한 하는 2) 진 핵 호스트 요인 1) 바이러스 인코딩된 immunomodulators 식별 프로토콜. 이러한 형광 및 발광 기반 방법을 빠르게 낮은 신호 대 잡음 비율 단순한 분석에 arbovirus 복제의 양적 정보를 연구 수 있습니다.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

이 프로토콜 우리가 표준화 하 고 몇 년 동안 모기와 집 파리의 hemolymph를 직접 핵 산의 특정 수량을 제공 하는 데 사용 하는 microinjection 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 최소 주입 죽음 귀착되 고 통치의 복용량 상관 측정을 허용 한다.

재현할 수 dsRNA Microinjection 및 산란 검정 집 파리 모기에

이 프로토콜에는 vivo에서 바이러스 감염 초파리 melanogaster 나노 주입 방법 기본적인 기법을 사용 하 여 바이러스-호스트 상호 작용을 분석 하에 설정 하는 방법을 설명 합니다.

바이러스 성 감염 및 초파리 Melanogaster 상호 작용 호스트-바이러스의 분석의 설립

이 프로토콜에서는 성인 초파리 melanogaster 식 인식 및 미생물 감염의 계량에서 vivo에서 먹어서 분석 결과를 설명 합니다.

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우리는 Drosophila melanogaster에있는 신경 변성을 전시하는 돌연변이를 위한 스크린에 전방 유전 접근을 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 그것은 궁극적으로 신경 보호의 프로세스와 관련있는 새로운 유전자를 확인하기 위하여 등반 분석, 기관학 분석, 유전자 매핑 및 DNA 순서를 통합합니다.

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에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두 바이러스 감염 Drosophila* 전지*

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