에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두 바이러스 감염 Drosophila 전지

이 절차의 전반적인 목표는 고처리량 RNAI 스크리닝을 활용하여 바이러스 감염과 관련된 숙주 요인을 식별하는 것입니다. 이것은 384개의 웰 플레이트에서 RNAI에 의해 관심 유전자를 먼저 고갈시킴으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포에 바이러스 단백질에 대한 관심 바이러스 염색을 유도하고 면역형광 현미경으로 바이러스 감염을 측정합니다.

마지막으로, 검증 및 추가 연구를 위한 후보 유전자를 식별하기 위해 자동화된 이미지 분석이 수행됩니다. 궁극적으로 면역형광 현미경을 사용하여 감염된 세포의 비율을 정량화하여 감염의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이를 통해 바이러스 감염과 관련된 새로운 세포 인자를 발견할 수 있습니다.

이 방법은 바이러스 숙주 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 관심 있는 세포 과정에 대한 시각적 판독을 사용하여 이점을 얻을 수 있는 모든 시스템의 연구에도 적용할 수 있습니다. 이 방법을 처음 접하는 개인은 변동성을 최소화하면서 재현 가능한 감염을 달성하려면 상당한 최적화가 필요하기 때문에 가파른 학습 곡선을 예상해야 합니다.결과의 재현성을 보장하려면 전체 스크린에 사용되는 각 시약에 대해 단일 로트 번호를 사용하는 것이 필수적입니다. S 2D RSC 초파리 세포를 성장시키고 섭씨 25도에서 Schneider's medium을 완성한 세포는 로그 단계에 있어야 합니다.

층류 후드에서의 실험을 위해 엄격한 피펫팅을 통해 플라스크에서 반부착 세포를 제거합니다. 혈구 분석기를 사용하여 실험에 필요한 세포의 125%를 300G에서 5분 동안 50ml 원추형 튜브 펠릿으로 이동합니다. 수퍼 네임 펠릿을 1.7 곱하기 10의 최종 농도에서 무혈청 슈나이더 배지의 밀리리터당 6개 세포에 다시 현탁시킵니다.

멸균 및 프라이밍된 자동 액체 취급 시스템을 사용하십시오. 여기서 매트릭스 웰은 플레이트 변동성을 최소화하기 위해 짝을 이룹니다. 384 웰 플레이트 pre Eloqua의 각 웰에 10마이크로리터의 세포 현탁액을 300G의 플레이트에 1분 동안 이중 가닥 RNA 스핀 세포 웰당 250나노그램으로 추가합니다.

플레이트를 섭씨 25도에서 45분 동안 배양합니다. 각각에 20마이크로리터의 완전한 Schneider's 배지를 추가합니다. 증발의 영향을 최소화하기 위해 300G에서 1분 동안 매체를 잘 회전시킵니다.

접시와 가습된 밀봉 용기에 물을 적신 종이 타월을 깔아 보관하십시오. 섭씨 25도에서 3일 동안 배양하여 BSL 2 생물 안전 작업대에서 강력한 녹다운 효과를 얻을 수 있습니다. 세포를 감염시키기 전에 0.8 미크론 주사기 필터를 통해 조잡한 백시니아 바이러스 스톡을 걸러냅니다.

세포 파편을 제거합니다. Schneider의 배지에 있는 바이러스를 2%혈청으로 희석하여 감염의 다양성을 얻습니다. 두 소수의 약식 MOI.

멸균된 웰름은 튜브에 기포가 없어질 때까지 희석된 바이러스와 짝을 이룹니다. 진공 매니폴드가 있는 멸균된 다중 채널 흡인기(sterilized multichannel aspirator)를 사용하여 이중 가닥 RNA 처리된 초파리 세포의 플레이트에서 배지를 부드럽게 제거합니다. 30마이크로리터의 희석된 바이러스를 각 플레이트에 분배합니다.

플레이트를 300G에서 1분 동안 잘 원심분리합니다. 플레이트를 가습 용기에 다시 넣고 섭씨 25도에서 48시간 동안 배양합니다. BSL에서는 두 개의 생물 안전 캐비닛이 플레이트에서 매체를 흡입합니다.

그런 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 각 플레이트에 15마이크로리터의 4% 포름알데히드 고정물을 추가합니다. 실온에서 15분 동안 잘 배양합니다. 다중 채널 흡입기로 액체를 제거합니다.

WELLMADE를 사용하여 각각에 30마이크로리터의 PBST를 추가합니다. 실온에서 10분 동안 잘 배양합니다. 같은 방법으로 두 번째 10분 PBST 세척을 수행합니다.

배양 블록 후 액체를 제거하고 2%VSA 차단 용액으로 PBST 30마이크로리터를 제거합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다. 다중 채널 반복 피펫터를 사용하여 차단 용액으로 희석된 15마이크로리터의 1차 항체를 각각에 추가합니다.

300G에서 1분 동안 플레이트를 잘 돌립니다. 각 플레이트를 투명한 천장 필름으로 밀봉하고 밤새 섭씨 4도에서 배양합니다. 웰 메이트와 다중 채널 흡인기(multi-channel aspirator)를 사용하여 PBST에서 세포를 세척할 때마다 10분 동안 세 번 세척합니다.

다중 채널 피펫을 사용하여 핵 염색이 포함된 형광 표지된 2차 항체 15마이크로리터를 추가합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 잘 덮고 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 배양하십시오. PBST로 세포를 이전과 같이 3회 10분씩 세척합니다.

30마이크로리터의 PBST를 셀에 추가하고 투명한 천장으로 밀봉합니다. 호일로 필름과 덮개를 덮습니다. 밀봉된 플레이트를 섭씨 4도에서 최대 3주 동안 보관한 후 자동 현미경으로 이미징합니다.

감염되지 않은 웰은 백시니아 바이러스 단백질에 대한 염색을 나타내지 않는 반면, 대표적인 감염된 웰에는 세포가 포함되어 있습니다. 백시니아에 대한 염색 양성은 면역형광 현미경으로 측정한 베타 GCSE 단백질을 발현했습니다. 자동화된 이미지 분석 소프트웨어는 사용자가 설정한 매개변수를 사용하여 각 이미지의 감염을 정량화합니다.

대표적인 이미지에서, 세포 핵의 총 수와 바이러스 항원을 발현하는 세포의 수는 국소 배경 위의 염색의 크기와 강도에 따라 계산됩니다. 실의 염색 녹다운은 표적 유전자의 강력한 RNAi 고갈에 대한 양성 대조군 역할을 합니다. 이 항세포사멸 인자의 녹다운은 극적인 세포 사멸로 이어집니다.

루시퍼라제의 넉다운(knockdown)은 이중 연선의 효과에 대한 음의 대조군 역할을 합니다. 감염에 대한 RNA 치료: 루시페라아제의 고갈은 치료되지 않은 세포에 비해 감염에 영향을 미치지 않습니다. 베타 갈락토 단백질의 녹다운은 감염 감소를 위한 긍정적인 대조군 역할을 합니다.

이 분석은 베타 갈락토 단백질 수치를 감염 판독값으로 사용하기 때문에 베타 갈락토가 고갈되면 감염된 세포의 비율이 감소합니다. 세포 인자 RAB 5의 녹다운은 감염된 세포의 비율을 감소시킵니다. RAB 5는 세포내이입에 관여하는 것으로 알려져 있기 때문에 이 요인이 백시니아 바이러스 침투에 기여할 가능성이 높습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 RNAi 수행, 백시니아 바이러스 감염, 염색 이미징 및 384 분석을 포함하여 바이러스 감염에 기여하는 숙주 요인을 식별하기 위해 초파리에서 RNAi 스크리닝을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. Well Plates는 DIA 바이러스로 작업하는 것이 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험실 가운 및 보호 안경 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 살아있는 바이러스는 BSL 2 생물 안전 캐비닛에서만 열어야 하며, 살아있는 바이러스와 접촉하는 모든 것은 폐기하기 전에 10% 표백제로 살균해야 합니다.