의 식별을위한 1.5 시간 절차 Enterococcus 종

현장 하이브리드화 분석에서 형광 펩타이드 핵산 (PNA 물고기)를 사용하여 긍정적인 혈액 배양에서 Enterococcus faecalis와 다른 Enterococcus 종의 직접 확인을위한 신속한 프로토콜.

이 절차의 전반적인 목표는 펩타이드 핵산 형광 및 C 2 혼성화를 사용하여 양성 혈액 배양 병에서 엔테로코커스 종을 신속하게 식별하는 것입니다. 혈액 배양이 준비되고 장내구균 배양의 존재를 확인하기 위한 그램 테스트가 완료되면 샘플을 PNA 어류 현미경 슬라이드에 고정합니다. 그런 다음 슬라이드는 관심 유기체에 특이적인 PNA 프로브로 배양됩니다.

프로브가 혼성화되면 과도한 혼성화되지 않은 프로브를 제거하기 위해 엄격한 세척이 수행되었습니다. 장착 매체가 슬라이드에 추가되고 슬라이드 슬립으로 밀봉됩니다. 샘플에 존재하는 엔테로코커스 종은 형광 현미경으로 확인할 수 있습니다.

이 PNA 물고기 식별 프로토콜은 장구균과 마비를 식별하기 위한 빠르고 구체적인 방법을 제공한다는 점에서 독특합니다. 환자 혈액 배양 샘플: 패혈증이 의심되는 환자의 정맥혈이 들어 있는 호기성 병과 혐기성 병 2개를 섭씨 35도의 자동 혈액 배양 기기에서 배양합니다. 장치가 미생물 성장을 감지했다고 표시하면 병을 제거하고 혈액 배양 병을 부드럽게 휘젓어 박테리아를 고르게 재현탁시킵니다.

그런 다음 멸균 주사기와 바늘을 사용하여 각 병에서 약 5ml의 혈액을 별도의 나사 뚜껑 튜브로 무균 처리합니다. 모든 검체가 할당되면 멸균 피펫을 사용하여 각 튜브의 혈액 한 방울을 별도의 유리 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 슬라이드를 약 15분 동안 자연 건조시킵니다.

그런 다음 슬라이드가 완전히 건조된 후 슬라이드를 메탄올에 담궈 샘플을 고정합니다. 슬라이드를 고정한 후 세척하고 표준 그램 염색을 수행하여 각 혈액 배양에 존재하는 유기체의 형태를 결정합니다. 오일 이멀젼 대물렌즈가 있는 현미경을 사용하여 스테인 슬라이드를 검사합니다.

코커스에 들어가면 종은 일반적으로 쌍 또는 짧은 사슬로 조립된 그람 양성 구균으로 나타납니다. 고정 용액 한 방울을 p와 물고기 현미경 슬라이드의 우물에 놓습니다. 검사할 혈액 배양 튜브를 부드럽게 혼합합니다.

그런 다음 10마이크로리터의 배양액을 한 방울의 고정 용액에 옮기고 위아래로 파이프를 연결하여 샘플을 유화합니다. 슬라이드를 섭씨 55도의 가열판에 20분 동안 올려 놓고 각 테스트의 얼룩을 고정합니다. 분석 품질 평가를 위해 positive 및 negative control 슬라이드를 포함해야 합니다.

e의 경우, 굳은살이 있는 대조군 슬라이드는 Van DX에서 구입하거나 참조 배양을 사용하여 준비할 수 있습니다. 도말이 준비되면 EFI 굳은살 O-E-P-N-A 한 방울을 혈액 배양 샘플이 들어 있는 웰과 양성 및 음성 대조군 웰에 놓습니다. 프로브 스톡 용액의 오염을 방지하려면 스포이드 병 팁이 혈액 도말에 닿지 않도록 하십시오.

샘플 위에 커버 슬립을 놓고 기포가 생성되지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 섭씨 55도의 가열 블록에서 슬라이드를 30분 동안 배양합니다. PNA가 배양 후 혼성화될 수 있도록 슬라이드를 슬라이드 캐리어에 놓습니다.

적재된 슬라이드 캐리어를 섭씨 55도의 예열 세척 용액이 들어 있는 염색 접시에 담그십시오. 샘플에서 여분의 PNA를 제거하고 버퍼의 슬라이드를 교반하거나 겸자를 사용하여 덮개를 부드럽게 밀어 넣습니다. 섭씨 55도의 세척 용액에서 슬라이드를 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 염색 접시에서 슬라이드를 제거하고 자연 건조시킵니다. 슬라이드가 건조되면 실온 장착 매체 한 방울을 슬라이드에 추가하고 샘플에 커버 슬립을 조심스럽게 놓습니다. 준비 후 2시간 이내에 이중 밴드 필터를 사용하여 형광 현미경의 슬라이드를 검사합니다.

이 방법을 사용하면 왼쪽의 녹색으로 표시된 iffy, callous를 빨간색의 eum과 구별할 수 있습니다. 맨 오른쪽의 중간 패널에는 부정적인 결과가 있습니다. 성공적인 결과를 얻기 위해 기억해야 할 세 가지 사항은 기기 온도를 설정 온도로 유지해야 한다는 것입니다.

패키지 삽입물에 설명된 대로 얼룩 절차를 매우 면밀히 따라야 합니다. 마지막으로, 경험이 풍부하고 슬라이드를 철저히 읽는 독자가 있어야 합니다. 이 프로토콜은 장구균으로 인한 패혈증 치료를 위한 치료 결정을 내리는 데 유용합니다.

지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.