의 식별을위한 1.5 시간 절차 Enterococcus 종

이 절차의 전반적인 목표는 펩타이드 핵산 형광 및 C2 하이브리드화 기술을 사용하여 양성 혈액 배양 병에서 Enterococcus 종을 신속하게 식별하는 것입니다. 혈액 배양이 준비되고 그램 염색 테스트를 통해 Enterococci 배양의 존재가 확인되면, 시료를 PNA FISH 현미경 슬라이드에 고정합니다. 그런 다음 슬라이드를 표적 유기체에 특이적인 PNA 프로브와 함께 배양합니다.

프로브의 하이브리드화가 완료되면, 하이브리드화되지 않은 과잉 프로브를 제거하기 위해 엄격한 세척 과정을 수행합니다. 슬라이드에 마운팅 용액을 첨가한 후 커버 슬립으로 밀봉합니다. 이후 형광 현미경을 통해 시료에 존재하는 enterococcus 종을 식별할 수 있습니다.

이 PNA Fish 식별 프로토콜은 혈액에서 enterococcus를 식별하기 위한 신속하고 특이적인 방법을 제공한다는 점에서 독특합니다. 패혈증이 의심되는 환자의 정맥혈이 담긴 두 개의 혈액 배양 병(호기성 1개, 혐기성 1개)을 자동 혈액 배양 장치에서 35 °C로 배양합니다. 장치에서 미생물 성장이 감지되었음을 알리면, 병을 꺼내어 혈액 배양 병을 부드럽게 회전시켜 박테리아를 균일하게 재현탁합니다.

그 다음, 멸균된 주사기와 바늘을 사용하여 각 병에서 약 5 mL의 혈액을 각각의 스크류 캡 튜브로 무균적으로 옮깁니다. 모든 검체가 분배되면, 멸균 피펫을 사용하여 각 튜브의 혈액 한 방울을 각각의 유리 현미경 슬라이드 위에 떨어뜨립니다. 슬라이드를 약 15분 동안 공기 중에서 건조시킵니다.

그런 다음 슬라이드가 완전히 마르면, 슬라이드를 메탄올에 담가 시료를 고정합니다. 슬라이드 고정이 완료되면, 세척 후 표준 그람 염색을 수행하여 각 혈액 배양액에 존재하는 미생물의 형태를 확인합니다. 유침 렌즈가 장착된 현미경을 사용하여 염색된 슬라이드를 관찰합니다.

분리된 균종은 일반적으로 쌍 또는 짧은 사슬 형태로 배열된 그람 양성 구균으로 나타납니다. p 및 a fish 현미경 슬라이드의 웰에 고정액 한 방울을 넣습니다. 테스트할 혈액 배양 튜브를 부드럽게 혼합합니다.

그런 다음 10 µL의 배양액을 고정액 방울 위로 옮기고, 피펫팅을 통해 샘플을 유화합니다. 슬라이드를 55 °C의 가열판 위에 20분 동안 두어 각 테스트의 도말물을 고정합니다. 분석 품질 평가를 위해 양성 및 음성 대조군 슬라이드를 반드시 포함하십시오.

대조군으로 사용할 callous 슬라이드를 Van DX에서 구입하거나 표준 균주를 사용하여 준비할 수 있습니다. 도말 표본이 준비되면, 혈액 배양 샘플이 포함된 웰과 양성 및 음성 대조군 웰에 EFI callous O-E-P-N-A 한 방울을 떨어뜨립니다. 프로브 스톡 용액의 오염을 방지하기 위해, 드롭퍼 병의 팁이 혈액 도말 표면에 닿지 않도록 주의하십시오.

기포가 생기지 않도록 주의하며 샘플 위에 커버 슬립을 덮습니다. 그런 다음 가열 블록에서 55 °C로 30분 동안 슬라이드를 배양합니다. 배양 후 PNA가 하이브리드화될 수 있도록 슬라이드를 슬라이드 보관함에 넣습니다.

시료가 로딩된 슬라이드 캐리어를 55 °C로 예열된 세척 용액(Wash Solution)이 담긴 염색 접시에 담급니다. 버퍼 내에서 슬라이드를 흔들거나 핀셋을 사용하여 샘플에서 과잉 PNA를 제거하고 커버슬립을 조심스럽게 벗겨냅니다. 슬라이드를 세척 용액에 넣고 55 °C에서 30분 동안 배양합니다.

그 다음 염색 용기에서 슬라이드를 꺼내어 공기 중에서 건조시킵니다. 슬라이드가 마르면 실온의 봉입제를 한 방울 떨어뜨리고 샘플 위에 커버 슬립을 조심스럽게 덮습니다. 준비 후 2시간 이내에 듀얼 밴드 필터가 장착된 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다.

이 방법을 사용하면, 왼쪽의 녹색으로 표시된 iffy, callous를 적색의 eum과 구별할 수 있습니다. 맨 오른쪽 가운데 패널은 음성 결과입니다. 성공적인 결과를 얻기 위해 기억해야 할 세 가지 사항 중 하나는 기기 온도를 설정 온도대로 유지해야 한다는 것입니다.

패키지 삽입물에 설명된 대로 염색 절차를 매우 엄격하게 준수해야 합니다. 마지막으로, 슬라이드를 철저하게 판독할 수 있는 경험 많은 판독자가 필요합니다. 이 프로토콜은 Enterococcus에 의해 발생한 패혈증 치료를 위한 치료 결정 내리는 데 유용합니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.