탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

이 절차의 전반적인 목표는 제대혈에서 전구체 B 세포의 부분 집합을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 밀도 구배 원심분리를 통해 제대혈에서 단핵 세포를 분리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 세포 표면 항원을 비오틴 접합 항체로 표지하여 나머지 비 B 세포를 자기적으로 고갈시킵니다.

다음으로, 분리된 B 세포는 CD 19, CD 34 및 CD 45 세포 표면 항원에 대한 항체로 형광 표지됩니다. 마지막 단계에서는 precursor B-cell subset을 복구하기 위해 유세포 분석법으로 세포를 분류합니다. 궁극적으로, 고품질 DNA와 RNA를 필요로 하는 다운스트림 분석에 활용하기 위해 충분한 수와 품질의 세포를 얻을 수 있습니다.

다른 방법에 비해 세포 분류 전략의 장점 중 하나는 유세포 분석기에 소요되는 시간이 적고 형광 항체가 3개에 불과하여 실험 비용이 크게 절감된다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 유세포 분석을 위해 제대혈 세포를 준비하는 데 사용할 수 있는 다양한 방법과 유세포 분석기 준비의 복잡성으로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법은 건강한 전구체 B 세포에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 T 세포와 같은 제대혈에 존재하는 다른 세포 유형이나 백혈병이나 림프종과 같은 조혈 세포와 관련된 질병 연구에도 적용할 수 있습니다.

이 방법의 시각적 시연은 세포 생존력을 극대화하고 오염 파편의 존재를 줄이는 방식으로 제대혈과 세포를 처리하는 데 필요한 적절한 기술을 설명하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 제대혈에서 단핵 세포를 분리하려면 먼저 제대혈 분취량 8ml를 DPBS 24ml로 희석합니다. 그런 다음 50ml 원뿔형 튜브에 15ml의 ALI 와트의 fipa plus 위에 희석된 각 혈액 혼합물을 천천히 겹쳐 놓고 층을 분리하도록 주의하십시오.

다음으로, G 400배, 섭씨 20도에서 40분 동안 혈액을 원심분리하는 동안 세포를 밀도 구배 라벨, 샘플 ID, 날짜 및 표에 설명된 기타 적절한 정보가 있는 7개의 5밀리리터 원형 바닥 튜브로 분리합니다. 분리 후, 단핵 세포는 플라즈마 fi opaque plus 계면에 남아 있는 반면, 과립구와 적혈구는 이제 단핵 세포층과의 접촉을 피하면서 상부 혈장층을 흡인하여 침전됩니다. 그런 다음 10ml 유리 피펫을 사용하여 50ml 튜브 중 3개에서 하나의 새로운 50ml 튜브로 단핵 세포층을 조심스럽게 수집합니다.

이 새로운 튜브를 PBS로 채우고 세포 현탁액을 부드럽게 혼합한 다음 300배 G 및 섭씨 20도에서 10분 동안 세포를 두 번 세척합니다. 첫 번째 세척 후 펠릿을 다시 현탁시키고 단일 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 두 번째 세척 후, 200 마이크로 리터의 PBS에 세포 펠릿을 부드럽게 현탁 시키고, 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에서 1 마이크로 리터의 PBS로 1 마이크로 현탁액을 전달합니다.

그런 다음 50 밀리리터 튜브의 세포를 더 많은 PBS로 세척한 후 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 완전히 제거합니다. 단핵 세포에서 B 세포를 분리하기 위해 먼저 Resus는 방금 세척된 펠릿을 섭씨 4도의 160마이크로리터에 현탁시킵니다. 새로 준비된 DGA E-D-T-A-P-B-S 버퍼.

그런 다음 40마이크로리터의 B-세포 분리 키트, bio ITIN 항체 칵테일을 세포 현탁액과 혼합합니다. 세포를 섭씨 4도에서 10분 동안 배양한 후 유리 항체를 섭씨 4도의 1밀리리터, 세포 1,000만 개당 E-D-T-A-P-B-S 버퍼로 씻어냅니다. 그런 다음 세포 펠릿을 섭씨 4도 E-D-T-A-P-B-S 버퍼 320마이크로리터에 재현탁합니다.

이제 80마이크로리터의 항 비오틴 마이크로비드를 섭씨 4도에서 15분 동안 배양한 후 세포 현탁액과 혼합합니다. 세포가 회전하는 동안 세포를 다시 씻으십시오. 최대 분리막의 자기장에 LS 컬럼을 놓고 컬럼을 통해 섭씨 4도의 E-D-T-A-P-B-S 버퍼 3ml를 떨어뜨립니다.

다음으로, 세척된 세포를 섭씨 4도의 500마이크로리터, E-D-T-A-P-B-S 버퍼에 최대 1억 개까지 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 컬럼에 피펫으로 삽입하여 50ml 원추형 튜브에서 컬럼을 통과하는 라벨링되지 않은 세포를 수집합니다. 원래 원뿔형 튜브의 벽에 섭씨 4도의 E-D-T-A-P-B-S 완충액 2ml를 한 번에 1ml씩 추가한 다음 잔류 세포 현탁액을 매번 컬럼에 부드럽게 혼합하고 피펫팅하여 모든 세포를 회수할 수 있도록 합니다.

마지막으로 라벨링되지 않은 세포가 들어 있는 원뿔형 튜브를 PBS로 채웁니다. 원심분리 후, 세포는 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 E-D-T-A-P-B-S 버퍼에 세포를 부드럽게 현탁시킵니다.

항체 라벨링을 시작합니다. 먼저 1마이크로리터의 세포 현탁액을 이전에 표지된 염색되지 않은 튜브로 옮기는 단계를 수행합니다. 튜브에 500마이크로리터의 E-D-T-A-P-B-S 버퍼를 넣고 얼음에 보관합니다.

모든 조명을 끈 다음 100만 개 세포당 CD 19, CD 34 및 CD 45 항체 각각 20마이크로리터를 나머지 세포 현탁액에 추가합니다. 잘 섞어 튜브를 실온에서 30분 동안 어두운 곳에 두십시오. 다음으로, 40마이크로리터의 항체 표지 세포 현탁액을 7개의 A a D 표지 튜브로 옮깁니다.

1ml의 PBS로 세포를 세척한 다음 100마이크로리터의 결합 완충액에 팔레트를 다시 현탁시킵니다. 이 세포에 7 μlit의 A a d 7 μl를 첨가 한 다음 세포가 7 개의 A a d로 표지되는 동안 실온에서 10 분 동안 암흑 속에서 배양하고 PBS로 항체 표지 된 세포의 튜브를 씻은 다음 항체 표지 세포를 세척 한 다음 펠릿을 500 마이크로 리터의 E-D-T-A-P-B-S 완충액에 재현탁시킵니다. 이제 항체 labeled cell suspension의 전체 부피를 CD 19 positive CD 34 positive CD 45 positive labeled tube로 옮깁니다.

추가로 1ml의 E-D-T-A-P-B-S 버퍼로 튜브를 헹구고 잔류 세포 현탁액을 CD 19 positive CD 34 positive CD 45 positive labeled tube로 옮깁니다. 마지막으로, 7개의 A a D 튜브에 300마이크로리터의 결합 완충액을 추가하여 MO flow XDP 유세포 분석기를 사용하여 세포를 분류합니다. 먼저 정렬을 위해 MO 흐름을 설정하고, 적절한 보상 제어를 실행한 다음, 이 그림과 같이 플롯을 포함하는 프로토콜을 만듭니다.

에어로졸 배출 시스템이 항상 작동 중인지 확인한 다음 염색되지 않은 샘플을 사용하여 전방 및 측면 산점도에 대한 전압 및 이득을 설정합니다. 음성 형광 집단을 식별합니다. 임계값을 1% 이하로 설정하여 파편이 포함된 DNA가 회수된 샘플을 오염시키지 않도록 합니다.

CD 19 positive CD 34 positive CD 45 positive 샘플의 약 50, 000 이벤트를 실행합니다. 방금 설명한 대로 게이팅 전략을 설정하려면 게이트가 없는 CD 19 positive CD 34 positive population을 측면 산점도 대 전방 산점도에 다시 게이팅합니다. 림프구 보행에 잠재적인 pro B 세포가 포함되도록 합니다.

이 샘플을 사용하여 7개의 a a d 염색에 대한 음성 형광 모집단도 설정할 수 있습니다. 다음으로, 7개의 a a d 샘플을 실행하여 샘플 생존도를 확인하고, 죽은 세포가 무차별적으로 염색되어 정렬 개체군을 오염시킬 수 있으므로 처음부터 95% 이상의 생존율을 가진 샘플에서 세포만 정렬합니다. 이제 개체군에 대해 수집하기 위해 정렬 결정을 설정합니다. CD 19 양성, CD 34 양성 CD 19 양성, CD 34 음수 CD 45, 낮음 CD 19 양수, CD 34 음수 CD 45 중간 및 CD 19 양수. CD 34 네거티브 CD 45 높음.

막힘을 방지하기 위해 모든 개체군의 분류 결정에 림프구 및 이중선 차별 게이트를 포함시킵니다. 분류 팁에서 분류 직전에 40미크론 셀 스트레이너를 통해 CD 19 positive CD 34 positive CD 45 positive 샘플을 필터링합니다. 그런 다음 PBS에 2%FBS로 코팅된 라벨이 붙은 채취 튜브를 얼음으로 채워진 튜브 홀더에 넣고 분류가 완료된 직후 세포를 적절한 채취 튜브에 분류합니다.

DNA를 추출하는 것은 샘플의 변이 세포의 성공에 중요한 역할을 하고 좋은 종류로 정렬합니다. 림프구 보행에는 높은 비율의 세포가 있습니다. 성공률이 좋은 샘플에는 낮은 수준의 오염 파편이 포함되어 있으며, 이는 게이트 림프구 집단의 아래와 왼쪽에 떨어지는 이벤트의 수가 적다는 것을 입증합니다.

성공률이 낮은 샘플에는 높은 수준의 오염 파편이 포함되어 있습니다. 불량한 표본은 이러한 사례가 현저하게 증가했음을 보여줍니다. 유동적으로 분류된 세포와 각 전구체 B-세포 하위 집합에서 분리된 후속 DNA는 다운스트림 분석을 수행할 수 있는 양과 질을 갖추고 있습니다.

우리는 일상적으로 Myra에서 이 DNA를 사용하여 메틸화된 DNA에서 농축한 DNA를 CD 19 양성 CD 34 양성 세포, CD 34 음성 CD 45 낮은 세포 CD 19 양성, CD 34 음성 CD 45 중간 세포 및 CD 19 양성 CD 34에서 분리했습니다. 음성 CD 45 높은 세포를 총 9분 동안 고온에서 초음파 처리하고, 컬럼 정제한 다음, 이 레인에 사이버 그린 핵산 겔 염색이 있는 1% aros 겔에서 시각화했습니다. 대조군 100 염기쌍 사다리는 또한 메틸화 DNA의 농축을 확인하기 위해 대조군 메틸화 SLC 25 A, 37 및 대조군 메틸화되지 않은 APC one 유전자와 함께 활성 모티프 방법 수집기 울트라 키트 PCR을 사용하여 Myra 이후에 실행되었습니다.

SLC 25의 더 높은 증폭. A 37은 전구체 B-세포 부분집합에서 메틸화된 DNA 농축을 확인한다.일단 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행된다면 10시간 내에 완료될 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안 세포를 매우 부드럽게 다루고 최적화된 양의 항체를 사용하여 오염 파편의 생성을 최소화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따르십시오.

차세대 염기서열분석(next generation sequencing)과 같은 다른 방법은 어떤 유전자가 메틸화되어 있는지, 전구체 B-세포 부분 집합(subsets of the precursor B cell subset)과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있습니다. 살아있는 인간 세포로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행할 때 항상 에어로졸 배출 시스템 실행과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.