Name: 탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: 배우세요 탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합을 분리하는 방법을. 밀도 구배 원심분리와 유세포 분석술을 사용하여 고품질 핵산을 확보하고 면역 발달 연구에 활용할 수 있습니다.

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1. 탯줄 혈액에서 Mononuclear 세포의 분리 <ol><li> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 95 ML 린스 버퍼 (1시 20분 희석) 5 ML 소 혈청 알부민 (BSA) 재고 솔루션을 버퍼 추가 준비합니다. 가스를 제거하다 버퍼과 얼음의 버퍼를 유지 중요 :. 가스를 제거하다에 실패 CD19을 분리 할 때 버퍼가 최적의 결과보다이 발생할 수 있습니다 + 거품 절연 열을 차단할 수 있습니다 B-세포 때문입니다. </li><li> 밀도 기울기 원심 분리 50 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. 탯줄 혈액을 처리하는 데 필요한 튜브의 수 (1 관 8 ML의 피를 처리 할 수​​)를 결정하고 각 튜브에 Ficoll-Paque PLUS 15 ML를 추가합니다. </li><li> 24 ML의 DPBS (1X)과 조심스럽게 층 50 ML 원뿔 튜브의 각 Ficoll-Paque PLUS 상단에 희석 코드 혈액 혼합물을 함께 탯줄 혈액 8 ML을 희석. 피와 Ficoll-Paque PLUS를 섞지 마십시오 중요 ​​:. 코드 혈액과 Ficoll-Paque PLUS의 혼합 방지하기 위해, 45도 각도로 관을 잡고레이어 혈액 혼합 천천히. </li><li> 20 ° C.에 40 분 400 XG에 원심 분리기 Mononuclear 세포 (MNC)은에 유지됩니다 플라스마 Ficoll-Paque PLUS 인터페이스 Ficoll-Paque PLUS의 삼투압에 높은 밀도로 인해 침전 과립 성 백혈구와 적혈구 반면. 샘플 ID, 날짜 및 다음과 같은 제 3 부에 사용되는 라벨 칠 5 ML 내내 아래로 튜브 : </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 관 </td><td> 상표 </td><td> 목적 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 흠없는 </td><td> 유동 세포 계측법 동안 정상화를위한 흠없는 세포 </td></tr><tr><td> 이 </td><td> 7AAD </td><td> 유동 세포 계측법 동안 생존을 확인하려면 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + </td><td> 정렬 될 셀을 포함 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> CD34 + / CD19를 수집하려면 +(후반 프로-B - 초 전 BI) 세포 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 낮은 45 </td><td> / CD19 낮은 + / CD45 (예정 BI) 세포 - CD34를 수집하려면 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 메드 </td><td> / CD19 + / CD45 메드 (예정 BII) 세포 - CD34를 수집하려면 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 고 45 </td><td> / CD19 + / CD45 고 (미숙 B) 세포 - CD34를 수집하려면 </td></tr></tbody></table> 코트 튜브 4, 5, 6, 7 2퍼센트 FBS로하고 얼음에있는 모든 튜브를 놓습니다. <ol start="5"><li> 주의 깊게 상위 플라즈마 층을 기음과 mononuclear 세포 층과의 접촉을 피하십시오. 10 ML 유리 피펫 사용하여, 신중하게 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 mononuclear 세포 레이어를 전송할 수 있습니다. 하나의 50 ML 튜브에 함께 셋 튜브에서 mononuclear 세포를 결합합니다. </li><li> PBS로 관을 채우기에서 10 분 300 XG에 부드럽게 혼합 원심 분리기20 ° C. 세포 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는을 자세히 대기음. 1X를 반복합니다. 첫 번째 세척 후 알약을 resuspend하고 단일 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 PBS 200 μl의 세포 펠렛을 resuspend. , 세포 현탁액 1 μl를 제거 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 PBS 1 ML에 추가하고 (원심 분리기에서 50 ML 세포 현탁액을 삽입 한 후 셀을 계산) 계산을 위해 따로 설정합니다. PBS로 관을 입력하고 혈소판을 제거하는 15 분을 위해 200 XG에 원심 분리기. 세포 펠렛을 방해하지 않으면 서 완전히 표면에 뜨는을 제거합니다. </li></ol> 2. 맥 분리를 사용하여 Mononuclear 세포에서 수정 된 B-세포 절연 <ol><li> 160 μl 추위 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼로 단계 1.7에서 펠렛을 Resuspend. </li><li> 40 μl B-CLL 비오틴 항체 칵테일을 추가합니다. 4 ° C.에 잘 섞어 10 분에 품다하는 피펫 </li><li> 세포를 씻으 - 1 ML 감기 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼 만 10 당 세포 (세포 뉴 추가mber 단계 1.7)에 결정하고 10 분 300 XG에 원심 분리기. 완전히 표면에 뜨는을 대기음 후 320 μl 추위 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼에있는 셀 펠렛을 resuspend. </li><li> 80 μl 방지 비오틴 MicroBeads을 추가, 4 ° C.에 잘 섞어 15 분에 품다 </li><li> 세포를 씻으 - 1 ML 추위 10 분 300 XG에서 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼 만 10 당 세포와 원심 분리기를 추가합니다. 감기에 500 μl (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼으로 1 억 명의 셀 Resuspend. 휴대폰 번호에 따라 크기 버퍼 볼륨입니다. </li><li> 원심 분리 (단계 2.5) 동안 맥 열 및 Mac 구분 기호를 준비합니다. 맥 구분의 자기장에 LS 열을 놓고, 차가운 3 ML (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼 열로를 추가하고 버퍼 칼럼을 통해 똑 할 수 있습니다. 를 통해 흐름을 잡아 소켓을 사용합니다. 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 항목 아래의 50 ML 원뿔 튜브를 놓고 열에 세포 현탁액을 피펫. 라벨이없는 세포 통해서을 똑 할 수 있도록 허용H는 열 및 50 ML 원뿔 튜브에. 중요 :이 항체 라벨과 셀 정렬에 사용되는 셀입니다. 을 통해 흐름을 폐기하지 마십시오. 단계 2.5에서의 모든 셀을 복구하려면, 원추형 튜브의 벽에 추위 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼의 추가 한 ML을 추가합니다. 부드럽게 섞어서 열에 남아있는 세포 현탁액을 피펫. 1X를 반복합니다. 열 통과 후 원뿔 튜브에 수집 된 라벨이없는 세포를 사용하여 2.8 단계로 진행합니다. </li><li> 10 분 300 XG에서 PBS와 원심 분리기와 라벨이없는 세포를 포함하는 원뿔 튜브를 입력합니다. 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는을 제거합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼 200 μl를 추가하고 부드럽게 세포를 resuspend. </li></ol> 3. 셀 정렬에 대한 항체 라벨링 및 준비 <ol><li> (단계 1.4) &quot;흠없는&quot;이라는 튜브에 세포 현탁액 및 장소 1 μl를 대기음. 500 μl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼를 추가하고 얼음에 튜브를 저장합니다. </li><li> 20 추가나머지 세포 현탁액에 백만 셀 당 각 항체의 μl (CD19, CD34 및 CD45). 잘 섞어서 RT에서 30 분 동안 어둠 속에서 튜브를 놓습니다. 불이 해제와 함께 CD 항체 2-4 빛에 민감한, 완료 단계입니다. </li><li> 항체와 부화의 30 분 후, 세포 현탁액의 40 μl를 기음과 &quot;7AAD&quot;이라는 튜브에 넣습니다. 2 분 500 XG에서 튜브와 원심 분리기로 1 ML PBS를 추가합니다. 표면에 뜨는를 제거하고 바인딩 버퍼 100 μl의 세포를 resuspend. 7AAD 7 μl (7 Aminoactinomycin D)를 추가하고 RT에서 10 분 동안 짙은 어둠 속 품다. 10 분 부화 단계를 완료 3.4 동안. </li><li> CD 항체가 표시된 남아있는 세포를 포함하는 관의 상단에 PBS를 추가합니다. 3 분 500 XG에 튜브를 원심 분리기. 표면에 뜨는을 제거, 500 μl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼를 추가하고 셀 펠렛을 resuspend. &quot;+ + +&quot;이라는 튜브에 세포 현탁액의 전체 볼륨을 전송합니다. 세포 현탁액의 모든 복구하려면&quot;+ + +&quot;표시 관에 50 ML 원뿔 튜브 및 전송에 DD는 추가 한 ML EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼. </li><li> 부화 후 (단계 3.3), 7AAD 튜브에 300 μl 바인딩 버퍼를 추가 할 수 있습니다. &quot;흠없는&quot;, &quot;7AAD&quot;와 &quot;+ + +&quot;샘플 &quot;34 +&quot;, &quot;45 낮은&quot;, &quot;45 메드&quot;와 &quot;45 고&quot;튜브는 유동 세포 계측법에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 4. MoFlo XDP 흐름 Cytometer를 사용하여 셀 정렬 <ol><li> 정렬에 대한 설정 MoFlo는 : 레이저를 정렬, 비말 스트림을 안정화, 드롭 지연을 결정합니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 Invitrogen ABC 마우스 구슬 키트를 (또는 이와 유사한 것)를 사용하여 단일 색상 보정 컨트롤을 준비합니다. 긍정적이든 부정적 인구의 최적 분리에 대한 형광 채널의 전압을 조정, 단일 색상 컨트롤을 실행합니다. 보상 계수를 설정하고 보상 매개 변수를 수집 프로토콜에를 적용 할 수 있습니다. 보상 계수에게 항체의 새 많은 취득 때마다 다시 설정합니다. </li><li> 그림 2와 같이 플롯 등의 프로토콜을 만듭니다. </li><li> , 흠없는 샘플을 실행 전압과 순방향 및 측면 분산을위한 게인을 설정하고 부정적인 형광 인구를 식별합니다. DNA 복구는 종류의 목표이기 때문에, 기준 액은 DNA 함유 파편 복구 샘플을 오염하지 않습니다 (≤ 1 %) 낮은 수 있도록 설정해야합니다. * 에어로졸 피난 시스템은 인간의 세포는 MoFlo에서 실행되는 생활을 항상 실행되고 있는지 확인합니다. </li><li> 게이팅 전략 (그림 2)를 설정합니다 + + + 샘플 (~ 50,000 이벤트)의 작은 나누어지는을 실행합니다. B-세포 progenitors은 B-세포를 성숙에 동일하게 분산하지 않으므로, 림프구 게이트 잠재적 인 프로-B 세포를 포함하기 위해 SSC 대 FSC 계획에 + / CD34 + 인구 ungated CD19을 backgate. 이 샘플에서도 7AAD에 대한 부정적인 형광 인구를 설정합니다. </li><li> 샘플 생존을 결정하는 7AAD 샘플을 실행합니다. 에서 높은 경쟁력있는 샘플에서 정렬 셀죽은 세포와 같은 초기은 (≥ 95 %) 무차별 착색하고 정렬 인구를 오염 할 수 있습니다. </li><li> 네 인구를 수집하기 위해 정렬 결정을 설정 : CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 낮은, CD19 + / CD34 - / CD45 의대, 그리고 CD19 + / CD34 - 고 / CD45. 모든 인구의 정렬 결정에 림프구와 쌍으로 된 것 차별 게이트를 포함합니다. </li><li> 정렬 팁에 나막신을 방지하기 위해 필터 + + 바로 정렬 및 집계는 정렬하는 동안 샘플에서 발생하는 경우 다시 필터 전에 40 μm 셀 스트레이너를 통해 + 샘플. </li><li> 냉각 또는 얼음 포장 튜브 홀더에 PBS에서 2퍼센트 FBS으로 코팅 수집 튜브 (단계 1.4)으로 세포를 정렬합니다. </li><li> 정렬이 완료 직후, DNA의 압축을 풉니 다. </li></ol>

<ol><li>Song, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+%28TDMs%29+with+differential+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression.</a> PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).</li>
<li>Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+The+DNA+methylation+profile+of+tissue-dependent+and+differentially+methylated+regions+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells.</a> Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).</li>
<li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequential+determination+model+of+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The sequential determination model of hematopoiesis.</a> Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).</li>
<li>Clark, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subsets+in+normal+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subsets in normal bone marrow.</a> Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).</li>
<li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow.+II.+Normal+B+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development.</a> Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).</li>
<li>Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+precursors+in+normal+pediatric+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">B-cell precursors in normal pediatric bone marrow.</a> American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).</li>
<li>Tucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+cord+blood+B+cells+functionally+mature%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Are cord blood B cells functionally mature?</a> Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).</li>
<li>Ghia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+of+human+bone+marrow+B+lymphocyte+precursors+by+single-cell+polymerase+chain+reaction+analyses+of+the+rearrangement+status+of+the+immunoglobulin+H+and+L+chain+gene+loci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci.</a> J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).</li>
<li>Noordzij, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+precursor+B-cell+compartment+in+bone+marrow+from+patients+with+X-linked+agammaglobulinemia+compared+with+healthy+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children.</a> Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).</li>
<li>van Zelm, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ig+gene+rearrangement+steps+are+initiated+in+early+human+precursor+B+cell+subsets+and+correlate+with+specific+transcription+factor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression.</a> J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).</li>
<li>Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIRA+method+for+DNA+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MIRA method for DNA methylation analysis.</a> Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).</li>
<li>Kanof, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).</li>
<li>LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+human+B-cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fates of human B-cell precursors.</a> Blood. 96 (1), 9-23 (2000).</li>
<li>Schmid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+society+for+analytical+cytology+biosafety+standard+for+sorting+of+unfixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells.</a> Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).</li>
<li>Malaspina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+immature%2Ftransitional+B+cells+in+HIV-infected+individuals+with+advanced+disease%3A+correlation+with+increased+IL-7%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7.</a> PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).</li>
</ol>

저자는 공개 할 수 없어요.

프로토콜의 성공에 가장 큰 영향 요인은 파편을 오염의 존재입니다. 코드 혈액 은행에서 혈액을 요청하는 경우에는 혈액이 빨리 수집 한 후 가능한 한 출하하는 것이 중요합니다. 또한, lymphocytosis으로 분류 된 샘플 림프구 높은 숫자를 포함하지만, 이러한 샘플 전구체 B-세포의 충분한 숫자가없는 사용하지 않아야합니다. 우리는 탯줄 혈액의 적어도 85 ML로 시작하는 것이 좋습니다 전구체 하위 집합 각각에 대해 세포의 충분한 숫자를 획득 확률을 증가 할 수 있습니다. 그것은 성인 말초 혈 분리는 달리, 탯줄 혈액을 fractionating 때 mononuclear 레이어가 종종 적혈구 12 오염이 오니, 이용에 참고하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 오염 혈소판을 제거 할 수있는 별도의 세척 단계가 포함되어 있습니다. 탯줄 혈액에서 mononuclear 분리를 설명하는 프로토콜은 용해 단계 t 등의 제안원치 않는 붉은 세포를 제거 O. 이 오염 파편을 생산하고 세포 종류의 성공에 부정적인 영향을 가지고 있기 때문에 우리는이 단계를하지 않는 것이 좋습니다. 유동 세포 계측법에 의해 구별 할 필요가 세포의 수를 줄이기 위해 그 전에 셀 정렬에 B-세포 농축을 수행 할 필요가 있습니다. B-셀 절연 키트 (B-CLL)을 함께 Miltenyi Biotec,에서 제공 프로토콜은 말초 혈에 대해 최적화되어 있으며 10,000,000 세포 당 10 μl B-CLL 비오틴 항체 칵테일을 사용하는 것이 좋습니다되었습니다. , CD4 (T 세포), CD11b (과립 성 백혈구, 단핵 세포, 대 식세포), CD16 (NK 세포, 대 식세포, 마스트 세포), CD36 (혈소판), CD235a (erythroid 세포),이 단계 CD2 (NK 세포 T 세포)에 대해 항체를 사용 탯줄 혈액에서 비-B 세포를 고갈합니다. 이 전 키트는 프로-B 세포에 존재하는 CD43에 대한 항체가 포함되어 있기 때문에 설명 된 키트가 아닌 B-세포 분리 키트 II를 사용하는 것이 중요합니다. 우리 조합 중이 프로토콜의 timization, 우리는 B-CLL 비오틴 항체 칵테일의 40 μl의 총 긍정적 인 셀 정렬 결과를 생산하기에 충분한 것으로 나타났습니다. 또한 우리는 B-CLL 비오틴 항체 칵테일의 최소 5와 μl 더를 사용하여 셀 정렬에 부정적 영향을 가지고있는 것으로 나타났습니다. 따라서, 우리는 고도의 175-250000000 사이의 총 mononuclear 세포 숫자를 B-CLL 비오틴 항체 칵테일의 40 μl를 사용하는 것이 좋습니다. 세포의 낮은 또는 높은 숫자로 시작하는 경우가 그에 따라 시약을 확장 할 필요가있을 수 있습니다. B-세포의 하위 인구 구별하는 데 사용할 수 있습니다 마커를 설명하는 수많은 충돌 간행물가 있습니다. 차이의 대부분은 차별화가 지속적 과정이며, 세포 표면 마커의 유무가 점진적 방식으로 대신 전부 또는 아무것도 방식으로 발생한다는 사실에 의해 설명 될 수있다. / CD19 + 및 CD45 + (의 강도 수준 -이 프로토콜 CD34에낮은) 높은, 중간 표현은 차별화 6의 진행에 해당하는 CD45 표현의 수준 증가와 함께 사전 BI, 사전 BII와 미숙 한 B-세포를 구별하는 데 사용되었다. 프로 B 세포는 CD19 할 몇 가지에 의해 설명 된 + / CD34 + 13 다른 프로-B 세포가 CD19 아르 것으로 나타났습니다 동안 - / CD34 + 및 사전 BI 세포가 CD19 + / CD34 + 9,10 있습니다. 이러한 불일치를 바탕으로 우리는 늦은 프로-B 세포 / 초 사전 BI 세포로 CD19 + / CD34 + 세포를 지정하고 있습니다. 그것은이 전략을 구체 질병 급성 lymphoblastic 백혈병에 의해 영향을 세포에 해당하는 B-세포의 일부를 분리하기 위해 개발 된 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 관심의 세포 하위 유형에 따라 사용될 수있다 여러 정렬 전략이 있습니다. 항체 - fluorochrome 조합은 사용 가능한 셀 정렬의 기능에 따라 선택해야합니다. 장군으로리터 규칙, 당신 패널의 밝은 fluorochrome은 적어도 인구가 항원과 반대의 라벨을 사용해야합니다. 특히 이중 스테인드 인구, 다음과 같은 희귀 한 이벤트를 감지에서 이중 어 차별 (그림 2B)는 게이팅 전략의 극히 중요한 부분입니다. 이것은 두 번 긍정적 인 이벤트가 항체와 서로 준수 단순히 두 개의 싱글 - 스테인드 세포 모두 물들 진정으로 하나의 세포 보장합니다. 고속, 4 방향 전지 정렬 반드시 통제 된 에어로졸 환경을 만듭니다. 따라서, 라이브 인간의 세포 정렬은 아주 조심 수행해야합니다. 게시 안전 및 오염 제거 지침은 가능하며 정렬 14 전에 검토하고 구현해야합니다. 기관 바이오위원회 또는 등가물의 승인을 분류하기 전에해야 할 수 있습니다. 정렬 후 적절한 정화를 들어, 표백제는 10 %의 최종 농도에 폐기물 컨테이너에 추가해야합니다. 시milarly, 모든 샘플 튜브뿐만 아니라이 지역의 모든 표면은 철저하게 갓 만든 10 % 표백제 용액으로 소독해야합니다. 요약이 프로토콜은 전구체 B-세포의 희귀 한 인구를위한 전략을 제공하며, 조혈 줄기 세포와 T-세포 미숙 등의 탯줄 혈액에 존재하는 희귀 한 인구를 분리하도록 수정 될 수 있습니다. 최근 미숙 한 B 세포는 고급 HIV 15 개인의 말초 혈에서 확인되었습니다. 따라서,이 방법의 유틸리티는 혈액 암의 연구 초과합니다. 마지막으로, 우리는 아직 흐름이 정렬 세포에서 RNA의 isolations를 수행하지 않은하지만,이 방법은 셀 동안 세포 RN​​easy 키트에서 trizol이나 RLT 등 상응하는 RNA 호환 솔루션에 직접 정렬해야 정렬한다는 점을 유의 적응해야합니다 Qiagen를 통해 사용할 수 있습니다.

질병에 존재 aberrations를 확인하기 위해, 우리가 건강한 조직 또는 질병에 의해 영향을 조직 또는 세포 유형에 해당하는 세포를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 이것에 대한 이유 중 하나는 조직 유형 간의 epigenetic 변화는 유전자 발현을 조절하기위한 책임이 있으며 정상적인 인간 개발 1,2 동안 세포 차별화에 중요합니다. 두 번째 이유는 비정상 조직 특정 유전자 조절은 정상 개발에 끔찍한 결과가 초래 될 수 있습니다 및 암 등의 질병 상태의 다수에 기여하는 것으로 알려져이다. 따라서, 조혈 세포를 포함 질병의 더 나은 이해가 건강한 조혈 세포에 대한 지식이 필요합니다. 세포 표면의 표현의 변경을 특징으로 사건의 체계적인 순서를 통해 골수 진행에 조혈 세포의 개발은 3 마커. 성인 참가자를 포함하는 연구가소아 참가자를 포함한 연구 전구체 B-세포의 비율이 덜 5 세 6 개인의 상대적으로 높은 것으로 나타났습니다 반면, 골수는 보통 B-세포 4,5 전구체의 낮은 번호를 포함 표시. 탯줄 혈액은 혈액 관련 질환과 malignancies의 치료에 조혈 줄기 세포의 원천으로 사용 탯줄 혈액 은행을 통해 쉽게 사용할 수 있으며 대상 백혈병 등의 여러 질환의 세포이며 미성숙 B와 T 세포 7 농축되어있다 lymphomas. 골수의 전구체 B-세포가 광범위하게 8,9를 phenotyped 된 독특한 하위 집합으로 셀을 정렬하는 데 사용할 수있는 특정 세포 표면 마커의 존재로 정의 할 수 있습니다. 일반 B-세포 분화의 초기 프로-B 세포로 시작하고 미숙 또는 순진한 B-세포에 culminating 골수의 단계 일련의를 통해 진행. 에 따르면반 Zelm 및 동료 10, 프로-B 세포는 CD34의 존재에 의해 무대 2의 전환 (사전 BI)에 CD19이 취득 특징을 가지고 있습니다. 3 단계 (사전 BII) 세포는 더 이상 CD34 Express 및 세포질 IgM을 표현하기 시작합니다. 마지막으로, 4 단계의 정의 특징은 (B-세포 미숙) 표면 IgM의 표현입니다. 이 프로토콜에 설명 된 정렬 전략이 처음 콜드웰 및 동료 6 설명과 크게 복잡성과 셀 정렬 실험을 수행 비용을 절감 불과 3 세포 표면 마커의 사용을 포함했다. 자신의 작품에서 CD45 사이의 관계와 B-세포 분화의 단계가 설립되었습니다. 그들은 골수에서 B-세포가 CD45의 표현의 변수 수준을 표시 관찰했다. 특히, CD45 높은 수준의 표현 세포 표면 IgM을 표명 세포 (미숙 한 B-세포)에 대응, CD45의 중간 수준을 표시하는 페이지는 cytopl을 표명 셀에 대응asmic IgM (예정 BII 세포) 및 CD45의 낮은 수준을 표시하는 페이지는 (예정 BI 세포) 세포질 IgM을 표현하지 않은 셀에 대응. 이 프로토콜은 methylated - 포장 소비재 섬의 복구 분석 등 고품질 핵산의 산을 필요로하는 다운 스트림 assays에서 사용할 수있는 탯줄 혈액 (그림 1)에서 B-세포 (MIRA 전구체의 일부를 분리 할 수 콜드웰 및 동료 6 개발 전략을 사용하여 ) 11 및 정량 실시간 PCR의 assays. 방법은 탯줄 혈액에서 모든 비-B 세포를 고갈에 자기 구슬을 사용하여 초기 분리 직원을 고용하고 있으며 단 3 항체 (CD34, CD19 및 CD45)와 얼룩 필요합니다. 복구하는 세포는 B-세포 분화의 4 단계를 나타냅니다 : 1) CD34 +; CD19 + (후반 프로-B 및 사전 BI 초), 2) CD34 -; CD19 +; CD45 낮은 (말 사전 BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 메드 (예정 BII) 및 4) CD34 -; CD19 +; CD45 높은 (미숙 한 B-세포).

<table><tbody><tr><td>DPBS (1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>LS Column</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multi Stand</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS 분리기</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>B-Cell Isolation Kit (B CLL)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-660</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATLANTA Biologicals</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 ml)</td><td>MIDSCI</td><td>SS1500</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555415</tr><tr><td>DB Pharmingen PE 마우스 Anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>560941</td><td></td></tr><tr><td>CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 헹굼 솔루션</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA 재고 솔루션</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 5 ml 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50ml 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>PuraFlow Sheath Fluid, 8X</td><td>Beckman Coulter</td><td>CY30230</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck 정렬 비드</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Rainbow 정렬 비드</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>ViroSafe 에어로졸 배출 필터</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML01330</td><td></td></tr><tr><td>ABC 마우스 비드 키트</td><td>Invitrogen</td><td>A-10344</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m 세포 여과기</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific 혈구계</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>accuSpin 모델 3R 탁상용 원심분리기</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-516</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP 유세포분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 배출 장치</td><td>벡크만 쿨터</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

탯줄 혈액에서 전구체 b-세포 하위 집합의 절연

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

탯줄 혈액은 매우 다른 계보 (Lineage) 헌신의 단계에서 조혈 전구 세포에 풍부합니다. 우리는 B-세포 분화의 네 가지 단계에서 전구체를 분리를위한 프로토콜을 개발했습니다. 유전자가 표현과 epigenetic 수정은 조직 특정 방식으로 발생되기 때문에,이 게놈과 질병의 발전으로 이어질 수 있습니다 epigenome의 변경을 식별 할 수하기 위해 조직 및 세포 유형 간의 차별하는 매우 중요합니다. 이 방법은 차별화의 단계에서 탯줄 혈액에서 세포 존재하는 모든 종류의에 적응 할 수 있습니다. 이 방법은 4 주 단계를 포함한다. 첫째, mononuclear 세포 밀도 원심 분리에 의해 구분됩니다. 둘째, B-세포 mononuclear 세포에서 비 B-세포를 인식하고 제거 비오틴 복합 항체를 사용하여 풍부하고 있습니다. 제 B-셀은 휘황 개별 단계에 해당 세포 표면 단백질 항체으로 분류됩니다B-세포 개발. 마지막으로, 휘황 레이블 셀이 정렬되어 있으며 각각의 인구가 복구됩니다. 복구 세포는 하류 핵산 assays에서 이용 될 수있는 충분한 수량과 품질입니다.

샘플 사이에 차이는 셀 정렬 (표 1)의 성공에 역할을합니다. 좋은 성공 속도로 샘플 오염 파편의 낮은 수준 (그림 3A)가 가난한 성공 속도로 샘플 오염 파편 높은 수준의 (그림 3B)가. 코드 혈액 샘플을 선적 24 시간 (O / N 우선) 내에서 수집 한 경우 샘플 사이에 변화가 다소 제어 할 수 있습니다. 각 전구체 B-세포 부분 집합의 흐름 정렬 전지는 충분한 수량과 핵산 isolations을 수행 할 품질입니다. 고립 된 DNA는 높은 품질이며, 하류 분석에 사용할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 methylated DNA (그림 4)에 대한 풍부 MIRA 11이 DNA를 사용합니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 탯줄 혈액 시설 데이터 </td><td> 나쁨 정렬 </td><td><st롱&gt; 좋은 정렬 </td></tr><tr><td> 항응고제와 협력 혈액 양 (ML) </td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td> 백혈구 [10 3 / μl] </td><td> 8.68 </td><td> 11.19 </td></tr><tr><td> 림프구 [10 3 / μl] </td><td> 3.88 </td><td> 3.76 </td></tr><tr><td> 림프구 (%) </td><td> 44.70 </td><td> 33.6 </td></tr><tr><td> 적혈구 [10 6 / μl] </td><td> 3.65 </td><td> 3.05 </td></tr><tr><td colspan="3"> 자체 데이터 </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque 후 휴대폰 번호 </td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> 맥 분리 후 휴대폰 번호 </td><td> 22 M </td><td> 16.5 M </td></tr><tr><td> 총 이벤트 수 카운트 (MoFlo XDP) </td><td> 30.57 M </td><td> 19.97 M </td></tr><tr><td> 생존 (%) </td><td> 98.00 </td><td> 98.00 </td></tr><tr><td> 림프구 게이트의 셀 (%) </TD&gt; <td> 17.00 </td><td> 50.00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td> 총 휴대폰 번호 </td><td> 10,959 </td><td> 48,316 </td></tr><tr><td> 총 이벤트 수 비율 (%) </td><td> 0.04 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> 능률 </td><td> 88% </td><td> 88% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - 낮은 / CD45 </td></tr><tr><td> 총 휴대폰 번호 </td><td> 16,619 </td><td> 26,941 </td></tr><tr><td> 총 이벤트 수 비율 (%) </td><td> 0.05 </td><td> 0.13 </td></tr><tr><td> 능률 </td><td> 89% </td><td> 87% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 메드 </td></tr><tr><td> 총 휴대폰 번호 </td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td> 총 이벤트 수 비율 (%) </td><td> 1.54 </td><td> 2.54 </td></tr><tr><td> 능률 </td><td> 89% </td><td> 89% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - 고 / CD45 </td></tr><tr><td> 총 휴대폰 번호 </td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td> 총 이벤트 수 비율 (%) </td><td> 6.2 </td><td> 10.25 </td></tr><tr><td> 능률 </td><td> 91% </td><td> 90% </td></tr></tbody></table> 표 1. 대표 셀 정렬 통계. 행 1-5 탯줄 혈액 시설에서 제공하는 중요합니다. 나머지 행은 우리의 연구실에서 데이터를 수집합니다. 가난한 정렬은 파편 높은 수준의와 림프구 게이트에서 세포의 낮은 비율이 포함되어 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> Figu1 다시. 절차의 흐름 차트입니다. 탯줄 혈액이 처리되고 mononuclear 세포는 Ficoll-paque 플러스를 사용하여 절연하고 있습니다. 추가 세척 단계는 오염 혈소판을 제거하는 포함되어 있습니다. B-세포는 맥 인간 B 세포 절연 키트 (B-CLL)를 사용하여 mononuclear 세포로부터 분리되어 있습니다. 이 단계는 모든 비-B 세포를 제거하는 (CD2, CD4, CD11b, CD36, 안티 IGE와 CD235a) 비오틴 - 복합 단클론 항체를 사용합니다. 복구 B-세포는 다음 전구체 B-세포 하위 집합을 복구 할 수있는 MoFlo XDP 흐름 cytometer를 사용 정렬 CD19-APC, CD34-PE 및 CD45-FITC 항체으로 분류됩니다 : CD19을 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 낮은 , CD19 + / CD34 - / CD45 의대, 그리고 CD19 + / CD34 - 고 / CD45. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> 그림 2. 팝업을 파악하고 분류 게이팅 전략ulations. 빨간색 화살표는 다음 플롯에 적용됩니다 게이트를 나타냅니다. R4, R5, R6 및 R7 문은 정렬 인구를 나타냅니다.) 앞으로 대 강화 림프구 인구를 보여주는 사이드 분산 형 플롯. R1, 림프구 게이트. b)는 높이 대 단일 세포 대 doublets를 식별하기 위해 앞으로 분산 형 플롯의 너비. R2, 단일 셀 게이트. C) CD19-APC 긍정적 인 세포는 CD34-PE 부정적 및 긍정적 인 인구로 나눌 수 있습니다. R3, CD19 + / CD34 - 게이트, R4, CD19 + / CD34 + 게이트 나타내는 원하는 정렬 인구 D) CD19 + / CD34 - 세포 세 다소 독특한 CD45-FITC 인구로 나눌 수 있습니다.. R5 및 R6, CD19 + / CD34 - / CD45 낮은 CD19 + / CD34 - / CD45 의대 인구, 각각. R7은 때문에 CD19 + / CD34 높은 세포 숫자 - 높은 인구 / CD45, 이러한 종류의 게이트 만 포함인구의 부분입니다. 이 인구의 모든 세포는 하류 분석을 위해 수집 할 필요가 없습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> 그림 3.) 항목을 농축 한 후 파편을 오염 낮은 수준. R1, 림프구 게이트. b)는 열 농축 한 후 파편을 오염 높은 수준의. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> 4 그림. 전구체 B-세포의 하위 집합에서 methylated DNA의 농축이 있습니다. 전구체 B-세포 하위 집합에서 격리) Sonicated DNA는 높은 품질입니다. 도서관 건설 DNA를 들어 200-600 BP의 평균 sonicated 수 있습니다. 레인 1 : Promega 100 BP의 사다리 (카탈로그 # G2101), 차선 2 : 격리 총 DNA CD19에서 + / CD34 + 세포, 차선 3 : CD19로부터 격리 총 DNA + </s최대&gt; / CD34 - / CD45 낮은 세포, 차선 4 : CD19 + / CD34로부터 격리 100 NG DNA - / CD45 의대 세포, 차선 5 : CD19 + / CD34로부터 격리 100 NG DNA - / CD45 높은 세포. DNA는 9 분 (; 30 초 OFF ON 30 초)의 총 고등학교에 Diagenode의 Bioruptor를 사용하여 sonicated되었습니다. DNA는 열 정화이고 SYBR 녹색 핵산 젤 얼룩과 1 % 아가로 오스 겔에 시각화. B) MIRA는 ActivMotif MethylCollector 울트라 키트, SLC25A37과 PCR (1-6)와 APC1 (7-12)를 사용 후는 확인을 위해 수행됩니다 methylated DNA의 농축. 1 &amp; 7 : Sonicated 게놈의 DNA (NO MIRA), 2 및 8 : MIRA-CD19 + / CD34 + DNA, 3 &amp; 9 : MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 낮은 DNA, 4 &amp; 10 : MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 의대 DNA, 5 &amp; 11 : MIRA - CD19 + / CD34 - / CD45 높은 DNA, 6 &amp; 12 : 물 제어 할 수 있습니다. SLC25A37 높은 증폭는 methylated DNA의 농축을 확인전구체 B-세포의 하위 집합 인치

여기 탯줄 혈액에서 전구체의 하위 집합 B-세포를 분리에 대한 프로토콜을 설명합니다. 핵산의 충분한 수량과 품질은 세포에서 추출되어 DNA 또는 RNA를 이용 후속 assays에 사용 될 수 있습니다.

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

본 절차의 전반적인 목표는 제대혈에서 전구 B 세포의 하위 집단을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 밀도 구배 원심분리를 통해 제대혈에서 단핵 세포를 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 세포 표면 항원을 비오틴 결합 항체로 표지하여 남아 있는 비 B 세포들을 자기적으로 제거합니다.다음으로, 분리된 B 세포를 CD 19, CD 34 및 CD 45 세포 표면 항원에 대한 항체로 형광 표지합니다. 마지막 단계에서는 유세포 분석기를 이용해 세포를 분류하여 전구 B 세포 하위 집단을 회수합니다. 최종적으로, 고품질의 DNA와 RNA가 필요한 후속 분석에 활용할 수 있을 만큼 충분한 수와 품질의 세포를 확보할 수 있습니다.다른 방법들에 비해 세포 분리 전략이 갖는 한 가지 장점은 유세포 분석기 사용 시간이 적게 소요되고 단 세 가지의 형광 항체만 필요하므로 실험 비용을 크게 절감할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 유세포 분석을 위한 제대혈 세포 준비 방법의 다양성과 유세포 분석기 설정의 복잡함으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 방법은 건강한 전구 B 세포에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, T 세포와 같이 제대혈에 존재하는 다른 세포 유형이나 백혈병 또는 림프종과 같이 모든 조혈 세포와 관련된 질병 연구에도 적용될 수 있습니다.제대혈 및 세포 처리 과정에서 세포 생존율을 최대화하고 오염성 잔해물의 존재를 줄이는 데 필요한 적절한 기술을 설명하기 어렵기 때문에, 본 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 제대혈에서 단핵 세포를 분리하려면, 먼저 제대혈 8 mL 분주액을 DPBS 24 mL로 희석하십시오. 그 다음, 층이 섞이지 않도록 주의하며 50 mL 원추형 튜브에 담긴 Ficoll-Paque 15 mL 분주액 위에 희석된 혈액 혼합물을 천천히 층이 지도록 쌓으십시오.다음으로, 밀도 구배에 의해 세포가 분리되는 동안 혈액을 400 ×g, 20 °C에서 40 분 동안 원심 분리합니다. 표에 설명된 대로 50 mL 라운드 바텀 튜브 7개에 샘플 ID, 날짜 및 기타 적절한 정보를 표기합니다. 분리가 완료되면 단핵세포는 혈장과 불투명 층의 계면에 남게 되며, 과립구와 적혈구는 침전됩니다. 이제 단핵세포 층에 닿지 않도록 주의하며 상층의 혈장 층을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 10 mL 유리 피펫을 사용하여 50 mL 튜브 3개에서 단핵세포 층을 조심스럽게 수집하여 새로운 50 mL 튜브 하나에 모읍니다.이 새 튜브에 PBS를 채우고, 세포 현탁액을 부드럽게 섞은 후 300 ×g, 20 °C에서 10분 동안 세포를 두 번 세척합니다. 첫 번째 세척 후, 펠렛을 재현탁하여 하나의 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 두 번째 세척 후, 세포 펠렛을 200 µL의 PBS에 부드럽게 재현탁하고, 세포 계수를 위해 세포 현탁액 1 µL를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 담긴 1 mL의 PBS로 옮깁니다.그 후 50 milliliter 튜브에 담긴 세포를 PBS로 세척하고, 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 완전히 제거합니다. 단핵구로부터 B 세포를 분리하기 위해, 방금 세척한 펠렛을 4 °C의 갓 조제한 DGAs E-D-T-A-P-B-S 완충액 160 microliters에 다시 현탁합니다.그런 다음 세포 현탁액에 40 µL의 B-cell isolation kit, bio ITIN antibody cocktail을 혼합합니다. 4 °C에서 10분 동안 세포를 배양한 후, 세포 10 million개당 1 mL의 4 °C E-D-T-A-P-B-S 버퍼를 사용하여 결합하지 않은 항체를 세척하여 제거합니다. 이어서 세포 펠렛을 320 µL의 4 °C E-D-T-A-P-B-S 버퍼로 재현탁합니다.이제 4°C에서 15분간 배양한 후, 세포 현탁액에 80 µL의 anti-biotin microbeads를 혼합합니다. 세포를 원심 분리하는 동안 다시 한 번 세척합니다. Max separator의 자기장 내에 LS column을 배치하고, 4°C의 EDTA-PBS 버퍼 3 mL를 컬럼에 통과시킵니다.다음으로 세척된 세포를 최대 100 million개까지 4 °C의 E-D-T-A-P-B-S 버퍼 500 µL에 다시 현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 컬럼에 피펫팅하고, 컬럼을 통과하여 나오는 표지되지 않은 세포를 50 mL 원추형 튜브에 수집합니다. 원래의 원추형 튜브 벽면에 4 °C의 E-D-T-A-P-B-S 버퍼 2 mL를 1 mL씩 추가한 후, 매번 부드럽게 혼합하여 남은 세포 현탁액을 컬럼에 피펫팅함으로써 모든 세포를 확실하게 회수합니다.마지막으로 라벨이 붙지 않은 세포가 들어 있는 원뿔형 튜브를 PBS로 채웁니다. 원심분리 후, 세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 200 microliters의 E-D-T-A-P-B-S 버퍼로 세포를 부드럽게 재부유시킵니다.항체 표지를 시작합니다. 먼저 세포 현탁액 1 µL를 이전에 라벨링한 비염색 튜브로 옮깁니다. 튜브에 E-D-T-A-P-B-S 버퍼 500 µL를 추가하고 얼음에 보관하십시오.모든 조명을 끈 다음, 남아 있는 세포 현탁액의 세포 1백만 개당 CD 19, CD 34, CD 45 항체를 각각 20 µL씩 첨가합니다. 잘 섞어준 뒤 튜브를 상온의 암소에 30분 동안 둡니다. 다음으로, 항체가 표지된 세포 현탁액 40 µL를 7 A~D로 표시된 튜브로 옮깁니다.1 mL의 PBS로 세포를 세척한 다음, 100 µL의 결합 버퍼(binding buffer)로 펠릿을 재현탁합니다. 이 세포들에 7 µL의 7-AAD를 첨가하고, 세포가 7-AAD로 표지되는 동안 실온의 암소에서 10분 동안 배양합니다. 항체 표지된 세포가 들어있는 튜브의 상단을 PBS로 채워 세척한 후, 펠릿을 500 µL의 EDTA-PBS 버퍼에 재현탁합니다. 이제 항체 표지된 세포 현탁액 전체 부피를 CD19 양성, CD34 양성, CD45 양성 표지 튜브로 옮깁니다.튜브를 1 mL의 E-D-T-A-P-B-S 버퍼로 추가 헹구고, 남은 세포 현탁액을 CD 19 양성 CD 34 양성 CD 45 양성 표시 튜브로 옮깁니다. 마지막으로, MO flow XDP 유세포 분석기를 사용하여 세포를 분리하기 위해 7-AAD 튜브에 300 µL의 결합 버퍼를 추가합니다. 먼저 분리를 위한 MO flow 설정을 완료하고, 적절한 보정 대조군을 실행한 후 본 그림에 예시된 것과 같은 플롯을 포함하는 프로토콜을 생성합니다.에어로졸 배출 시스템이 항상 작동하고 있는지 확인한 후, 염색되지 않은 샘플을 사용하여 전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 플롯의 전압과 게인을 설정하십시오. 음성 형광 모집단을 식별하기 위해, DNA를 포함하는 데브리가 회수된 샘플을 오염시키지 않도록 임계값(threshold)을 1% 이하로 설정하십시오.CD 19 양성 CD 34 양성 CD 45 양성 샘플의 이벤트를 약 50,000개 분석합니다. 방금 시연한 것과 같이 게이팅 전략을 설정하기 위해, 게이팅되지 않은 CD 19 양성 CD 34 양성 집단을 side scatter 대 forward scatter 플롯에 백게이팅(back gating)합니다. 이는 림프구 게이트에 잠재적인 pro B 세포가 포함되도록 하기 위함입니다.이 샘플을 사용하여 7-AAD 염색의 음성 형광 집단을 함께 설정하십시오. 다음으로, 7-AAD 샘플을 분석하여 샘플의 생존율을 결정하십시오. 사멸된 세포는 무분별하게 염색되어 분리 집단을 오염시킬 수 있으므로, 처음부터 생존율이 95% 이상인 샘플에서만 세포를 분리하십시오. 이제 CD19 양성 및 CD34 양성, CD19 양성 및 CD34 음성 및 CD45 low, CD19 양성 및 CD34 음성 및 CD45 medium, 그리고 CD19 양성 및 CD34 음성 및 CD45 high의 4가지 집단을 수집하도록 분리 조건을 설정하십시오.클로깅(clog)을 방지하기 위해 모든 세포군(population)의 정렬 결정 단계에 림프구 및 더블릿(doublet) 구별 게이트를 포함하십시오. 소팅 팁의 경우, CD 19 양성, CD 34 양성, CD 45 양성 샘플을 정렬 직전에 40 micron 셀 스트레이너로 여과하십시오. 그 다음, PBS에 2%FBS가 코팅된 라벨 처리된 수집 튜브를 아이스 팩이 담긴 튜브 홀더에 배치하고, 정렬이 완료된 직후 세포를 해당 수집 튜브로 정렬하십시오.시료 변이가 세포의 성공 여부에 영향을 미치므로, 적절하게 정렬하여 DNA를 추출하십시오. 림프구 게이트 내에 높은 비율의 세포가 존재합니다. 성공률이 높은 시료는 게이트 설정된 림프구 군집의 왼쪽 아래로 떨어지는 이벤트 수가 적은 것으로 확인되며, 이는 오염된 부스러기 수준이 낮음을 나타냅니다.성공률이 낮은 샘플에는 오염된 잔해물이 다량 포함되어 있습니다. 불량 샘플에서는 이러한 이벤트가 현저히 증가하는 양상을 보입니다. 유세포 분석으로 분리된 세포와 각 전구 B세포 서브셋에서 이후 분리된 DNA는 하위 분석을 수행하기에 충분한 양과 질을 갖추고 있습니다.우리는 CD 19 양성 CD 34 양성 세포, CD 19 양성 CD 34 음성 CD 45 low 세포, CD 19 양성 CD 34 음성 CD 45 medium 세포 및 CD 19 양성 CD 34 음성 CD 45 high 세포에서 분리한 DNA로부터 메틸화된 DNA를 농축하기 위해 Myra를 일상적으로 활용했습니다. 해당 DNA들을 총 9분 동안 고강도로 초음파 처리하고 컬럼 정제한 후, SYBR Green 핵산 젤 염색약을 사용한 1% agarose 젤에서 시각화했습니다. 이 레인에는 대조군인 100 base pair ladder도 함께 로딩되었습니다. 메틸화된 DNA의 농축을 확인하기 위해 Active Motif 사의 MethylCollector Ultra Kit를 이용한 Myra 처리 후, 대조군인 메틸화된 SLC 25 A 37 및 비메틸화된 APC 1 유전자를 대상으로 PCR을 수행했습니다.SLC 25. A 37의 더 높은 증폭은 전구 B-세포 서브셋에서 메틸화된 DNA가 농축되었음을 확인시켜 줍니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 10시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 오염성 파편의 생성을 최소화하기 위해 세포를 매우 조심스럽게 다루고 최적화된 양의 항체를 사용하는 것이 중요합니다. 다음은 이 절차의 순서입니다.어떤 유전자가 메틸화되었는지 및 전구 B세포 서브셋과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 살아있는 인간 세포를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행할 때는 항상 에어로졸 배출 시스템을 가동하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

isolation-of-precursor-b-cell-subsets-from-umbilical-cord-blood

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기가 첫 번째 좋은 생산 관행 (GMP)을 준수하는 탯줄 혈액, 주로 나이브 T 세포의 소스에서 바이러스 특정 세포 독성 T 림프구 (CTL)를 생산 방법을 설명합니다.

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

이 비디오는 면역자기 표적화 및 말초 혈액 단핵 세포 현탁액에서 분리하여 B 세포를 정제하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 특정 세포 표면 단백질을 표적으로 하는 특정 항체 또는 리간드(자성 입자에 연결됨)로 원치 않는 세포 유형을 라벨링하여 자기 분리에 의해 이종 세포 현탁액에서 고갈시키는 것을 포함합니다.

음성 면역자기 선택: 말초 혈액 단핵 세포에서 B 세포를 정제하는 방법

이 동영상에서는 non-B 세포 및 스트렙타비딘 접합 자성 마이크로비드에 특이적인 비오틴화 항체를 사용하여 인간 말초 혈액에서 B 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

인간 말초 혈액에서 B 세포의 분리 및 정제

이 비디오는 인간 면역 체계(HIS) 마우스를 생성하는 기술을 보여줍니다. CD34+ 조혈모세포(HSC)는 항체로 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 인간 제대혈 버피 코트 세포에서 분리됩니다. CD34+ HSC는 사이토카인이 풍부하고 동결 보존된 성장 배지에서 확장됩니다. 마지막으로, 해동된 HSC를 면역결핍 새끼 마우스에 주입하여 HIS 마우스 모델을 확립합니다.

제대혈 조혈 줄기세포를 분리하여 인간 면역계 마우스를 생성하다

여기에서는 말초 Vδ1+CD4+ T 세포의 희소한 T 세포 개체, 즉 최근에 보여준 바와 같이 흉선 외 αβ T 세포 전구 세포의 분리 및 복제를 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 이 기술을 사용하면 체외 배양에서 이러한 세포를 정량적으로 분리, 복제 및 효율적으로 확장할 수 있습니다.

분리 및<em&gt; 전의 VIVO</emVδ1의&gt; 문화<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T 세포, Extrathymic αβT 세포 선조

인간의 말초 혈액은 일반적으로 체액성 면역 반응의 평가에 사용됩니다. 여기에서는 말초 혈액에서 인간 B 세포를 분리하고, 배양에서 인간 B 세포를 항체(Ab) 분비 B 세포(ASC)로 분화하고, ELISpot 분석을 통해 총 IgM- 및 IgG-ASC를 열거하는 방법에 대해 설명합니다.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

이 프로토콜의 목표는 내 피 뿌리 탯 줄 혈액에서 세포를 분리. 조직 설계 만드는 혈관 및 심장 밸브 구성 및 응용 프로그램의 일부는 biomarker로 심혈 관 위험, 허 혈 성 질환 치료 환자를 식별 하는 데 이러한 세포를 사용 하 여 포함 됩니다.

인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

매우 순수한 인구의 없으며 코드에서 얻어질 수 있다 혈액 유래 CD34+ 세포. CD34 방법+ 셀 고립과 megakaryocyte 차별화는 여기에 설명 된.

Megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 CD34+ 세포

여기서, 우리는 4개의 골수성 혈통에 제대혈 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 면역표현특성 및 사이토카인 유도분화를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 적용은 CD34+ 세포의 골수성 분화에 대한 골수성 질환 돌연변이 또는 소분자의 영향에 대한 조사를 포함한다.

인간 코드 혈액 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 범골수성 분화

우리는 세자리 증후군으로 진단 된 환자로부터 얻은 전혈에서 말초 혈액 단핵 세포를 분리하기위한 간단한 프로토콜을 제시하고, CD4 + T 세포의 선택, phorbol12-myristate13-acetate 및 A23187 ionophore로 자극, 전사 프로파일 링을위한 RNA 준비.

전사 프로파일링을 위해 세자리 증후군 환자로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 및 CD4+ T 세포 분리

이 프로토콜은 바이오뱅킹 및 기타 목적을 위해 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 고처리량 자동화 호환 방법에 대해 자세히 설명합니다.

High Throughput Immunomagnetic Bead Separation을 통해 Buffy Coats에서 인간 말초 혈액 단핵 세포 분리

배우세요 탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합을 분리하는 방법을. 밀도 구배 원심분리와 유세포 분석술을 사용하여 고품질 핵산을 확보하고 면역 발달 연구에 활용할 수 있습니다.

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

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