경쟁 분석법을 이용는 GTPase - 결합 단백질의 친화 비교

본 실험 절차의 전반적인 목적은 세심하게 제어된 뉴클레오타이드 로딩 조건 하에서 Row Family GTPACE에 대한 단백질 결합 파트너들의 상대적 친화도를 비교하는 것입니다. 이는 먼저 동일한 태그(예: 녹색 형광 단백질 또는 GFP)가 표지된 추정 경쟁 결합 파트너들을 정제함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 관심 대상인 GTPase를 정제하는 것입니다.

예를 들어, RAC 1을 준비하고 원하는 GTPase 신호 전달 상태를 구현하기 위해 적절한 뉴클레오티드로 로딩합니다. 다음으로, 뉴클레오티드가 로딩된 GTPase를 일정량의 하나의 결합 경쟁자와 점증하는 양의 다른 결합 경쟁자와 함께 배양하여 적정 결합 곡선을 얻습니다. 마지막 단계는 고정화된 GTPase에 결합된 단백질을 웨스턴 블롯으로 분리하고, 두 결합 파트너가 공유하는 GFP 태그를 검출하기 위해 막을 프로빙하는 것입니다.

궁극적으로, Western blot은 GTPase에 의해 캡처된 각 GFP 태그 결합 파트너의 유사한 양에 대한 상대적 농도를 식별하는 데 사용됩니다. 공동 침전(co precipitation)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 세포 내 GTPase의 단백질 결합 특성이 결합된 뉴클레오타이드에 의해 결정된다는 점입니다. 결합된 뉴클레오타이드는 불안정하여 단백질 결합 데이터의 해석을 어렵게 만듭니다.

텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 GST 태그가 붙은 G tpa의 정제 및 gtpa 결합 단백질의 발현으로 이 절차를 시작하십시오. 형질전환된 세포가 담긴 플라스크를 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹구고 5분 동안 플라스크의 액체를 빼냅니다. 유동 액체를 흡입하여 제거한 후, 500 µL의 용해 완충액을 사용하여 세포를 긁어 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고, 4 °C에서 30분 동안 도립 혼합하여 세포를 용해시킵니다.

용해 세척 단계 동안, 신선한 용해 버퍼로 40 µL씩 두 분량의 GFP 트랩 비드를 3회 세척합니다. 세척 단계 사이에는 2,700 ×g에서 2분 동안 비드를 원심 분리하여 침전시킵니다. 용해 후, 21,000 ×g에서 10분 동안 원심 분리하여 용해물을 청징화합니다.

각 경쟁 단백질의 맑은 용해물을 각각 세척된 GFP trap 비드로 옮깁니다. 4°C에서 도립 혼합하며 2시간 동안 GFP 융합 단백질이 결합하도록 둡니다. 로딩된 GFP trap 비드를 용해 버퍼로 2회, 경쟁 버퍼로 2회 세척합니다.

세척 단계 사이마다 2,700 ×g에서 2분간 원심분리하여 결합 완충액 내의 비드를 침전시킵니다. 40 µL의 0.2 M glycine을 첨가하고 30초 동안 파이펫팅하여 GFP 융합 단백질을 용출시킨 후, 즉시 21,000 ×g에서 60초간 비드를 침전시키고 액체를 4 µL의 1 M tris HCL이 들어 있는 새로운 원심분리 튜브로 옮깁니다. 정제된 단백질의 손상을 최소화하기 위해 이 단계를 신속하게 수행하십시오. 정제된 각 단백질 1 µL를 웨스턴 블롯으로 분석하고 anti GFP 항체로 프로빙한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 정량 블로팅 시스템을 사용하여 상대적 수율을 확인합니다.

경쟁 결합 버퍼를 첨가하여 단백질의 몰 농도를 동일하게 맞춥니다. 준비된 GST rack one 비드 90 µL를 취하고, 각 단계에서 자성 입자 분리기를 사용하여 비드를 침전시키면서 뉴클레오타이드 로딩 버퍼로 3회 세척합니다. 비드에서 버퍼를 흡입하여 제거한 후, GDP, GTP 또는 뉴클레오타이드 미로딩 중 필요한 조건에 따라 뉴클레오타이드 로딩 버퍼 100 µL를 첨가합니다.

경쟁 실험을 위해, 뉴클레오타이드 로딩 대조군으로는 60 µL의 GST rack one 비드에 100 mM GDP 12 µL, 10 mM GTP gamma S 12 µL 또는 뉴클레오타이드를 첨가하지 않습니다. 남은 비드를 10 µL씩 세 개의 튜브로 나누고, 각 튜브에 100 mM GDP 2 µL, 10 mM GTP gamma S 2 µL 또는 뉴클레오타이드를 첨가하지 않습니다. 비드 혼합물을 30 °C에서 30분 동안 교반하며 배양합니다.

경쟁 결합 실험을 수행하기 위해, 실험 혼합물과 대조군 혼합물에 1 M magnesium chloride를 첨가하여 뉴클레오타이드 결합 랙을 안정화합니다. 경쟁 결합 버퍼 200 µL가 각각 들어 있는 마이크로 원심분리관 6개를 준비합니다.

각 튜브에는 뉴클레오타이드 로딩 랙 10 µL, 비즈 1개, 그리고 랙 5 µL가 포함되어야 합니다. 각 튜브에 일정 결합 단백질로서 결합 단백질 A를 추가하고, 가변 결합 단백질로서 결합 단백질 B를 0, 1, 2, 0.55, 10 또는 20 µL 추가합니다. 이 부피는 일정 결합 단백질과 가변 결합 단백질의 스톡 농도가 거의 동일하다고 가정하며, 필요에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.

경쟁 결합 완충액을 첨가하여 결합 혼합물의 총 부피를 235 µL로 맞춥니다. 다음으로, 경쟁 완충액 200 µL가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브를 준비합니다. 실험용 뉴클레오타이드가 로딩된 랙 1의 비즈 10 µL와 랙 1 결합 단백질 A 10 µL를 넣습니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 GDP, GTP gamma S 및 뉴클레오타이드 무첨가 대조군 튜브를 준비합니다.

튜브를 4°C에서 2시간 동안 배양하고, 배양 후에는 도립 혼합하여 섞어줍니다. 경쟁 결합 버퍼를 사용하여 비드를 3회 세척합니다. 마지막으로, 20 µL의 환원 샘플 버퍼로 결합된 단백질을 용출합니다.

정제된 GFP RCC two 및 GFP Corona in one C.Propeller 도메인의 GFP 태그에 대한 정량적 웨스턴 블로팅 결과, 상단 밴드의 단백질인 GFP RCC two가 하단 밴드보다 1.4배 더 풍부한 것으로 나타나며, 경쟁 실험을 위한 1:1 몰비를 맞추기 위해 희석해야 합니다. 대조 실험을 통해 rack one의 뉴클레오타이드 로딩 상태가 결합 특이성을 결정한다는 것을 입증하였으며, 이를 위해 일정 부피의 등몰 GFP Corona in one C propeller 도메인에 대해 GFP RCC two의 부피를 점진적으로 증가시켜 적정하고 블로팅을 수행하였습니다. rack one에 결합하는 단백질을 통해 결합된 단백질의 상대적 변화를 시각화할 수 있으며, 두 경쟁 단백질의 GFP 밴드 강도를 동일한 그래프에 도식화하고 선들이 교차하는 지점을 식별함으로써 평형 상태에서의 가변 결합 단백질 부피를 확인할 수 있습니다.

하지만 경쟁자 간의 상호작용이나 과도한 베이트 gtpa와 같은 문제가 실험을 저해하지 않도록 주의해야 합니다. 여기서 보여주는 것처럼 다른 경쟁자의 손실 없이 한쪽 경쟁자만 증가했다면, 해당 절차를 수행하는 과정에서 문제가 발생했음을 나타냅니다. 경쟁 결합 파트너들의 풍부함 사이에 상호 관계가 있는지 확인하는 것이 중요함을 기억하십시오.

데이터를 검토하여 식별할 수만 있다면, 결과에 왜곡을 일으키거나 해결 가능한 여러 가지 문제들이 존재합니다.