경쟁 분석법을 이용는 GTPase - 결합 단백질의 친화 비교

이 절차의 전반적인 목표는 신중하게 제어된 뉴클레오티드 로딩 조건에서 Row Family GT P ACE에 대한 단백질 결합 파트너의 상대적 친화도를 비교하는 것입니다. 이는 먼저 추정되는 경쟁 결합 파트너를 정제함으로써 달성되며, 각각 동일한 태그(예: 녹색 형광 단백질 또는 GFP)로 표지됩니다. 두 번째 단계는 관심 있는 GTPA를 정제하는 것입니다.

예를 들어, RAC 1을 선택하고 원하는 GTPA 신호 상태를 달성하기 위해 적절한 뉴클레오티드를 로드합니다. 다음으로, 뉴클레오티드 로드된 gtpa는 적정 결합 곡선을 달성하기 위해 고정된 양의 한 결합 경쟁자와 다른 결합 경쟁자의 증가된 양으로 배양됩니다. 마지막 단계는 웨스턴 블롯(western blot)에 의해 고정된 GT 파제(pase)에 결합된 단백질을 분해하고 두 결합 파트너 간에 공유되는 GFP 태그에 대해 멤브레인을 조사하는 것입니다.

궁극적으로, 웨스턴 블롯은 각 GFP 태그가 지정된 결합 파트너의 유사한 양이 GTPase에 의해 포착되는 상대적 농도를 식별하는 데 사용됩니다. co precipitation과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 gtpa의 단백질 결합 특성이 세포의 결합된 뉴클레오타이드에 의해 결정된다는 것입니다. 결합된 뉴클레오타이드는 불안정하여 단백질 결합 데이터의 해석을 어렵게 만듭니다.

텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 GST 태그가 지정된 G tpa의 정제 및 gtpa 결합 단백질의 발현으로 이 절차를 시작합니다. 형질 주입된 세포의 플라스크를 인산염 완충액 식염수 또는 PBS에 RIN하고 5분 동안 플라스크를 배출합니다. 자유로운 액체를 흡인해서, 그 후에 용해 완충기의 500 마이크로리터에 있는 세포를 마이크로 fuge 관으로 긁어내고, 30 분 동안 4 섭씨 온도에 역전에 의하여 lyse에 의하여 lyse하기 위하여 세포를 섞었습니다.

용해 세척 동안 40 마이크로 리터의 GFP 트랩 비드 2 개 로트를 신선한 용해 완충액 침전물로 세 번 세척합니다. 2, 700 번 G에서 2 분 동안 세척 사이에 구슬. lysis 다음, 21, 000 시간 G에 원심분리에 의하여 lysates를 10 분 동안 명백하게 하십시오.

각 경쟁사 단백질의 정화된 용해물을 세척된 GFP 트랩 비드를 분리하기 위해 옮깁니다. GFP 융합 단백질이 2시간 동안 결합하고 섭씨 4도에서 역환으로 혼합되도록 합니다. 로드된 GFP 트랩 비드를 lysis buffer에서 두 번, 경쟁 버퍼에서 두 번 세척합니다.

바인딩 완충액은 세척 사이 2 분 동안 2, 700 시간 G에 구슬을 침전합니다. 0.2 몰 글리신의 40 마이크로리터를 추가하고 30 초 동안 여기저기 피펫을 발사해서 GFP 융해 단백질을 즉각 21, 000 시간 G에 구슬을 침전하고 60 초 동안 G 4 마이크로리터를 포함하는 새로운 fuge 관으로 액체를 옮기고, 순화된 단백질에 손상을 제한하기 위하여 이 단계를 빨리 실행하십시오. 웨스턴 블롯으로 각 정제된 단백질의 1마이크로리터를 분석하고 안티 GFP 항체로 프로브하여 제조업체의 프로토콜에 따른 정량적 블로팅 시스템을 사용하여 상대적 수율을 설정합니다.

경쟁 결합 완충액을 추가하여 몰 단백질 농도를 균등화합니다. 90마이크로리터의 준비된 GST 랙 비드 1개를 취하고 자성 입자 분류기를 사용하여 뉴클레오티드 로딩 버퍼로 3회 세척하여 각 단계에서 비드를 침전시킵니다. 비드에서 완충액을 흡입하고 G-D-P-G-T-P 또는 뉴클레오티드 로딩이 필요하지 않은지 여부에 따라 100마이크로리터의 뉴클레오티드 로딩 버퍼를 추가합니다.

경쟁 실험의 경우, 뉴클레오티드 로딩 제어를 위해 60마이크로리터의 GST 랙 1 비드에 100밀리몰 GDP 12마이크로리터, 10밀리몰 GTP 감마 S 또는 뉴클레오타이드가 없는 12마이크로리터를 추가합니다. 나머지 비드를 3개의 10마이크로리터 쿼트로 분할하고 각 튜브에 100밀리몰 GDP 2마이크로리터, 10밀리몰 GTP 감마S 또는 뉴클레오타이드가 없는 2마이크로리터를 추가합니다. 비드 혼합물을 섭씨 30도에서 30분 동안 교반하면서 배양합니다.

뉴클레오티드 결합 랙을 안정화하고, 실험 혼합물 및 대조군 혼합물에 1몰 염화마그네슘을 첨가하여 경쟁 결합을 수행합니다. 6개의 마이크로 퍼지 튜브를 설정합니다. 각각 200마이크로리터의 경쟁 결합 완충액을 함유하고 있습니다.

또한 각 튜브에는 10마이크로리터의 뉴클레오티드 적재 랙, 1개의 비드 및 5마이크로리터의 랙이 포함되어야 합니다. 각 튜브에 일정한 결합 단백질인 하나의 결합 단백질 A를 0, 1, 2, 0.55, 10 또는 20마이크로리터의 랙 1 결합 단백질 B를 가변 결합 단백질로 추가합니다. 이러한 부피는 불변 및 가변 결합 단백질의 스톡 농도가 거의 동일하다고 가정하며 조정이 필요할 수 있습니다.

경쟁 결합 완충액을 첨가하여 결합 혼합물의 총 부피를 235 마이크로 리터로 구성하십시오. 다음으로, 200마이크로리터의 경쟁 버퍼를 포함하는 마이크로 퍼지 튜브를 설정합니다. 10 마이크로 리터의 실험용 뉴클레오티드가 랙, 하나의 구슬 및 10 마이크로 리터의 랙 1 결합 단백질 A.Then 텍스트 프로토콜에 설명 된대로 G-D-P-G-T-P 감마 S 및 뉴클레오티드 제어 튜브를 설정하지 마십시오.

튜브를 2시간 동안 배양하고 배양 후 섭씨 4도에서 반전으로 혼합합니다. 경쟁사 바인딩 버퍼로 비드를 세 번 씻습니다. 마지막으로, 결합된 단백질을 20마이크로리터의 환원 시료 완충액에 용리시킵니다.

1개의 C.Propeller 영역에서 순화된 GFP RCC 2 그리고 GFP 코로나의 GFP 꼬리표의 양이 많은 서쪽 더럽히는 것은 위 밴드, GFP RCC 2에 있는 단백질이 더 낮은 밴드 보다는 더 풍부한 1.4 시간 이고 경쟁 실험을 위한 1:1 어금니 비율을 달성하기 위하여 묽게 되어야 한다는 것을 계시합니다. 대조 실험은 랙 1의 뉴클레오티드 로딩 상태가 결합 특이성을 지시하고, 하나의 C 프로펠러 영역에서 고정된 부피의 등몰 GFP 코로나에 대해 GFP, RCC 2의 부피 증가 및 블로팅을 지시한다는 것을 보여줍니다. 랙 1에 결합하는 단백질을 사용하면 결합된 단백질의 상대적 변화를 시각화하고, 동일한 그래프에 두 경쟁자에 대한 GFP 밴드 강도를 표시하고, 선이 교차하는 지점을 식별하여 평형 상태에서 가변 결합 단백질의 부피를 식별할 수 있습니다.

그러나 경쟁업체 간의 상호 작용 또는 과도한 미끼 gtpa와 같은 문제가 실험을 손상시키지 않도록 주의해야 합니다. 여기에 표시된 것처럼 다른 경쟁자의 손실 없이 한 경쟁자가 증가하면 이 절차를 시도하는 동안 문제가 있음을 나타냅니다. 경쟁하는 바인딩 파트너의 풍부함 사이에 상호 관계가 있는지 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

결과를 왜곡할 수 있거나 데이터를 검사하여 식별되는 한 해결할 수 있는 여러 가지 문제가 있습니다.