Name: 세포 생물학을위한 그라디언트 생성 Microfluidic 장치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 배우세요 미세유체 장치를 이용한 농도 구배 생성 방법으로 세포 이동성 연구를 수행하는 기술입니다. 이 프로토콜은 생물학적 미세환경 정밀 제어에 활용됩니다.

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그라디언트 생성 microfluidic 장치의 A.의 Microfabrication <ol><li> 시 웨이퍼는 반응 산소 플라즈마 (30W, Harrick 과학에서 5 분, NY)로 처리됩니다. </li><li> 부정적인 포토 레지스트 (SU - 8 50 Microchem, MA)가시 웨이퍼 1 분 1,000 RPM에서 스핀 - 코팅입니다. </li><li> 웨이퍼는 부드럽 65 구운 ° 95시 이후에 10 분 및 들면 C ° 열판 30 분 C. </li><li> 웨이퍼 30 μm의 최소 기능 크기가 투명 마스크를 통해 3 분위한 자외선 (200W)에 노출됩니다. </li><li> 웨이퍼 65에서 구운 게시물 ° 1 분 및 95에서 C ° 10 분 C. 것입니다 </li><li> 100 μm의 두께 채​​널시 마스터 금형은 SU - 8 포토 레지스트 개발을 사용하여 개발되고 있습니다. </li><li> microchannels를 포함하는 웨이퍼는 페트리 접시에 - 배치됩니다. </li><li> 폴리 (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) 금형은 혼합 실리콘 엘라스토머 및 치료 에이전트 (10시 1분 비율)에 의해 가공됩니다. </li><li> PDMS 혼합물은시 마스터 금형에 부어있다. </li><li> 시 마스터 금형 10 분 거품을 제거하는 진공 건조기에 배치됩니다. </li><li> PDMS는 1 ~ 2 시간 동안 70 ° C에서 치료됩니다. </li><li> PDMS 금형은시 마스터 금형으로부터 떨어져 벗겨 수 있습니다. </li></ol> B. 실험 설정 <ol><li> PDMS 기반 microfluidic 장치의 세포 유입, 아울렛, 그리고 일으키는 인레츠는 날카로운 punchers를 사용하여 천공하고 있습니다. </li><li> 장치 및 유리 슬라이드 (2 × 3 인치) irreversibly 반응 산소 플라즈마 (30W, Harrick 과학에서 5 분, NY)에 의해 결합됩니다. </li><li> 폴리에틸렌 튜브 (PE 20 백톤 Dickinon, MD)은 microfluidic 장치의 일으키는 인레츠에 삽입 후 주사기 펌프에 연결되어 있습니다. </li><li> 플루오레신 isothiocyanate (FITC) - dextran (MW = 10kD, 10 μm의, 시그마)와 버퍼 (PBS, Invitrogen, CA) 유체 장치 내부의 안정적인 그라디언트를 확인 microfluidic 장치에 들어갈 수 있습니다. </li><li> 세포외 매트릭스 (ECM) (즉, fibronectin)는 인큐베이터에서 1 시간 (37 ° C)에 대한 microfluidic 장치 내부에 코팅됩니다. </li><li> NIH 3T3 fibroblast 세포는 trypsinized 및 dissociated 있습니다. </li><li> Dissociated 세포 2의 세포 밀도 × 10 6 세포 / ML에서 microfluidic 장치 (800 μm의 폭)에로드됩니다. </li><li> 2 ML 미디어 50 NG / ML 표피 성장 인자 (EGF)는 주사기 펌프 (0.05 μl / 분)를 사용하여 가용성 그라디언트 창출을위한 microfluidic 장치로 주입됩니다. </li><li> 전지는 실시간으로 바뀌 현미경 (니콘 TE 2000)를 사용하여 모든 5 분 감시하고 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).</li>
<li>Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+neutrophil+chemotaxis+is+strongly+influenced+by+mean+IL-8+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).</li>
<li>Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cell+growth+and+differentiation+in+a+gradient-generating+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device.</a> Lab Chip. 5, 401-406 (2005).</li>
<li>Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parallel-gradient+microfluidic+chamber+for+quantitative+analysis+of+breast+cancer+cell+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis.</a> Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).</li>
<li>Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+microfluidic-vacuum+device+for+interfacing+with+conventional+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform.</a> BMC Biotechnol. 7, (2007).</li>
</ol>

세포가 높은 농도쪽으로 마이 그 레이션 microfluidic 장치에서 EGF의 안정적인 농도 기울기에 노출. 셀 마이 그 레이션, chemotactic 지수, 마이 그 레이션하는 세포의 운동성의 방향 방향은 셀 추적 분석에 의해 조사되었다. 따라서,이 그라디언트 생성 microfluidic 플랫폼은 암 전이, embryogenesis, 그리고 축삭지도를 공부하는 데 유용 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Dextran-FITC</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td>Fluorescein isothiocyanate (FITC) 접합 dextran (10kD)</td></tr><tr><td>hr-EGF</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td>인간 재조합 표피 성장 인자(Epidermal growth factor)</td></tr><tr><td>PDMS</td><td></td><td>K.R. Anderson Co.</td><td>2065622</td><td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)</td></tr><tr><td>음성 포토레지스트</td><td></td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 50</td><td></td></tr><tr><td>Si 웨이퍼</td><td></td><td></td><td></td><td>실리콘 웨이퍼, 4 inch</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>PE 20</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3</td><td>세포주</td><td></td><td></td><td>섬유아세포</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>TE 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 생물학을위한 그라디언트 생성 microfluidic 장치

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

세포 행위를 연구에 대한 제조 및 그라디언트 생성 microfluidic 장치의 작동을 설명합니다. 그것이 정확하게, 유체 흐름을 조작하는 높은 처리량 실험을 활성화하고 안정적​​인 용해 농도 그라디언트를 생성할 수 있기 때문에 microfluidic 플랫폼, 활성화 실험 도구입니다. 기존의 기울기 발전기, 폴리 (dimethylsiloxane) (PDMS)에 비해 기반의 microfluidic 장치는 잘 정의된 프로필 성장 요인의 안정적인 농도 기울기를 생성할 수 있습니다. 여기, 우리는 별도의 세 가지 인레츠와 간단한 그라디언트 생성 microfluidic 장치를 개발했다. 세 microchannels은 농도 기울기를 생성 한 microchannel에 결합. 성장 인자의 그라디언트의 안정성과 형태는 표피 성장 인자 (EGF)와 비슷한 분자량과 플루오레신 isothyiocyanate (FITC) - dextran에 의해 확인되었다. 이 microfluidic 장치를 사용하여, 우리는 EGF의 농도 기울기에 노출된 섬유아 세포가 높은 농도쪽으로 마이 그 레이션 것을 보여주었다. 마이 그 레이션 세포의 세포 마이 그 레이션 및 운동성의 방향 방향은 양적 세포 추적 분석에 의해 평가되었다. 따라서,이 그라디언트 생성 microfluidic 장치 마이 그 레이션 세포의 동작을 연구하고 분석을 위해 유용할 수 있습니다.

우리는 잘 정의된 microenvironment의 공간 및 시간적 그라디언트를 생성할 수있는 그라디언트 생성 microfluidic 장치의 microfabrication을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 그라디언트 생성 microfluidic 장치가 감독 셀 마이 그 레이션, embryogenesis, 상처 치유, 및 암 전이를 공부하는 데 사용할 수 있습니다.

세포 생물학을위한 그라디언트 생성 Microfluidic 장치

세포 행동 연구를 위한 구배 생성 미세유체 장치의 제작 및 작동 방법이 기술되어 있습니다. 미세유체 플랫폼은 ...

제 이름은 Jiang이며, 하버드 및 MIT 보건 과학 기술 대학의 포스터 펠로우입니다. 그리고 제 이름은 Amir Manchi이며, 하버드 및 MIT 보건 과학 기술 학부의 ha SANE 교수 연구실 학부생입니다.이 슬라이드는 장치 제작의 모식도를 보여줍니다. 먼저 실리콘 웨이퍼 위에 SUA 50을 스핀 코팅한 후, 실리콘 웨이퍼 위에 마스크를 배치하고 UV 노광 및 현상을 진행합니다. 이를 통해 최종적으로 실리콘 웨이퍼 위에 패드를 형성할 수 있습니다. 그 다음 PDMS를 캐스팅하여 경화 및 베이킹 과정을 거친 뒤, 작은 구멍을 뚫어줍니다. 마지막으로 산소 플라즈마를 사용하여 PDMS 장치와 유리 기판 사이를 본딩하여 장치를 완성합니다.이제 실험실 내의 마이크로 제작실에 들어왔으며, PDMS 층을 만드는 것부터 시작하겠습니다. 여기서 PDMS란 과학적 정식 명칭으로 폴리디메틸실록산(polymethyl siloxane)을 의미하며, 이는 유기 고분자입니다. 이는 가장 널리 사용되는 실리콘 기반 유기 고분자입니다.이는 실제로 두 가지 서로 다른 물질의 혼합물로, 실리콘 엘라스토머 베이스와 실리콘 엘라스토머 경화제의 혼합물입니다. 혼합 비율은 베이스 10 대 경화제 1입니다. 베이스 약 10 g이 필요하므로, 이에 따라 엘라스토머 경화제 약 1 g이 필요하며, 이 베이스와 경화제가 서로 잘 섞이도록 혼합하겠습니다.피펫을 사용하겠습니다. 혼합물이 준비되었으므로, 이제 이를 실리콘 웨이퍼 위에 붓겠습니다. 이 실리콘 웨이퍼의 상단에는 특정 패턴이 형성되어 있습니다.이것들은 실제로 PDMS 폴리머가 패턴을 형성하도록 도와주며, 우리는 이 패턴들을 이용하여 폴리머 위에 필요한 채널, 홈 또는 기타 임의의 패턴을 만듭니다. 다음 단계는 혼합물 내부에 많은 기포가 있으므로, 폴리머 내부의 기포를 제거하기 위해 진공 상태에 두는 것입니다. 진공 챔버 내의 실리콘 웨이퍼 위에 PDMS 겔을 배치하겠습니다.이제 챔버를 닫고 진공 상태로 만들겠습니다. 기포가 모두 사라질 때까지 약 몇 분 정도 기다린 후, 70 °C로 설정된 오븐에 넣고 하룻밤 동안 굳힙니다. 주목해서 보셔야 할 패턴은 경사 농도를 만들기 위한 세 개의 서로 다른 저장소입니다. 이를 통해 한쪽은 농도가 0이 되고, 반대쪽은 특정 농도가 되도록 하여 농도가 균일하게 변하도록 설정할 것입니다. 그리고 반대쪽 끝에 작은 구멍을 뚫어 이번 실험의 배출구로 사용하겠습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 세포 캡처 및 문화를 활성화할 수 있습니다 microfluidic 장치의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는 이러한 microfluidic 채널 내에서 홈과 같은 패턴 microstructures는 셀 수있는 부두 내에서 낮은 전단 응력 영역을 작성하는 데 사용됩니다.

세포 행동 유학을위한 그루브 패턴 Microfluidic 장치

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안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

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형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

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배우세요 미세유체 장치를 이용한 농도 구배 생성 방법으로 세포 이동성 연구를 수행하는 기술입니다. 이 프로토콜은 생물학적 미세환경 정밀 제어에 활용됩니다.

세포 생물학을위한 그라디언트 생성 Microfluidic 장치

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