Name: 세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 배우세요 수지상 세포에서 성숙을 유도하지 않고 siRNA를 이용한 효율적인 유전자 침묵화 방법을. 이 최적화된 뉴클레오펙션 프로토콜은 면역 반응 연구와 RIG-I 유전자 발현 조절 실험에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 NIH NIAID 계약 번호 HHSN2662000500021C에 의해 지원되었다. 우리는 그의 기술 지원 밍 첸 감사합니다.

1. 프로그램 Amaxa 96 잘 셔틀 Nucleofector <ol><li> 새 매개 변수 파일을 엽니다. </li><li> 당신이 96 잘 플레이트 그림 위에 커서를 드래그하여 표준 transfection에 사용됩니다 웰스의 번호를 선택합니다. 각 실험 샘플에 대해 수영장 3 웰스의 최소 사용합니다. </li><li> 입력 프로그램 코드 : part1 선택 'FF'와 파트에서 선택한 '168 '메뉴를 풀다운에서 </li><li> 솔루션 박스 선택 '단핵구, 인간'에서 </li><li> 제어 옵션에서 '표준'을 선택합니다. </li><li> 적용을 클릭합니다. </li><li> 노 transfection 컨트롤을 포함하려면 필요하고 제어 옵션에서 '없음 프로그램 제어'를 선택하지하고 적용을 클릭하면 다이어그램에서 더 이상 우물을 선택합니다. </li><li> 플레이트 다이어그램에 남아있는 사용하지 않는 우물을 선택하고 Undefine을 클릭합니다. </li></ol> 2. transfection에 대한 DC가 준비 <ol><li> 모든 작업은 가능한 세포 배양 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야합니다. 추가하여 nucleofection 솔루션을 준비 96 - 잘 450-2025의 비율에 인간 단핵구 96 잘 Nucleofector 솔루션을 보완. 믹스 룸 온도 따뜻한 수 있습니다. 당신은 당 잘 nucleofection 솔루션의 20μl가 필요합니다. 오류를 pipetting 수 있도록 10 %의 초과하십시오. </li><li> 당신은 행 1과 2에 첫 번째를 삽입 올바른 방향 IE에서는 nucleocuvette 판에 필요한 nucleocuvette 모듈의 개수를 놓습니다. </li><li> 실험을 위해 10 분 400g에 centrifuging에 의해 잘하고 펠렛 당 500,000 세포에 대한 계산에 필요한 DC가의 수를 결정합니다. 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. </li><li> 부드럽게 몇 번 아래 pipetting과로 nucleofection 솔루션에있는 세포를 Resuspend. </li><li> 특정 치료 예 글로 하는걸 - I에 대한 분류 eppendorfs로 resuspended 세포의 올바른 볼륨을 나누십시오. </li><li> pipetting하여 세포와 혼합 500,000 당 0.25μg siRNA를 추가합니다. 당신의 노 transfection 컨트롤 샘플이 아닌 타겟 siRNA를 사용합니다. </li><li> 귀하의 실험 레이아웃에 따라 nucleocuvette 모듈로 위의 혼합물의 피펫 20μl는, 액체를 보장하는 것은 우물의 바닥에 배달됩니다. </li><li> 뚜껑과 nucleocuvette 판을 차지하고 있으며 공기 거품의 제거를 보장하기 어려운 표면 몇번에 번호판을 누릅니다. </li></ol> 3. Transfect DC가 <ol><li> Nucleofector 96 - 웰 셔틀 트레이에 접시를 넣고 업로드를 클릭한 다음 시작합니다. </li><li> 무릎 톱 디스플레이에 transfection 과정의 진행률을 따라, 빨간색 배경에 검은 막대가 실패했습니다 의미 반면 녹색 배경에 검은 십자가, 그 우물에 성공적으로 transfection을 의미합니다. </li><li> transfection 과정의 완료에 접시를 제거하고 잘 멀티채널 피펫을 사용하여 각 DC 성장 매체의 80μl를 추가합니다. </li><li> 37 10 분 번호판을 품어 ° C와 5% CO 2. </li><li> 올바른 방향을 유지, 미리 예열 DC 성장 매체의 100μl를 포함하는 행렬 튜브로 nucleocuvettes에서 100μl 볼륨을 전송합니다. </li><li> transfection이 발생하지 않았 이러한 튜브를 제거하고 폐기. </li><li> 37 품어 ° C와 5% 24 시간 또는 기타 원하는 시간 간격에 대한 CO 2. </li></ol> 4. NDV와 세포를 감염 <ol><li> eppendorfs에 각 실험 샘플에 대한 인큐베이터에서 세포 배양 후드와 수영장 튜브에 매트릭스 튜브를 제거 </li><li> 펠렛 세포가 부드럽게 5 분 데스크 톱 원심 분리기의 회전에 의해하고하면 뜨는 제거합니다. </li><li> 뫄 1에 NDV를 포함하는 혈청없는 성장 매체에있는 세포를 Resuspend 37에서 품어 ° C와 느슨하게 살균 방식으로 덮여 eppendorfs와 5% 45 분에 대한 CO 2. </li><li> 80-10 H.위한 DC 성장 매체 900μl, 다시 품어 추가 </li></ol> 5. 수확 세포 <ol><li> 데스크 톱 원심 분리기에 eppendorfs 잔을 돌리면서 뜨는 제거하여 세포 펠렛. </li><li> 귀하의 프로토콜에 따라 RNA 또는 단백질 추출을위한 수확 세포. </li></ol> 6. 대표 결과 : 우리 최적화된 프로토콜을 사용하는 우리와 DC가를 transfected RIGI 타겟팅 인터페론 반응 경로를 자극하는 NDV (릭 - I에 의해 감지 paramyxovirus)으로 세포를 감염 후 24 H에 대한 siRNA를합니다. qRT - PCR 분석에 의해 우리는 전사 수준에서 75 % 유전자의 다운 노크 보여주었다. 우리는 또한 IFN 신호 계단식 찾으 - I의 스트림 이펙터입니다 IFNβ의 표현에서 유사한 감소를 관찰했다. 또한, 우리는 MxA, IFNβ 하류 응답 유전자의 그 (그림 1A)을 최소화하는 동안 비 감염 제어 transfected 세포에서 IFNβ의 표현이 감지되지 않았음을 관찰했다. 와 DC가의 두 번째 transfection RIGI 타겟 siRNA 것은 서양 얼룩 분석을 포함하는 충분한 세포를 사용하여 수행되었습니다. 어디RT - PCR 결과와 유사했다 우리가 (62 % 및 66% 장비 - I와 IFNβ 표현은 각각의 허물고) 이전에 본 것은 (그림 1B), 서양 얼룩이 유전자의 표현이되어 있다고 발표 전 - 릭에 대한 탐지 완전히 (그림 1C) 차단. <img src="/files/ftp_upload/2766/2766fig1.jpg" alt="그림 1A" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1A"> 그림 1. (A) MoDCs이 중 siRNA 타겟팅 transfected되었습니다 장비를 - I 또는 qRT - PCR에 의해 결정 릭 - I, IFNβ과 MxA의 표현에 특이 현상이 글로의 siRNA 및 효과. (-) transfection 프로토콜은 단핵구 특정 버퍼와 nucleoporation 프로그램 FF168 (Lonza 워커스빌 주) 24 H에 대해 다음과 부화를 사용, transfected 세포는 어느 NDV (+) 또는 왼쪽으로 감염되지 않은 감염되었습니다. 10 H에 대한 자세한 부화 후, 세포는 수확 및 RNA 추출 성적 수준은 두 복제 실험의 결과를 대표했다. 보울스 외 16 일부터 촬영. (B) 그림 1A에 사용되는 같은 다른 버피의 코트에서 얻은 MoDCs 다시와 transfected되었습니다 중 릭 - I - 타겟 siRNA 또는 위와 같은 transfection 프로토콜을 사용하여 특이 현상이 글로의 siRNA합니다. untransfected MoDCs를 사용하여 추가적인 제어 실험에 통합되었습니다. 모든 세포가 NDV 감염과 RNA 및 단백질 추출 모두 수확되기 전에 추가로 10 H에 대한 incubated 있었다 24 H 보육에 따라. 장비 - I, IFNβ 및 qRT - PCR에 의해 결정으로 MxA의 성적 수준은 두 복제 실험의 결과를 나타냅니다. 보울스 외 16 일부터 촬영. (C) 위의 그림 1B에 설명되어있는 세포에서 Lysates는 서양 얼룩에 의해 분석되었다. 레인스 1과 2는 untransfected 세포에서 lysates, 차선 3과 4는 글로의 siRNA transfected 세포에서 lysates, 차선 5 6 장비 - I - 타겟 siRNA와 transfected 세포에서 lysates. 샘플은 장비 - I에 대한 탐지 또한 GAPDH (로딩 제어 등)과 중복에서 실행 하였다. 보울스 외 16 일부터 촬영.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

나이브 기본 돌기 세포의 transfection 효율이 높은 처리량 분석 및 본래 - 적응 면역 전환을 중재이 핵심 세포 세포 염증 경로의 리버스 엔지니어링을 위해 중요합니다. 그러나, 대부분의 조사는 이러한 세포가 표준 transfection 기술을 사용하는 경우 모두 효율적으로 transfection 절차 유도 세포 성숙하지 않고 transfect하기 어려운다는 것을 찾을 수 있습니다. 우리는 이러한 제한이 동시에 독립 96 - 웰 상업용 핵 transfection 시스템 (Lonza)를 사용하여 높은 처리량 프로토콜 최적화에 의해 극복할 수 있는지 여부를 조사 하였다. 형광 활성 세포 분류 (외과)를 사용하여, 우리는 GFP - 표현 세포 성숙의 판독으로 transfection 효율과 CD86 및 MHCII immunoreactivity위한 표식으로 플라스미드를 측정했습니다. 궁극적으로&gt; 50 %의 transfection과 성숙 마커 증가의 부재를 보여주는 조건을 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 장비 / 시약 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 # </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector 96 - 웰 셔틀 </td><td> Lonza </td><td> 108S0109 </td><td> 일련 번호 </td></tr><tr><td> Amaxa 인간 단핵구 96 - 웰 Nucleofector 키트 </td><td> Lonza </td><td> VHPA - 2007 </td><td> 인간 단핵구 96 - 웰 Nucleofector 솔루션, 96 잘 보충하고 Nucleocuvettes과 접시를 포함 </td></tr><tr><td> 장비 - I siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> L - 012511-00 </td><td></td></tr><tr><td> 글로의 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D - 001600 - 01-20 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11,875 </td><td> 10% FCS와 보충이 MM L - 글루타민, 100 U / ML 페니실린 및 DC 성장 매체를 100 μg / ML 스트렙토 마이신 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11,965 </td><td></td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25030081 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> 소태아 혈청 </td><td> HyClone </td><td> 3070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 돌기 세포 </td><td> 뉴욕 블러드 센터 </td><td></td><td> DC가이 표준 절차를 사용하여 버피의 외투에서 정화 아르 </td></tr></tbody></table>

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 transfection을 위해 최적화된 프로토콜

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

돌기 세포 (DCS)은 자사의 개시 및 감염 1 반응에서 중요한 역할을 면역 시스템의 센티넬 간주될 수 있습니다. 나이브 DC가에 의해 병원성 항원의 검색은 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPS)로 불리는 특정 보존 구조를 인식할 수있는 패턴 인식 수용체 (PRRs)를 통해이다. DC가로 PAMPs가 탐지 성숙 DC가 자신의 활성화 및 변화의 결과로 세포내 신호 폭포를 트리거합니다. 이 과정은 일반적으로 다른 전염증성 크린 시토킨와 함께 제 1 형 인터페론의 생산이 특징입니다, 이러한 T 세포와 상호 작용이 적응 면역 반응 2을 시작 배수 림프절에 성숙한 DC의 MHCII와 CD86 및 마이 그 레이션과 같은 세포 표면 마커의 upregulation, 3. 따라서 DC가 그 본래 및 적응 면역 시스템을 연결합니다. 각종 병원균에 DC 응답을 기본 분자 네트워크를 해부하다하는 능력은 이러한 신호 경로의 규제 및 유도 유전자를보다 잘 이해하는 데있어 매우 중요합니다. 또한 전염병 및 종양에 대한 DC - 기반 백신의 개발을 용이하게 도움이 될 것입니다. 그러나, 연구의이 라인은 심각하게 기본 DC가 4 transfecting의 어려움으로 장애가되었습니다. 같은 lentiviral 시스템으로 바이러스 전달 방식은, 일반적으로 사용하지만, 이러한 복잡 성과 바이오 유해 위험 (관련 비용) 5,6,7,8 많은 한계를 가지고있다. 또한, 바이러스성 유전자 제품의 배달 DC가 9,10,11,12을 transduced 사람의 immunogenicity을 증가시킵니다. Electroporation은 혼합 결과 13,14,15와 함께 사용하지만, 우리는 높은 처리량 transfection 프로토콜의 사용을보고하고 결론의 유틸리티를 입증하는 최초되었습니다. 이 보고서에서 우리는 제한된 세포 독성 및 DC 성숙 16 부재와 함께, 인간의 기본 DC가의 높은 처리량 transfection을 위해 최적화된 상용 프로토콜을 요약합니다. Transfection 효율 (GFP 플라스미드의)와 세포 생존 능력은 각각 50 % 이상 70 % 였어요. qRT - PCR은 IFNβ 전혀 upregulation을 증명하지 동안 외과 분석, transfected 세포의 성숙 마커 CD86와 MHCII 표현 증가의 부재를 설립하였습니다. 이 electroporation 프로토콜을 사용하여, 우리는 siRNA와 효과적인 타겟 유전자의 허물고와 DC가 성공적으로 transfection에 대한 증거를 제공하는 장비 - I, mRNA와 단백질 수준 모두에서 핵심적인 바이러스성 인식 수용체 16,17.

우리는 세포 성숙을 유발하지 않고 플라스미드 DNA 나 siRNA 중과 기본 인간 단핵구 파생 돌기 세포를 transfecting의 효율적인 방법으로서 최적화된 높은 처리량 nucleofection 프로토콜을 제시한다. 우리는 더 타겟 유전자 mRNA와 단백질 수준 모두에서 릭 - 전의 성공적인 siRNA의 입을 대한 증거를 제공합니다.

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

수지상세포(Dendritic cells, DCs)는 면역 체계의 파수꾼으로 간주될 수 있으며, 감염에 대한 면역 반응의 시작과 대응에 결정적인 역할을 합니다1. 검출 ...

본 절차의 전체적인 목적은 SI RNA 형질전환(Transfection)을 통해 DCS 내 표적 유전자의 발현을 억제(knock down)하는 것입니다. 이는 우선 AM Maxin Nucleo 이펙터를 프로그래밍함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 DCS와 siRNA를 함께 혼합한 후, 결과물인 세포 용액을 Nucleo QVE 모듈에 피펫팅하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 transfection 과정을 시작하기 위해 플레이트를 amaxa 셔틀 트레이에 넣는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 인터페론 반응을 활성화하기 위해 세포를 바이러스로 감염시키는 것입니다. 최종적으로, quantitative R-T-P-C-R 및 Western blotting을 통해 유전자 knockdown을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 기술은 수지상 세포의 신호 전달 경로를 특성화하는 데 유용하며, 수지상 세포 기반의 면역 요법 개발에 기여할 수 있습니다. DC 형질전환을 위한 Maxon 96 웰 셔틀 뉴클레오 팩터를 프로그래밍하려면 새 파라미터 파일을 여십시오. 96 웰 플레이트 도표에서 커서를 드래그하여 표준 형질전환에 사용할 웰의 수를 선택하십시오.각 실험 샘플당 최소 3개의 웰을 풀링하여 사용하십시오. 이제 프로그램 코드의 파트 1에서 F, F를 선택하고 파트 2의 드롭다운 메뉴에서 1 68을 선택하십시오. 그다지 솔루션 박스에서 monocyte human을 선택한 다음, 컨트롤 옵션에서 standard를 선택하고 apply를 클릭하십시오.트랜스펙션 미실시 대조군을 포함하려면, 다이어그램에서 추가 웰을 선택해야 합니다. 그런 다음 컨트롤 옵션에서 프로그램 미실시 컨트롤을 선택하고 다시 적용을 클릭하십시오. 뉴클레오펙션 용액을 혼합한 후, 실온까지 따뜻해지도록 둡니다.필요한 수의 nucleo vete 모듈을 여기에 표시된 올바른 방향으로 nucleo VETE 플레이트에 배치합니다. 첫 번째 모듈을 1번 및 2번 행에 삽입한 후 나머지 모든 튜브에 대해 동일하게 진행합니다. 형질전환 시 웰당 500,000개의 세포가 되도록 세포 배양 플라스크에서 50 mL 튜브로 충분한 양의 DCS를 옮깁니다. 4 °C에서 400 G로 10분 동안 세포를 원심분리한 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 튜브에 nuclear affection 용액을 첨가하고 피펫으로 몇 번 부드럽게 위아래로 섞어 DCS를 재부유시킵니다.이제

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 자가포식 플럭스를 방해하는 작은 간섭 RNA(siRNA) 기반 기술을 보여줍니다. FIP200 mRNA를 표적으로 하는 siRNA는 전기천공법을 사용하여 단핵구 유래 미성숙 수지상 세포(iDC)에 도입되어 FIP200 발현을 knockdown하고 자가포식을 통해 핵 lamin 파괴를 억제합니다. 단순 헤르페스 바이러스(HSV)를 추가하면 자가포식 플럭스(autophagic flux)를 통한 라민 파괴가 없기 때문에 바이러스 자손의 핵 유출이 억제됩니다.

단순 포진 바이러스에 감염된 미성숙 수지상 세포에서 자가포식의 siRNA 기반 억제

종양 면역 요법에 사용하기 위해자가 수지상 세포의 큰 숫자 (DCS)를 생성하기위한 가장 일반적으로 사용되는 방법을 설명합니다. 방법은 단핵 세포에서 수지상 세포를 분화하는 IL-4, GM-CSF를 사용합니다. 그들은 환자에게 다시 주입하기 전에 미성숙 수지상 세포는 성숙하고 항원과 함께로드를 자극한다.

면역 요법에 대한 종양 항원로드 성숙 수지상 세포의 준비

여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.

항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성

이 프로토콜은 높은 세포 활력과 분화 및 편광에 대한 완전한 식세포 용량을 유지하면서 높은 형질 전환 효율로 전기 천공에 의해 또는 siRNA의 플라스미드 DNA와 함께 인간 대 식세포 THP-1을 형질 효율적이고 신뢰할 수있는 방법을 제시한다.

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

미성숙 수지상 세포는 내성과 내성 사이의 균형을 조절하기 위해 내성 또는 성숙 수지상 세포로 선택적으로 분화될 수 있습니다. 이 연구는 미성숙 단핵구 유래 수지상 세포(moDC), 체외 내성 및 성숙한 moDC(대사 표현형이 다른 moDC)를 생성하는 방법을 제시합니다.

대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

차세대 전기천공법은 유전자 발현과 세포 거동을 변경하기 위해 인간 Th17 세포를 작은 RNA로 형질 주입하는 효율적인 방법입니다.

차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질

이 문서에서는, 우리는 murine 골에 형광 성 융해 단백질의 표정에 대 한 자세한 프로토콜 파생 수지상 세포와 대 식 세포 제공 합니다. 메서드를 기반으로 골 수의 변환에 창시자 retroviral 구문 뒤에 대 식 세포로 분화 및 수지상 세포 생체 외에서.

Murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정

체 외 광 화학요법 (ECP)의 핵심 기능을 복제 하기 위해 실험 설정에서 생리 활성, 가변 수지상 생산을 가능 하 게 하는 (TI) 장치 또는 플레이트 및 관련 프로토콜이 개발 되었습니다. 암 면역 요법을 위한 세포 (DCs).

생리 적 면역 원 성 수지상 세포 생성을 위한 새로운 프로토콜

여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

이 프로토콜은 전사 인자 PU.1, IRF8 및 BATF3의 강제 발현을 통해 마우스 암세포를 종양 미세 환경 내에서 유형 1 수지상 유사 세포로 생 체 내 재프로그래밍하는 것을 설명합니다.

종양 세포를 제1형 기존의 수지상 세포 유사 세포로 다루기 쉬운 생체 내 재프로그래밍

배우세요 수지상 세포에서 성숙을 유도하지 않고 siRNA를 이용한 효율적인 유전자 침묵화 방법을. 이 최적화된 뉴클레오펙션 프로토콜은 면역 반응 연구와 RIG-I 유전자 발현 조절 실험에 활용됩니다.

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

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