세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 SI RNA Transfection에 의해 DCS에서 표적 유전자 발현을 knockdown하는 것입니다. 이는 먼저 AM Maxin Nucleo 이펙터를 프로그래밍하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 DCS와 siRNA를 함께 혼합하고 생성된 세포 용액을 Nucleo QVE 모듈에 피펫팅하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 플레이트를 amaxa 셔틀 트레이에 넣어 transfection 프로세스를 시작하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 세포를 바이러스로 감염시켜 인터페론 반응을 활성화하는 것입니다. 궁극적으로 정량적 R-T-P-C-R 및 웨스턴 블로팅을 통해 유전자 knockdown을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 기술은 덴드레틱 세포의 신호 경로를 특성화하는 데 유용하며 덴드레틱 세포 기반 면역 요법의 개발에 기여할 수 있습니다. DC 트랜스펙션을 위해 Maxon 96 well 셔틀 핵 인자를 프로그래밍하려면 새 파라미터 파일을 엽니다. 표준 transfection에 사용할 웰의 수를 96웰 플레이트 다이어그램 위로 커서를 드래그하여 선택합니다.

각 실험 샘플에 대해 풀링할 최소 3개의 웰을 사용합니다. 이제 파트 1에서 프로그램 코드를 입력하고 F, F 및 i 파트 2를 선택하고 풀다운 메뉴에서 1 68을 선택합니다. 그런 다음 솔루션 상자에서 control(제어) 옵션에서 monocyte human(단핵구 인간)을 선택하고 standard(표준)를 선택한 다음 apply(적용)를 클릭합니다.

no transfection control을 포함하려면 다이어그램에서 추가 well을 선택해야 합니다. 그런 다음 제어 옵션에서 프로그램 제어 없음을 선택하고 적용을 다시 클릭하십시오. nucleo affection solution을 섞은 후 실온으로 데우십시오.

첫 번째 모듈을 rose one과 two 에 삽입한 다음 다음 모든 튜브에 대해 동일한 방식으로 삽입하여 Nucleo VETE 플레이트에 필요한 Nucleo VETE 모듈의 수를 올바른 방향으로 배치합니다. 세포 배양 플라스크에서 50 밀리리터 튜브로 충분한 DCS를 옮겨 500, 웰 당 000 세포를 transfection 원심 분리하고 섭씨 4도에서 400G에서 10 분 동안 세포를 제거한 다음 조심스럽게 상등액을 제거합니다. 다음으로, 튜브에 핵 용액을 첨가한 다음 위아래로 부드럽게 몇 번 피펫팅하여 DCS를 다시 현탁시킵니다.

이제 수행할 특정 처리에 따라 DPH 튜브를 라벨링한 다음 재현탁 세포를 라벨링된 튜브로 나눕니다. 500, 000 세포당 0.25 마이크로그램의 최종 농도로 SI RNA를 적절한 epi endorf tubes에 첨가한 다음 피펫팅으로 세포 현탁액을 혼합합니다. no transfection control 샘플에 대해 비표적 SI RNA를 사용합니다.

그런 다음 이전에 프로그래밍된 실험 레이아웃에 따라 20마이크로리터의 SI RA DC 세포 현탁액을 nucleo vete 모듈로 피펫팅하여 액체가 웰 바닥으로 전달되도록 하고, nucleo vete 플레이트를 뚜껑으로 덮고, 기포를 제거하여 dcs를 transfection할 수 있도록 단단한 표면에 플레이트를 몇 번 두드립니다. 준비된 nucleo Yvette 플레이트를 nucleo effector 96 well 셔틀 트레이에 삽입합니다. 그런 다음 업로드 및 시작 버튼을 클릭합니다.

디스플레이에서 transfection 프로세스의 진행 상황을 따릅니다. 녹색 배경의 검은색 십자가는 해당 웰에서 성공적인 transfection을 의미하고, 빨간색 배경의 검은색 막대는 세포가 transfection되는 동안 실패했음을 의미합니다. Prewarm DC 성장 배지 transfection 프로세스 완료 후 플레이트를 제거하고 각 웰에 80마이크로리터의 prewarm DC 성장 배지를 추가합니다.

이제 멀티채널 피펫을 사용하여 섭씨 37도 및 5%CO2에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 기간 동안 100마이크로리터의 예열 DC 성장 배지를 설정된 핵 큐벳 플레이트와 동일한 방향으로 매트릭스 튜브에 추가합니다. 배양 기간이 지난 후, nucleo CVEs에서 100마이크로리터의 세포 현탁액을 모두 사전 준비된 매트릭스 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 transfection이 발생하지 않은 튜브를 제거하고 폐기합니다. 마지막으로, 매트릭스 튜브를 24시간 또는 원하는 다른 시간 간격으로 배양합니다. 각 incubating matrix tube에 대한 einor tubes에 레이블을 지정합니다.

그런 다음 매트릭스 튜브를 인큐베이터에서 세포 배양 후드로 옮기고 각 실험 샘플의 매트릭스 튜브를 사전 라벨링된 eend dfs에 풀링합니다. 다음으로, 데스크탑 원심분리기에서 eend DPH 튜브를 10분 동안 회전시켜 세포를 부드럽게 펠릿화합니다. 400G에서, 뉴캐슬 병 바이러스 또는 NDV를 함유 한 혈청없는 성장 배지에서 세포를 느슨하게 1의 MOI로 snat resuspension 제거합니다.

에피 엔돌핀을 멸균 방식으로 덮은 다음 45분 동안 튜브를 배양합니다. 이 배양 기간이 끝나면 900마이크로리터의 DC 성장 배지를 추가하고 튜브를 다시 8-10시간 동안 다시 배양합니다. 형질주입 및 감염된 dc를 채취합니다.

이전과 같이 데스크탑 원심분리기에서 einor 튜브를 회전시켜 세포를 펠렛화하고 snat 단핵구를 제거하고, dcs를 RIG I 또는 비특이적 글로우 irna를 표적으로 하는 IRNA로 형질주입하고 플러스 기호로 표시된 NDV에 감염되었거나 플러스 기호로 표시된 바와 같이 NDV에 감염되지 않은 상태로 유지되었거나, R RGA의 정량적 R-T-P-C-R-A 녹다운에 의해 검출된 바와 같이 감염되지 않은 상태로 유지되었으며, 전사 수준에서 다음의 발현이 유사한 감소를 관찰했습니다. 인터페론 베타. 인터페론 신호 캐스케이드에서 RGA의 다운스트림 효과기도 관찰되었습니다. 또한, 감염되지 않은 대조군 형질주입된 세포에서 인터페론 베타의 발현은 검출할 수 없었습니다.

MXA와 인터페론 베타 다운스트림 반응 유전자의 다운스트림 반응 유전자는 미미했습니다. 여기. 이전 그림과 같이 수행된 irna를 표적으로 하는 rigi를 사용한 DCS의 두 번째 형질주입 데이터가 이 실험에 나와 있습니다. 그러나 모든 세포가 NDV에 감염되어 절제되지 않은 단핵구 DCS를 사용하는 추가 대조군이 통합되었습니다.

유전자 침묵 결과는 이전 그림에서 관찰된 것과 유사했습니다. RGA를 조사한 웨스턴 블롯은 이 유전자의 단백질 발현이 완전히 차단된 것으로 밝혀졌습니다. 1번 및 2번 레인은 절제되지 않은 세포의 용해물에 대한 데이터를 보여줍니다.

3번 및 4번 레인은 glow irna 형질 주입된 세포의 용해물을 보여주고, 5번 및 6번 레인은 S irna를 표적으로 하는 RIG I으로 형질 주입된 세포의 용해물을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 많은 유전자를 동시에 knockdown하는 것을 포함하여 1시간 내에 완료할 수 있습니다.