Name: 바이러스 기반 Cre 호텔의 재조합을 사용하여 출생 후의 마우스 두뇌 개발의 유전자 기능의 모자이크 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 배우세요 출생 후 뇌 발달에서 유전자 기능을 조작하는 방법을 신생아 마우스에 바이러스를 주사하여 모자이크 유전자 불활성화와 희소 신경 라벨링을 달성하는 기술입니다. 이 방법은 신경 회로 발달에서 유전자 기능을 연구하는 데 도움이 됩니다.

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1. 주사 준비 바이러스 <ol><li> rAAVs은 권장 상업 공급 업체에서 구입한 있었으나, 그들은 또한 (아래 토론을 참조) 자신의 연구실에서 생산 수 있습니다. 바이러스 솔루션은 일반적으로 밀리리터 당 ~ 1x10 12 게놈 사본 (GC / ML)의 titer에서 생산하고 세포의 큰 숫자를 조작하는 전체 titer에서 사용할 수 있습니다. 또는, 그들은 스파스 라벨의 원하는 수준을 생산하는 희석 수 있습니다. 적절한 희석은 사용자에 의해 결정되어야합니다,하지만 1시 10분 희석을 시작하는 것이 좋습니다. </li><li> 사용하기 전에 즉시 얼음에 바이러스를 녹여. 소형 (~ 250μl) PCR 튜브에 바이러스 솔루션의 원하는 미리 희석 볼륨을 전송합니다. 조직 문화 후드의 살균 DPBS의 적절한 볼륨을 사용하여 바이러스 솔루션을 희석. 그것이 필요 때까지 얼음에 희석 바이러스 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 참고 : 모든 바이러스의 처리는 기관의 승인을 biosafety 프로토콜에 따라 실시되어야합니다 2. 주사기 로딩 및 장비 조립 <ol><li> 부드럽게 플런저를 당기는하여 유리 주사기로 로딩 바늘을 연결하여 PCR 튜브에서 바이러스 솔루션을 그립니다. 공기의 매우 작은 기포가 주사기에서 볼 수있을 때까지 플런저를 당겨,이 솔루션의 모든 주사기에 있으며 로딩 바늘에 남아되지 않았음을 나타냅니다. 또는 불활성 염료의 작은 금액이 표시되도록하기 위해 솔루션에 추가할 수 있습니다. 참고 : 작은 PCR 튜브가 로딩 바늘은 일반적으로 대부분의 다른 튜브의 바닥에 도달하는 정도로 그리 길지 않을 것이기로 사용해야합니다. </li><li> 로딩 바늘을 제거하고 주사기 리테이너로 확보, 주사기 펌프의 주사기 블록에 주사기를 놓으십시오. </li><li> 부드럽게 주사기로 결합 튜브의 한쪽 끝을 삽입하고, 바늘 홀더에 다른 쪽 끝을 삽입합니다. 바늘 홀더에 주사 바늘을 삽입합니다. 사출 바늘의 끝을 직접 바늘 홀더의 결합 튜브 내부의 끝을 문의하시기 바랍니다. </li><li> 천천히 결합 튜브를 통해 솔루션을 눌러 수동으로 플런저를 우울. 솔루션의 작은 방울이 분사 바늘의 끝에 표시됩니다 때까지 누르십시오. </li><li> 조심스럽게 푸셔 블록 옆에있는 플런저의 위치와 푸셔 블록 브래킷과 장소에 안전. </li><li> 사출 매개 변수를 설정 : 사출 속도는 약 8μl/min (~ 130nl / s)로한다, 주입 부피는 일반적으로 1 - 2ul되며이 (지침에 대한 주사기 펌프 설명서를 참조)를 사용하는 주사기의 크기에 해당하는 주사기의 직경을 선택합니다. </li><li> 열판을 설정 ~ 38 ° C 및 복구 단계에서 새끼를 보호하기 위해 종이 타월이나 얇은 장벽과 커버. </li></ol> 3. 사출 절차와 펍 복구 <ol><li> IACUC 승인된 프로토콜을 다음과 추위 마취에 쓰는하여 주사 P0 또는 P1 마우스 새끼를 준비합니다. 얼음 물 장소 몇 종이 타올을 저해할. 종이 타월 (그들이 잘 분리 보관)에 새끼의 원하는 숫자 (4-5)를 놓고 그들이 젖은 종이 타월이 적용되도록 부드럽게 새끼 위에 종이 수건을 접어. 부드럽게 종이 타올 위에 얼음 조각의 작은 금액을 넣고 약 5 분 동안 새끼를 부화. 새끼는 최대 15 분 동안 얼음에 보관하고 나중에 잘 복구할 수 있습니다. </li><li> 강아지가 충분히 anesthetized 후 장착 블록에 배치 (우리가 일반적으로 15ml 튜브를 가지고 스티로폼 블록을 사용) 및 사출 사이트에 최고의 접속을 위해 위치. 피질에 대한 그것은 소뇌에 대한 그것은 두개골의 뒤쪽에 더 나은 액세스를 제공하기 위해 블록의 가장자리 이상의 강아지 머리를 위치에 도움이되는 동안, 그 배꼽에있는 동물의 아파트를 마련하기 쉬운 것입니다. 원하는 경우 강아지는 반창고와 장소에 안전하게있을 수 있습니다. </li><li> 바늘이 수동으로 다른 손으로 원하는 사이트의 두개골을 통해 삽입하는 동안 한 손으로 장소에있는 강아지 머리를 잡아. 주입하는 동안 이동에서 그것을 방지하기 위해 피부가 꽉 끌어 도움이 그것입니다. 피질의 경우 이것이 미래의 주사에 도움이되므로, 같은 두개골의 람다 봉합으로 잘 정의된 해부의 랜드마크에 상대적인 주사를 확인하는 데 유용합니다. 소뇌는 조직이 colliculus 직접 꼬리 거짓말 얇은 스트립으로 두개골을 통해 볼 수 있습니다. 바늘을 삽입해야하는 깊이가 각각의 동물과 종자 사이에 약간 차이가 있으며 바늘에 미리 정해진 마커에 의해 gauged 수 있지만 피질과 소뇌에 대해 우리는 ~ 0.5의 깊이 발견 - 표면에서 1mm 일반적으로 적합합니다. 다른 사이트에 대한 삽입 깊이는 최종 사용자에 의해 실험적으로 결정되어야합니다. 참고 : 바늘이 쉽게 두개골을 관통해야한다 그렇지 않으면이 동물을 다칠 수로 너무 세게 누르지 마. 바늘 위치를 조정하고 부드럽게 다시 시도하십시오. </li><li> 바이러스 솔루션을 주사. 주입이 시작됩니다펌프에있는 시작 버튼을 누르면하거나 발을 페달을 우울, 인젝터는 사용 압력의 모델에 따라 의해 에드. 발 페달의 부재에서,이 동료는 주사에 영향을 미칠 수 불필요한 손 움직임을 최소화하기 위해 버튼을 누르면 도와하도록 권장합니다. </li><li> 선택한 볼륨이 주입되고 나면, 몇 초 동안 위치에 바늘을 유지하고 부드럽게 원활하게 그것을 슬라이딩하여 바늘을 제거합니다. 관계없는 움직임을 최소화하기 위해 자리에있는 강아지 머리를 잡아주십시오. 사출 장비 세척 및 소독 에탄올과 실험 사이의 상처가 작고 때문에, 살균의 사용은 불필요합니다. </li><li> ~ 38의 온도 설정으로 덮여 열판에 강아지를 놓고 ° C 복구, 일반적으로 50-10분 위해 따뜻하게합니다. 이 시간 동안 다른 새끼를 넣고 계속 사용할 수 있습니다. </li><li> 새끼 모든 회복 후에 (그들은 분홍색과 이동해야합니다) 홈 침구의 일부를 가지고 부드럽게 그것으로 새끼를 문지 르세요. 그룹으로 엄마와 새끼를 반환합니다. </li></ol> 참고 : 새끼가 엄마에게 반환하고 그룹으로 그들을 반환하기 전에 따뜻한 가정 침구에 노출되도록하는 것이 매우 중요합니다. 이렇게하지 ​​않으면 새끼를 손상하거나 죽이는 어머니가 발생할 수 있습니다. 4. 장비 세척 <ol><li> 주입이 완료되고 새끼가 어미로 반환되었습니다 후, 완전히 아세톤 또는 70 % 에탄올로 주사기를 로딩하여 사출 설정을 청소하십시오. 신선한 솔루션 때마다을 사용하여 사출 설정 여러 번을 통해 솔루션을 플러쉬. 이것은 남아있는 바이러스 솔루션을 제거하고 precipitates 것입니다. 아세톤이나 에탄올 다음 증발됩니다. 참고 : 아세톤이 청소 선호하지만 설치가 같은 cyanoacrylate 접착제 같은 아세톤에 민감한 구성 요소를 사용하는 경우, 다음 단계에 대한 70 % 에탄올을 사용하는 것입니다. </li><li> 적절한 생물 학적 용기에 표백제 및 폐기 쓰레기와 작업 공간을 소독. </li></ol> 5. 분석 <ol><li> IACUC 승인 안락사 방법을 사용하여 원하는 나이에 동물을 희생. 재관류의 고정은 특히 성인 동물에 감염 뉴런, 이후 시각화에 도움을 권장합니다. </li><li> 표준 immunostaining 절차는 형광 신호를 증폭하는 데 사용할 수 있습니다. 간단히, vibratome 섹션을 떠 100 μm의는 PBS 1퍼센트 트리톤 X - 100 permeabilized 및 PBS 1% 트리톤 X - 100 10% 정상 염소 혈청으로 차단됩니다. 제 4에서 하룻밤 일차 항체 ° C, 세탁 및 차단 추가하여 다음과 솔루션을 차단에 incubated 수 있습니다. 섹션은 다음 상온에서 2 시간 동안 차 항체와 솔루션을 차단에 incubated 철저하게 씻어, 슬라이드에 장착 및 안티 페이드 설치 미디어 coverslipped 있습니다. Cryosections도 레이블 뉴런을 시각화하는 데 사용할 수있는, 그러나 내생 형광가 손실되었을 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : 성공적인 분사 절차없이 관찰할 수있는 조직 손상이나 동물에서 다른 병에 효과와 주입 사이트의 영역에서 뉴런의 강력한 감염을 생산합니다. 그림 1에서 그림과 같이, 감염의 확산은 다양한 해부 사이트에 rAAV8 - Cre 호텔로 주입 Cre 호텔 - 기자 마우스 (ROSA26R) 12 볼 수 있습니다. 이러한 대뇌 피질과 우수한 colliculus과 같은 특정 지역에 주사는 일반적으로 인접 지역 (그림 1A - B)에 최소한의 확산과 지역 감염을 생성합니다. 높은 titer의 바이러스 솔루션의 사용 (그림 1A) 가능성이 더 높습 같은 해마와 같은 인접 지역의 감염을합니다. ROSA26R 기자 마우스 (그림 1C - D)의 정중선에서 rAAV8 - Cre 호텔의 소뇌 주입과 같이 일반적으로, 사출 현장 근처 남아 스파스 감염의 낮은 titer 바이러스 솔루션 결과와 사출. 우리는 기자의 유전자의 감염, 재조합, 그리고 표현식이 모두 상대적으로 빠르게 발생할 수 제안, rAAV8 - Cre 호텔의 주사 후 2 일 이내에 ROSA26R 기자 마우스의 재조합을 관찰했습니다. 또한, 우리가 성공적으로 floxed 조건부 allele를 사용하여 비 로사 로커스에서 유전자 삭제의 효과를 연구하기 위해이 기술을 사용한의 결과가 다른 게시됩니다. 감염된 세포의 숫자는 주입된 바이러스 솔루션의 titer와 상관 관계한다. 예를 들어, 소뇌에 서로 다른 형광 단백질을 표현하는 두 rAAV8 바이러스의 높은 titer 솔루션의 믹스를 주입하는 것은 differentially (그림 2A) 표시 여러 Purkinje 세포를 감염. 반대로, 낮은 titer 바이러스 솔루션을 주입하는 것은 하나의 세포 (그림 2B) 시각에 투입 스파스 감염이 발생할 수 있습니다. 찬란 분류 뉴런은 신선한 컷, 살아있는 조직 (그림 2B)에서 직접 관찰할 수있다 또는 넓은 필드 또는 공동으로 나중에 이미지 수집을위한 내생 형광 신호를 향상시키기 위해 immunostaining를 받게 될 수 있습니다n 초점 형광 현미경 (그림 2A, 그림. 3A - C). 마지막으로, rAAV8 잘 프로세스의 강력한 라벨 (그림 3A - C)와 피질의 신경 세포 유형의 다양한 감염이 가능합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : P0에서 rAAV8 - Cre 호텔로 주입되었다 ROSA26R 기자 마우스의 두뇌에 LacZ의 얼룩은 Cre 호텔의 활동과 감염의 위치를 보여줍니다. <ol type="A"><li> 높은 titer (1x10 12 GC / ML) 피질과 우수한 colliculus로 주사를 보여주는 P14 두뇌의 넓은 분야 화살 볼 수 있습니다. 높은 titer의 바이러스의 사용은 인접 지역도 감염된다는 것이 더 가능성이 있습니다. </li><li> P14 피질의 화살 섹션은 바이러스가 확산 적은 비용으로 현지 감염을 보여줍니다 낮은 titer (1x10 11 GC / ML)로 주입. </li><li> 낮은 titer과 정중선 (1x10 9 GC / ML) 바이러스 솔루션에 주입 P28의 소뇌의 wholemount보기는 감염이 스파스이며 일반적으로 사출 현장 근처에서 유지 보여줍니다. </li><li> C에서 소뇌의 정중선의 화살보기). 일반적으로 전용 Purkinje 세포 rAAV8에 의해 감염됩니다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 형광 단백질을 표현 rAAV8 높은 낮은 titers와 함께 주입하여 소뇌 라벨. <ol type="A"><li> EGFP (녹색) 및 DsRed (적색)을 표현하는이 바이러스의 혼합 감염 P21cerebellum의 화살 섹션을 참조하십시오. 바이러스의 높은 titer 믹스는 Purkinje 세포의 다수를 감염하는 데 사용되었다. </li><li> 매우 낮은 titer 바이러스 감염에서 살고 P14 소뇌의 purkinje 세포는 즉시 절개 후 몇 군데. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 : rAAV8 - DsRed하여 두피 라벨. P0에서 rAAV8 - DsRed에 의해 감염 P21 피질의 코로나 섹션에서 대뇌 피질의 신경 세포 유형의 다양한 예.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 신생아 바이러스성 주입 방법은 출생 후의 두뇌 개발의 연구에 대한 생체내 모자이크에서 생성하는 간단하고 빠른 방법을 제공합니다. 방법은뿐만 아니라 현재 프로젝트 6 타겟팅 높은 처리량 진을 통해 만들어지고있는 이들 사용할 수 있습니다 floxed 대립 형질을 활용합니다. Cre 호텔의 형질 표현의 사용에 비해이 방법은 floxed 대립 유전자를 가지고 생쥐가 실험에 직접 사용할 수있는 등, 다양한 셀 유형의 유전자 기능을 테스트하는 빠른 방법을 제공하고,에서 전체 바이러스 주입 절차는 완료 시작할 수 있습니다 한 시간 안에 달성. 또한, 감염된 세포의 수를 쉽게 개별 뉴런의 스파스 라벨을 수있는 바이러스의 titer를 변경하여 제어할 수 있습니다. 우리는 샘플 이미지의 연결 형태를 설명하지만, 감염된 뉴런의 분석은 분기와 기와,뿐만 아니라 척추 morphogenesis으로 시냅스 개발, axonal 및 돌기의 성장 등 많은 중요한 발달 과정에 확장하실 수 있습니다. <p ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> rAAV8 - Cre 호텔, - GFP, - DsRed, </td><td> 벡터 Biolabs </td><td> # 7060, # 7061, 맞춤 주문 </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> 하버드 펌프 11 플러스 </td><td> 하버드 장치 </td><td> # 702208 </td><td> (발이 페달 포트) </td></tr><tr><td> 망막 안료 상피 주입 키트 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> RPE - KIT </td><td> 결합 튜브, 사출 바늘 (36G), 그리고 바늘 홀더 포함 </td></tr><tr><td> NanoFil 주사기, 100μl </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> NANOFIL - 100 </td><td> 재사용 로딩 바늘 포함 </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP 항체 </td><td> 에이브스 </td><td> GFP - 1020 </td><td></td></tr><tr><td> DsRed 항체 </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> 가열 블럭 </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R 마우스 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

바이러스 기반 cre 호텔의 재조합을 사용하여 출생 후의 마우스 두뇌 개발의 유전자 기능의 모자이크 분석

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

신경 회로가 성숙하고 세련된 때 정상 뇌 기능은 출생 후의 개발뿐만 아니라 주요의 연결 경로가 설정됩니다 배아 발달에 의존하지만. 이 단계에서 Misregulation는 자폐증과 정신 분열증의 1,2로 신경 및 정신 장애가 발생할 수 있습니다. 많은 유전자가 태아 뇌에서 공부하고 많은 발달 과정을 3-5으로 중요한 발견되었습니다. 그러나, 출생 후의 두뇌에서 기능은 생쥐에서 삭제가 자주 신생아 개발 중에 파괴 장면을 보여 주죠에 이르게 일부 있기 때문에, 그리고 초기 개발에 자신의 요구 사항이 출생 후의 분석을 초래할 일부 있기 때문에, 대부분 알 수 있습니다. 이러한 장애물을 극복하려면 유전자의 대립 유전자는 현재 floxed 생쥐 6 생성되고있다. 표현 Cre 호텔 recombinase는 특정 세포 종류에 조건부 삭제는 출생 후의 두뇌에서 유전자 기능을 연구하기 위해 얻을 수있는 유전자 변형 대립 유전자와 결합하는 경우. 그러나,이 방법은이를 마우스 두뇌의 규모에 유전자 분석의 확장을 제한, 추가 대립 유전자 및 여분의 시간 (3-6개월) 적절한 genotypes와 마우스를 생성해야합니다. 여기 우리는 출생 후의 두뇌 개발에 신속하게 그리고 체계적으로 이러한 floxed 대립 유전자 연구를 virally - Cre 호텔 표현을 사용하는 보완 방법을 보여줍니다. 신생아 두뇌에 재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAVs) 7,8 인코딩 Cre 호텔을 주입함으로써, 우리는 두뇌의 다른 지역에 대한 관심의 유전자를 삭제할 수 있습니다. 바이러스 titer를 제어 및 형광 단백질 마커를 coexpressing함으로써, 우리는 동시에 모자이크 유전자 불활 성화 및 스파스의 연결 라벨을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 분기와 기와뿐만 아니라 버렸네 형성 및 개선, 초기 개발에 많은 유전자의 요구를 무시하고, 우리 axonal 및 돌기의 성장을 포함하여 출생 후의 두뇌 개발에 많은 중요한 과정에서 세포 자율 기능을 공부하실 수 있습니다. 이 방법은 우리 자신의 연구실에서 (미발표 결과) 등 8,9에서 성공적으로 사용되었으며, 같은 lentivirus 9뿐만 아니라 shRNA 또는 지배 활성 단백질 10의 표현에 다른 바이러스에 확장될 수 있습니다. 또한, 전기 생리학이 기술을 결합뿐만 아니라 최근에 개발된 광학 이미징 도구 11,이 방법은 유전자 경로가 마우스 및 쥐의 신경 회로 개발과 기능에 영향을 미치는 방법을 연구하기 위해 새로운 전략을 제공합니다.

<em&gt; 생체내에</em출생 후의 두뇌에서 유전자 기능을 테스트하는&gt; 방법을 설명합니다. Cre 호텔 및 / 또는 형광 단백질을 표현하는 재조합 AAVs는 신생아 마우스 두뇌에 주입하고 있습니다. 모자이크 유전자 불활 성화 및 스파스의 연결 라벨이 신경 회로 개발에 중요한 공정에서 유전자 기능의 빠른 분석을 허용, 달성하고 있습니다.

바이러스 기반 Cre 호텔의 재조합을 사용하여 출생 후의 마우스 두뇌 개발의 유전자 기능의 모자이크 분석

정상적인 뇌 기능은 주요 신경 경로가 형성되는 배아 발달뿐만 아니라, ...이 이루어지는 출생 후 발달에도 의존합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 뇌 발달의 출생 후 기간 동안 유전자 기능을 조작하는 것입니다. 이는 먼저 적절한 바이러스를 선택 및 준비하고, 이를 주사기에 넣고 주사 장비를 준비함으로써 수행됩니다. 그 다음 바이러스를 갓 태어난 생쥐 새끼의 뇌에 주입하며, 마지막 단계로 동물을 희생시켜 주입 부위를 이미지화합니다.최종적으로 면역형광 현미경법을 통해 대조군 세포와 녹아웃 세포의 차별적 표지를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 출생 후 발달 기간이 어떻게 유전적으로 조절되는지와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 주사를 위해, 많은 수의 세포를 조작하기 위해 일반적으로 1mL당 10¹² genome copies의 전체 타이터(full titer)를 가진 상용 아데노 부속 바이러스 용액을 사용할 수 있습니다.희소하게 처리하거나 표지가 필요한 경우, 1:10 희석부터 시작하십시오. 얼음 위에서 바이러스를 해동한 후, 즉시 희석 전 부피를 멸균된 250 microliter PCR 튜브로 옮기십시오. 희석액은 계속 얼음 위에 보관하십시오.적절한 시린지를 선택하고 이를 로딩 니들에 연결하여 주입 펌프를 준비합니다. 그다음, 시린지에 아주 작은 기포가 보일 때까지 바이러스 용액을 천천히 흡입하며, 이 단계에서 불활성 로딩 다이를 사용하면 작업이 더 수월해질 수 있습니다. 이제 리테이너를 사용하여 시린지를 펌프에 고정합니다.그 다음 주사기와 니들 홀더 사이에 연결 튜브를 조심스럽게 연결합니다. 이때 주사 바늘이 니들 홀더 내부의 연결 튜브와 직접 접촉하고 있는지 확인하십시오. 이제 솔루션이 바늘 끝에 작은 한 방울 보일 때까지 연결 튜브를 통해 천천히 이동시킵니다.펌프의 브래킷을 사용하여 푸셔 블록 옆의 플런저를 조심스럽게 고정합니다. 주입 속도를 8 µL/min으로 설정하고, 주입 부피를 1~2 µL 사이로 설정합니다. 그런 다음 사용하는 시린지의 직경과 일치하도록 펌프의 시린지 직경 설정을 조정합니다.마지막으로, 회복 단계 동안 새끼 쥐를 보호하기 위해 핫플레이트를 38 °C로 설정하고 페이퍼 타월로 덮어줍니다. IACUC 승인 프로토콜에 따라, 새끼 쥐(P0 또는 P1)를 저온 마취시켜 주사 준비를 합니다. 페이퍼 타월 몇 장을 물로 적신 후 얼음 위에 올려둡니다.그런 다음 네다섯 마리의 새끼 쥐를 키친타월 위에 서로 충분히 떨어뜨려 놓습니다. 새끼 쥐 위로 키친타월을 조심스럽게 덮고, 키친타월 위에 소량의 잘게 부순 얼음을 올린 뒤 약 5분 동안 새끼 쥐를 안정한 상태로 둡니다. 새끼 쥐는 최대 15분까지 얼음 위에 안전하게 유지할 수 있으며, 이후에도 원활하게 회복될 수 있습니다.이제 주사 부위에 가장 쉽게 접근할 수 있도록 마취된 새끼 쥐를 고정 블록 위에 배치합니다. 예를 들어, 동물을 배가 아래로 향하게 평평하게 눕히면 피질에 가장 쉽게 접근할 수 있습니다. 반창고를 사용하여 새끼 쥐를 고정할 수 있으며, 새끼 쥐의 머리를 수동으로 안정시키고 피부를 팽팽하게 당겨 움직이지 않도록 합니다.그 다음 람다 봉합선(lambda suture)과 같은 두개골의 해부학적 지표를 확인하고, 다른 한 손으로 재현 가능한 주입 지점을 선택하여 바늘을 두개골에 천천히 삽입합니다. 바늘이 두개골을 쉽게 통과하지 않을 경우 세게 밀지 마십시오. 대신 바늘의 위치를 조정하여 다시 조심스럽게 시도하십시오.피질의 경우 주입 깊이는 개별 동물과 계통마다 약간씩 다르나, 보통 0.5~1 mm 깊이가 적절합니다. 이제 손의 움직임을 최소화하기 위해 동료가 펌프를 작동시키도록 하여 바이러스 용액을 주입하십시오. 가급적이면 풋 페달을 사용하여 주입 후 펌프를 작동시키는 것이 좋습니다.바늘을 몇 초 동안 그대로 유지한 다음, 강아지의 머리를 부드럽게 고정한 상태에서 바늘을 천천히 뽑아냅니다. 이제 덮개가 덮인 가열판 위에서 강아지가 5~10분 동안 회복하도록 둡니다.이 시간 동안 다른 새끼들에게 계속해서 주사를 놓으십시오. 새끼들이 모두 분홍색을 되찾고 움직이기 시작하면, 원래의 베딩 일부로 새끼들을 부드럽게 문질러 줍니다. 그 후에만 새끼들을 어미에게 돌려보낼 수 있습니다.그렇지 않으면 이들은 낯선 새끼로 취급될 수 있으며, 새끼들이 어미에게 돌아간 후 어미가 이들을 죽일 가능성이 매우 높습니다. 주사기를 아세톤 또는 70% ethanol로 완전히 채워 주입 장치를 세척하십시오. sano, acurate, 접착제와 같이 아세톤에 민감한 구성 요소가 사용된 경우, 매번 새 용액을 사용하여 주입 장치에 용액을 여러 번 흘려보내십시오.이렇게 하면 남아 있는 바이러스 용액과 침전물이 제거되며 용매가 증발하게 됩니다. 설정을 세척한 후, 다음 실험자가 사용할 수 있도록 표백제로 작업 구역을 소독하십시오. 숙련된 기술을 통해 주입 부위에 강력한 뉴런 감염을 유도할 수 있습니다.피질 및 상구와 같은 특정 부위에 주입하면 일반적으로 인접 부위로의 확산이 최소화된 국소 감염이 유도됩니다. 고역가 바이러스 용액을 사용하면 해마와 같은 인접 영역의 감염 가능성이 높아지는 반면, 저역가 바이러스 용액을 주입하면 일반적으로 정중선에서의 소뇌 주입과 같이 주입 부위 근처에 희소한 감염이 나타납니다. 감염된 세포의 수는 주입된 바이러스 용액의 역가와 상관관계가 있어야 합니다.예를 들어, 서로 다른 형광 단백질을 발현하는 두 가지 R AAV eight 바이러스의 고역가 용액 혼합물을 소뇌에 주입하면, 서로 다르게 표지된 많은 Purkinje 세포를 감염시킬 수 있습니다. 반대로, 저역가 바이러스 용액을 주입하면 단일 세포 시각화를 돕기 위해 드문드문 감염시키는 결과를 얻을 수 있습니다. 형광 표지된 뉴런은 신선하게 절단된 살아있는 조직에서 직접 관찰하거나, 면역 염색을 수행할 수 있습니다.이는 광시야 또는 공초점 형광 현미경을 이용한 이후의 이미지 획득을 위해 내인성 형광 신호를 강화합니다. 마지막으로, RAAV eight은 피질의 다양한 뉴런 유형을 감염시킬 수 있으며 미세 돌기를 강력하게 표지합니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 약 30분 만에 완료할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

synaptically 연결 뉴런을 추적하는 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 관심의 세포 인구가 유전자 정의 셀 유형에서 시냅스 입력을 받고 있는지 여부를 조사하기 위해 상류 세포의 TVA의 특이성을 사용합니다.

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

바이러스 성 벡터는 타겟 유전자 조작을 위해 수 있습니다. 우리는 등쪽 뿔에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주입, 기본 somatosensory afferents 및 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 접촉의 눈에 잘 띄는 사이트를 사용하여 조건부 유전자 발현 또는 마우스 척추 절제하는 방법을 보여줍니다.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

여기서 우리는 신생아 마우스 뇌에 아데노 관련 바이러스를 뇌실 내 주입하여 광범위한 신경 세포 전달을 위한 기술을 보여줍니다.  이 방법은 바이러스로 전달된 transgenes의 평생 발현을 달성하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

이진 유전 전략을 활용하여 Cre 매개 재조합 후 상보적 시냅스 경진 추적자를 발현하는 마우스의 신경 회로 추적을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 세포 특이적 추적자 생산은 유전적으로 암호화되기 때문에 당사의 실험적 접근 방식은 단일 세포 해상도에서 쥐 배아 뇌 발달 중 신경 회로의 형성 및 성숙을 연구하는 데 적합합니다.

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

여기에서는 신경 줄기세포에 대한 세포 자율 및 비자율적, 틈새 의존적 효과를 별도로 분석할 수 있는 성인 심실-심실하 신경인성 틈새에서 신경 줄기 세포 및/또는 인접한 뇌실막 세포의 장기 유전자 변형을 위한 렌티바이러스 입자의 사용을 기반으로 하는 절차를 설명합니다.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

이 프로토콜은 방사형으로 이동하는 피질 뉴런의 직접 관찰에 대한 지침을 제공합니다. utero electroporation, organotypic 슬라이스 문화, 그리고 시간 경과 공 촛점 이미징은 결합 뉴런에 관심 유전자의 overexpression 또는 downregulation의 효과를 직접적이고 동적으로 연구하고 개발하는 동안 그들의 차별을 분석합니다.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

두뇌에 있는 유전자의 세포 자치 기능 손실을 유도 하 여 공부 될 수 있다 또는 셀의 스파스 인구에 있는 기능을 얻을. 여기, Cre recombinase 함수 비보의 손실에 floxed 유전자와 대뇌 피 질의 뉴런 개발의 부족 인구에 제공 electroporation utero에서 설명 합니다.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

우리는 신생아 마우스 두뇌의가에 microinjecting 시 약에 대 한 수 제 머리 고정 장치 stereotaxic 수술의 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 신생아 마우스 두뇌의 특정 영역의 신경 세포에서 유전자 조작...

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

이중 마커(MADM)를 이용한 모자이크 분석을 이용하여 단일 세포 수준에서 후보 유전자의 계보 추적 및 기능성 유전자 분석을 수행하는 프로토콜이 제시된다. MADM 클로날 분석은 개별 전조자와 그들의 딸 세포의 증식 행동, 세포 출력 및 혈통 관계를 측정하는 정량적인 틀을 제공합니다.

이중 마커를 이용한 모자이크 분석을 이용한 대뇌 피질 개발의 계보 추적 및 클론 분석(MADM)

신경 정신 장애의 병인에 있는 최근에 발견된 질병 관련 유전자의 역할은 모호하게 남아 있습니다. 자궁 전기 기화 기법에서 수정된 양자간은 뉴런의 큰 인구에서 유전자 전송을 허용하고 사회적 행동에 대한 유전자 발현 변화의 원인 효과의 검사를 허용한다.

자궁 전자기화에서 양자 간을 사용하여 설치류 행동에 대한 유전적 영향을 심문하는 파이프라인

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

배우세요 출생 후 뇌 발달에서 유전자 기능을 조작하는 방법을 신생아 마우스에 바이러스를 주사하여 모자이크 유전자 불활성화와 희소 신경 라벨링을 달성하는 기술입니다. 이 방법은 신경 회로 발달에서 유전자 기능을 연구하는 데 도움이 됩니다.

바이러스 기반 Cre 호텔의 재조합을 사용하여 출생 후의 마우스 두뇌 개발의 유전자 기능의 모자이크 분석

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