바이러스 기반 Cre 호텔의 재조합을 사용하여 출생 후의 마우스 두뇌 개발의 유전자 기능의 모자이크 분석

이 절차의 전반적인 목표는 뇌 발달의 출생 후 기간 동안 유전자 기능을 조작하는 것입니다. 이를 위해서는 먼저 적절한 바이러스를 선택 및 준비한 후 주사기에 주입하고 주입 장비를 준비합니다. 그런 다음 갓 태어난 새끼 쥐의 뇌에 바이러스를 주입하고 마지막 단계는 동물을 희생하고 주입된 부위를 이미지화

궁극적으로, 면역형광 현미경 검사를 통해 대조 세포와 녹아웃 세포의 차등 표지를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 출생 후 발달 기간이 유전적으로 어떻게 조절되는지와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 주사의 경우, 시판되는 아데노 관련 바이러스 용액을 최대 역가(일반적으로 밀리리터당 10-12번째, 게놈 복제)로 사용하여 많은 수의 세포를 조작할 수 있습니다.

희소 또는 라벨링이 필요한 경우 1에서 10 사이의 희석으로 시작합니다. 얼음에서 바이러스를 해동한 후 즉시 사전 희석 부피를 멸균 250마이크로리터 PCR 튜브로 옮깁니다. 희석액을 얼음에 보관하십시오. 지금.

적절한 주사기를 선택하고 로딩 바늘에 연결하여 주입 펌프를 준비합니다. 다음으로, 주사기에 매우 작은 기포가 보일 때까지 바이러스 용액을 부드럽게 끌어올리고 이 단계를 더 쉽게 하기 위해 불활성 로딩 염료를 사용할 수 있습니다. 이제 리테이너를 사용하여 주사기를 펌프에 고정합니다.

그런 다음 주사기와 바늘 홀더 사이에 연결 튜브를 부드럽게 부착합니다. 주사 바늘이 바늘 홀더 내부의 연결 튜브와 직접 접촉되어 있는지 확인하십시오. 이제 바늘 끝에 작은 용액 방울이 보일 때까지 연결 튜브를 통해 용액을 천천히 움직입니다.

펌프의 브래킷으로 푸셔 블록 옆에 있는 플런저를 조심스럽게 고정합니다. 주입 속도를 분당 8마이크로리터로 설정하고 주입량을 1마이크로리터에서 2마이크로리터 사이로 설정합니다. 그런 다음 사용 중인 주사기의 직경과 일치하도록 펌프 주사기 직경 설정을 조정합니다.

마지막으로 회복 단계에서 새끼를 보호하기 위해 핫플레이트를 섭씨 38도로 설정하고 종이 타월로 덮습니다. IACUC 승인 프로토콜을 사용하여 P zero 또는 P one 마우스 새끼에게 냉간 마취를 가하여 주사를 준비합니다. 종이 타월 몇 장에 물을 적셔 얼음 위에 올려 놓습니다.

그런 다음 잘 분리된 종이 타월 위에 4-5마리의 강아지를 놓습니다. 종이 타월을 강아지 위에 접고 종이 타월 위에 소량의 으깬 얼음을 부드럽게 놓고 약 5분 동안 강아지를 품게 합니다. 새끼는 최대 15분 동안 얼음 위에 안전하게 보관할 수 있으며 여전히 잘 회복할 수 있습니다.

이제 주사 부위에 가장 잘 접근할 수 있도록 마취된 강아지를 장착 블록에 놓습니다. 예를 들어, 피질은 동물을 배에 평평하게 눕히는 것이 가장 쉽다. 강아지는 반창고를 사용하여 제자리에 고정하고 수동으로 강아지의 머리를 안정시키고 피부를 단단히 당겨 움직이지 않도록 할 수 있습니다.

그런 다음 람다 봉합사와 같은 두개골의 해부학적 랜드마크를 탐색하고 다른 손으로 재현 가능한 주입 지점을 선택하고 두개골을 통해 바늘을 부드럽게 삽입합니다. 바늘이 두개골을 쉽게 관통하지 않으면 세게 누르지 마십시오. 대신 바늘의 위치를 조정하고 부드럽게 다시 시도하십시오.

주입 깊이는 개별 동물과 피질에 대한 변형에 따라 약간 다르며 일반적으로 1/2에서 1mm 깊이가 작동합니다. 이제 동료가 펌프를 활성화하여 손의 움직임을 최소화하도록 하여 바이러스 용액을 주입합니다. 이상적으로는 주입 후 풋 페달을 사용하여 펌프를 시작할 수 있습니다.

몇 초 동안 바늘을 제자리에 유지한 다음 강아지의 머리를 부드럽게 움직이지 않게 하십시오. 바늘을 밖으로 밀어냅니다. 이제 강아지가 덮인 핫 플레이트에서 5-10분 동안 회복할 때까지 기다립니다.

이 기간 동안 다른 강아지에게 계속 주사하십시오. 강아지들이 모두 분홍색을 되찾고 모두 움직이기 시작하면 집 침구의 일부로 부드럽게 문지릅니다. 그래야만 어미에게 돌아갈 수 있습니다.

그렇지 않으면 낯선 새끼로 취급될 수 있으며, 어미는 새끼가 어미에게 돌아간 후 죽일 가능성이 큽니다. 주사기에 아세톤 또는 70% 에탄올을 완전히 로드하여 주입 설정을 청소합니다. sano, acurate, 접착제와 같은 아세톤에 민감한 구성 요소를 사용하는 경우 매번 새 용액을 사용하여 사출 설정을 통해 용액을 여러 번 플러시합니다.

이렇게 하면 남아 있는 바이러스 용액이 제거되고 용제가 침전되어 증발합니다. 설정을 세척한 후 표백제의 작업 영역을 소독하여 다음 실험자를 위해 준비합니다. 멘토. 성공적인 기술은 주사 부위에서 강력한 신경 감염을 생성합니다.

피질(cortex) 및 상구(superior colliculus)와 같은 특정 부위에 주사하면 일반적으로 인접 부위로의 확산을 최소화하면서 국소 감염을 일으킵니다. 고역가 바이러스 용액을 사용하면 해마와 같은 인접 부위가 감염될 수 있으며, 저역가 바이러스 용액이 주입될 가능성이 더 높습니다. 일반적으로 정중선에서 소뇌 주사와 같이 주사 부위 근처에서 드문드문 감염이 발생하며, 감염된 세포의 수는 주입된 바이러스 용액의 역가와 상관관계가 있어야 합니다.

예를 들어, 서로 다른 형광 단백질을 발현하는 두 개의 R AAV 8 바이러스의 고역가 용액 혼합물을 소뇌에 주입하면 다르게 표지된 많은 긴지 세포가 감염됩니다. 반대로, 저역가 바이러스 용액을 주입하면 단일 세포를 시각화하는 데 도움이 되는 희박한 감염이 발생할 수 있습니다. 형광 표지된 뉴런은 새로 절단된 살아있는 조직에서 직접 관찰하거나 면역 염색을 할 수 있습니다.

이는 나중에 광시야 또는 공초점 형광 현미경으로 이미지를 획득하기 위해 내인성 형광 신호를 향상시킵니다. 마지막으로, RAAV eight은 미세한 돌기의 강력한 표지로 피질의 다양한 유형의 뉴런을 감염시킬 수 있습니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 약 30분 안에 완료할 수 있습니다.