인산펩티드의 이산화티타늄 기반 농축: 펩타이드 라이브러리에서 인산펩티드의 선택적 분리 방법

JoVE Encyclopedia of Experiments

암 연구

0 조회수 • 3:33 분 • April 30th, 2023

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포스포펩타이드는 인산화된 세린, 트레오닌 또는 티로신 잔기를 포함하는 짧은 아미노산 스트링입니다. 펩타이드 혼합물에서 인산화펩타이드를 분리하려면 먼저 이산화티타늄 비드를 튜브에 넣으십시오. 담금질제를 포함하는 적절한 산성화 결합 완충액을 사용하여 비드를 컨디셔닝하기 위해 평형을 이룹니다. 원하는 농도의 펩타이드 혼합물을 비드 슬러리에 첨가합니다.

비드가 가라앉지 않도록 혼합물을 지속적으로 흔들면서 배양합니다. 산성 조건은 인산염 그룹의 인산염 그룹이 티타늄 비드와 배위 결합을 형성하도록 촉진합니다. 완충액의 담금질제는 비인산화 펩타이드의 비특이적 결합을 감소시켜 현탁액에 남깁니다.

원심분리하여 인산화펩타이드 결합 비드를 펠릿화하는 반면, 인산화되지 않은 펩타이드는 상청액에 남아 있습니다. 상청액을 버리십시오. 포스포펩타이드 결합 비드를 사전 조립된 스핀 필터 컬럼으로 옮깁니다. 원심분리하여 결합 완충액을 제거하고 포스포펩타이드 접합 비드를 포획합니다.

필터를 깨끗한 튜브에 옮기고 암모니아 함유 용액을 추가합니다. 암모니아는 현탁액을 염기성으로 전환하여 포스포펩타이드가 비드에서 분리되도록 합니다. 어셈블리를 원심분리하여 결합되지 않은 포스포펩타이드를 용리하고 수집합니다. 이산화티타늄 비드는 필터 카트리지에 남아 있습니다. 인산펩타이드를 건조시켜 암모니아의 흔적을 제거합니다.

이산화티타늄을 500마이크로리터의 100% ACN으로 두 번 전처리합니다. 그런 다음 이산화티타늄을 500마이크로리터의 0.2M 인산나트륨 완충액(pH 7)으로 두 번 컨디셔닝합니다. 마지막으로 300마이크로리터의 평형 완충액을 사용하여 비드를 세 번 세척합니다. 400마이크로리터의 50% ACN, 0.1% TFA를 저단백질 결합 튜브에 추가합니다. 그런 다음 84마이크로리터의 젖산을 첨가합니다.

재현탁된 포스포펩티드를 저단백질 결합 튜브로 옮기고 종단 간 회전기를 사용하여 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 비드를 펠릿화한 후 300마이크로리터의 평형 완충액을 사용하여 두 번 세척하고 회전시킵니다. 300마이크로리터의 헹굼 완충액으로 비드를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 0.2마이크로미터 스핀 필터로 옮깁니다.

탈수 후 필터 장치를 깨끗한 1.5밀리리터 저단백 결합 튜브로 옮기고 200마이크로리터의 0.9% 암모늄을 물에 담가 내용물을 두 번 용출합니다. pH를 확인한 후 용출액을 밤새 진공 농축하여 건조시켜 암모니아를 증발시킵니다.

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마지막 업데이트: 22 8월 2026