DAPI 염색을 사용한 세포 사멸 스크리닝: 암 세포주에서 IR 유도 클론 생성 세포 사멸의 신속한 스크리닝 방법

X선과 같은 전리 방사선에 노출되면 DNA 손상이 발생하여 결국 세포 사멸로 이어질 수 있습니다. 세포 사멸 프로필에 대한 전리 방사선의 영향을 스크리닝하려면 커버슬립 표면 위에 부착된 암세포가 들어 있는 배양 접시를 가져가는 것부터 시작하십시오.

원하는 시간 동안 배양 접시에 X-레이를 조사합니다. 이 치료는 세포 내부에 DNA 손상을 일으킵니다. 그런 다음 배양 접시에서 사용한 배지를 흡인하고 적절한 고정액을 추가합니다. 이 용액은 세포에 침투하고 후속 염색 단계에서 세포 성분을 제자리에 고정합니다.

고정액을 버리십시오. 배양 접시에서 X선 처리된 세포가 들어 있는 커버슬립을 제거합니다. 커버슬립을 뒤집어 세포가 DAPI와 직접 접촉하도록 DAPI 염색 한 방울을 올려 유리 슬라이드 표면에 놓습니다.

DAPI 분자는 핵에 들어가 DNA의 A-T가 풍부한 부위에 결합합니다. 이제 형광 현미경으로 세포를 시각화합니다. 핵은 파란색으로 나타나고 뚜렷한 형태를 나타냅니다.

응축되고 단편화된 핵을 보이는 세포는 세포사멸, 프로그램된 세포 사멸을 나타냅니다. 다중 엽 핵을 나타내는 다른 것들은 세포가 유사분열 재앙을 경험하고 있음을 나타냅니다. 여러 개의 밝은 점을 보이는 납작한 핵을 가진 것은 노화를 겪고 있는 세포를 암시합니다.

인큐베이터에서 세포를 꺼내 배양 접시에서 배양 배지를 흡인합니다. 1,000마이크로리터 마이크로피펫 팁의 끝을 가위로 끝에서 약 5mm 떨어진 곳에서 자르고 이를 사용하여 배양 접시에 고정액 1ml를 추가합니다.

세포 손상을 최소화하기 위해 배양 접시 벽을 따라 고정 용액을 도포합니다. 그런 다음 이 배양 접시를 정사각형 배양 접시에 옮기고 부드럽게 흔들어 고정 용액이 커버슬립 위에 고르게 분포되도록 합니다. 그런 다음 접시를 실온에서 10분 동안 배양합니다.

접시에서 고정액을 흡인합니다. 이제 접시 벽을 따라 PBS 2밀리리터를 추가한 다음 PBS를 흡인합니다. DAPI 염색을 준비하려면 유리 슬라이드에 5마이크로리터의 DAPI 염색 시약을 추가합니다. 그런 다음 메스를 사용하여 접시에서 커버슬립을 제거하고 종이 타월로 커버슬립의 가장자리를 만져 커버슬립에 있는 여분의 PBS를 배출합니다.

이제 세포가 DAPI 염색 시약에 노출되도록 유리 슬라이드의 DAPI 염색 시약 방울 위에 커버슬립을 거꾸로 장착합니다. 마지막으로 DAPI 필터가 장착된 형광 현미경으로 염색된 세포를 검사합니다.