Name: 여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출 현장에서 하이브리드 (mFISH) 및 방사선 조사 마우스의 스펙트럼 핵형 분석 (SKY) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 배우세요 방사선 조사 마우스 골수세포에서 mFISH 및 SKY 기법을 이용한 염색체 안정 수차 검출 방법을. 이 기법은 방사선 유전 손상 시각화 및 세대 간 전파 연구에 활용됩니다.

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본 연구는 국립 항공 우주국 통해 아칸소 공간 그랜트 협회와 국립 우주 바이오 메디컬 연구소에 의해 지원되었다, 부여 NNX15AK32A (RP) 및 RE03701 (MH-J), 및 P20의 GM109005 (MH-J), 미국 재향 군인의 관리 ( MH-J). 우리는 원고의 준비 편집 지원 크리스토퍼 Fettes, 의료 과학 아칸소 대학의 환경 및 산업 보건학과에 대한 프로그램 코디네이터, 감사합니다.

모든 동물 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수하여 수행 하였다. 동물 프로토콜은 의료 과학에 대한 아칸소 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 신선한 공기와 표준 설치류 음식과 물을 무료로 이용할 수의 15 시간당 사이클 - 모든 동물은 10 20 ± 2 ℃에서 표준 에어컨 동물 시설에서 보관 하였다. 도착 후, 마우스 1 주일 동안 격리에서 개최하고 인증 설치류 식사를 제공했다. 1.Radiation 노출 및 중기 세포의 생체 체포에 <ol><li> 노출 조사 챔버에서 2 Gy의 전신 방사선에 마우스를 해제는-마취. 조사 기간 동안, 통풍이 잘 유지 챔버의 장소 마우스는 자유롭게 이동하고 균일 한 용량을받지 못한 확인합니다. </li><li> 0.05 % 콜히친 용액 100 μL를 주입 (c칼슘 및 마그네슘없는 PBS에 용해 olchicine 분말) 복강 내 1 ㎖의 일회용 주사기에 부착 된 25 G 바늘을 사용. 어떤 기관에 직접 분사하지 마십시오. </li><li> 골수 세포 수확하기 전에 2 시간 동안 케이지에 동물을 둡니다. 통증이나 고통의 흔적에 대한 동물을 관찰한다. </li></ol> 2. 골수 세포 수확 및 밀도 구배 원심 분리하여 골수 단핵 세포의 분리 <ol><li> CO 2 질식하여 마우스를 안락사. </li><li> 지느러미와 복부 측면에 70 % 에탄올 스프레이. </li><li> 날카로운 가위로 복부 피부에 2cm의 절개를합니다. 무딘 핀셋 절개의 양쪽 피부를 잡고 조심스럽게 복부 근육을 잡아 당깁니다. </li><li> 가위로 양쪽 뒷다리를 잘라 즉시 4 % FBS 사전 냉장 PBS에 배치합니다. </li><li> 조심스럽게 날카로운 면도칼과면 거즈 붕대로 뒷다리에 연결된 모든 근육을 청소합니다. </li><li> 대퇴골의 경골을 분리합니다. 면도칼 각 뼈의 양쪽 끝을 낸다. </li><li> 3 mL의 주사기에 부착 된 23 G 바늘을 사용하여 (4 % FBS)와 3 mL의 PBS와 함께 골수의 컨텐츠를 플러싱하고, 15 mL의 원심 분리 튜브 내의 컨텐츠를 수집한다. 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 바늘을 통해 세포 현탁액을 10 배 이상을 합격. </li><li> 조심스럽게 세포 현탁액 및 림프구 분리 매질 간의 인터페이스를 방해하지 않고 림프구 분리 매질 (3 mL)을 동일 부피의 세포 현탁액을 오버레이. 실온에서 30 분 동안 400 × g으로 원심 분리기. </li><li> 새로운 15 mL의 원심 분리 튜브 내의 다른 계층과 전송을 방해하지 않고 조심스럽게 버피 코트를 수집한다. </li></ol> 중기 세포 스프레드 3. 준비 <ol><li> 버피 코트를 포함하는 튜브에 10 mL의 PBS를 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 그런 t을 휴식그는 부드러운 도청과 펠렛 셀, ​​10 mL의 PBS를 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기. </li><li> , 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거 펠렛을 중단하고 미리 예열 저장성 0.075 M 염화칼륨 용액 4 mL를 넣고. 부드러운 일정한 흔들림과 강하에 의한 저장성 용액 방울을 추가합니다. </li><li> 수욕에서 37 ℃에서 20 분 동안 세포를 인큐베이션. </li><li> (: 빙초산 3 : 메탄올 1 v / v)의 저장성 처리 후, 고정액 동량 (4 ml)에 추가 15ml의 튜브와 상기 튜브를 반전시켜 부드럽게 혼합한다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하고 상층 액을 제거한다. </li><li> 몇 초 동안 부드러운 소용돌이 다음 탭핑과 세포 펠렛을 휴식과 일정한 흔들림와 드롭으로 정착 솔루션 드롭 3 mL를 넣고. </li><li> 실온에서 30 분 동안 배양 한 다음 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기. </li><li> , 상층 액을 제거 신사와 세포 펠렛을 휴식제작 : 도청, 3 mL의 신선한 정착액을 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하고 상층 액을 제거한다. 부드러운 도청과 세포 펠렛을 휴식, 신선한 3 ML의 정착액을 추가합니다. </li><li> 단계를 반복 3.12 배 더. </li><li> 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하고 세포 펠렛을 교란시키지 않고 상층 액을 제거한다. 그 후 600 μL의 정착에 400를 추가하고 피펫으로 잘 혼합한다. </li><li> 45 ° 각도로 기울어 미리 청소하고 젖은 슬라이드에 30 μL에게 고정 된 세포를 삭제하고 완전히 밤새 공기 건조에 슬라이드를 할 수 있습니다. </li></ol> mFISH 4. 마우스 염색체 페인팅 <ol><li> 염색체 변성 <ol><li> 실온에서 2 분 동안 2 × SSC에서 중기 세포의 퍼짐을 포함하는 슬라이드를 놓는다. </li><li> 70 %에서 2 분 각각 80 %, 100 %를 직렬 에탄올 세척하여 슬라이드를 탈수. 65 ° C에서 60 분 동안 품어. </li><li> 데우고 40 ㎖의 변성 용액 (70 % 포름 아미드 / 2 × SS기음; 30 분 동안 유리 코 플린 항아리에 70 ° C (± 2 ° C)로 pH를 7.0). 1.5 분 - 1 예열 변성 용액 슬라이드를 배양하여 염색체 변성. </li><li> 2 분 변성 과정을 중단뿐만 아니라, 재 어닐링에서 염색체 변성을 방지하기위한 빙냉 70 % 에탄올 중에 슬라이드를 즉시 급냉. 그 다음 2 분 동안 80 % 에탄올로 세척하여 탈수. 2 분 동안 100 %의 에탄올과 에탄올 세척을 반복합니다. 완전히 실온에서 슬라이드를 건조. </li></ol></li><li> 변성 및 프로브 혼합물의 하이브리드 <ol><li> 간단히 제조자에 의해 공급되는 프로브 혼합물을 원심 분리하여, 7 분 동안 수욕에서 80 ℃ (± 2 ℃)에서 배양 캡 원심 분리 튜브 스냅 500 μL로 프로브 액 10 μL를 전송하고, 변성. </li><li> 10 분 동안 37 ℃에서 수욕 프로브 혼합물 원심 튜브를 놓는다. </li><li> 변성 chromoso와 슬라이드에 변성 프로브 혼합물을 적용MES. </li><li> 조심스럽게 18mm X 18mm 유리 커버 슬립으로 영역을 커버하고 매우 부드럽게 밀어 커버 슬립을 눌러 눈에 보이는 기포를 제거한다. 고무 시멘트와 커버 슬립의 네면을 밀봉 및 하이브리드에 대한 가습 챔버에서 37 ° C에서 어둠 속에서 16 시간에 12 시간 동안 배양. </li></ol></li><li> 포스트 하이브리드 세척 및 검출 <ol><li> 조심스럽게 고무 시멘트와 커버 슬립을 제거합니다. </li><li> 5 분 동안 74 ° C (± 2 ° C)에서 미리 예열 0.4 배의 SSC의 장소 슬라이드. </li><li> 2 분 동안 세척 용액 II (4 배 SSC / 0.1 % 트윈 20)에서 세척 슬라이드. </li><li> DAPI의 Counterstain과 (1.5 μg의 / mL)로 안티 - 페이드 장착 매체의 20 μL를 놓고 유리 커버 슬립으로 다룹니다. 부드럽게 실험실 조직과 coverslip에 눌러 공기 거품과 초과 장착 솔루션을 제거합니다. 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. </li><li> 적절한 필터가 장착 된 형광 현미경을 사용하여 볼 슬라이드. </li></ol></l난&gt; </ol> 5. 스펙트럼 핵형 마우스 염색체의 (SKY) <ol><li> 염색체와 프로브 변성 <ol><li> 흔들림없이, 2 분 동안 실온에서 2 × SSC에서 슬라이드 평형. </li><li> 실온에서 2 분마다 에탄올 시리즈 슬라이드 (70 %, 80 %, 100 % 에탄올)을 탈수. 완전히 에탄올을 제거 할 수있는 슬라이드를 공기 - 건조. </li><li> 따뜻한 40 ML의 변성 용액 (70 % 포름 아미드 / 2 × SSC, 산도 7.0) 30 분 동안 유리 코 플린 항아리입니다. </li><li> 1 ~ 1.5 분 동안 예열 변성 솔루션에 슬라이드를 품어. </li><li> 2 분 변성 과정을 중단뿐만 아니라, 재 어닐링에서 염색체 변성을 방지하기 위해 즉시 빙냉 70 % 에탄올로 슬라이드 젖어. </li><li> 실온에서 2 분 동안 100 % 에탄올로 2 분 후, 80 % 에탄올로 배치 의해 슬라이드 탈수. </li><li> 80 ° C (± 2 ° C)로 설정 수욕에서 SKY 프로브 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 1) 변성7 분 후 즉시 10 분간 37 ° C로 설정 다른 수조에 놓는다. </li></ol></li><li> 프로브 하이브리드 <ol><li> 변성 염색체에 변성 SKY 프로브의 10 μL를 추가합니다. </li><li> 기포가 커버 슬립 아래에 갇혀되지 않도록 조심스럽게 SKY 프로브 상에 18mm X 18mm 유리 coverslip에 배치합니다. </li><li> 고무 시멘트와 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. </li><li> 가습 차광판 챔버에 슬라이드를 넣고 36 시간 ~ 24 시간 동안 37 ℃에서 어둠 속에서 배양한다. </li></ol></li><li> 포스트 하이브리드 세척 및 형광 검출 <ol><li> 커버 슬립을 방해하지 않고 매우 신중 고무 시멘트를 제거합니다. </li><li> 일정한 흔들림 5 분 동안 72 ° C (± 2 ° C)에서 미리 예열 빠른 세척 용액 (0.4 배의 SSC)에 슬라이드를 놓습니다. 세척 용액 III (4 배 SSC / 0.1 % 트윈 20)에 슬라이드를 담그고 흔들어 섞으면 서 1 분 동안 품어. </li><li> 옵션 : 차단 시약 80 μL를 추가하이브리드의 영역 상 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 2)와, 24mm X 60mm 플라스틱 커버 슬립을 배치하고, 가습 실에서 30 분 동안 37 ° C에서 어둠 속에 품어. </li><li> 조심스럽게 플라스틱 커버 슬립을 제거하고 5 분간 예열 (45 ° C) 세척 용액 III와 슬라이드를 씻는다. </li><li> 80 μL Cy5에 염색 시약 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 3)를 적용하는 24mm X 60mm 플라스틱 커버 슬립을 배치하고, 가습 실에서 40 분 동안 어둠 속에서 37 ° C에서 품어. </li><li> 함유하는 유리 코 플린 항아리에 슬라이드를 담근 예열 (45 ºC) 세정액 III (4X SSC / 0.1 % 트윈 20)와 진탕하면서 2 분 동안 수욕에서 45 ℃에서 배양한다. 이 세척 단계를 3 번 ​​반복합니다. </li><li> 80 μL Cy5.5의 염색 시약 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 4)를 적용하는 24mm X 60mm 플라스틱 커버 슬립을 배치하고, 가습 실에서 40 분 동안 어둠 속에서 37 ° C에서 품어. </li><li> (미리 예열과 슬라이드 3 회 반복한다45 ºC) 세정액 III. </li><li> 초과 액체를 배출하기 위해 종이 타월에 대하여 기울어 진 위치에 슬라이드를 잡습니다. 20 μL 안티 페이드 DAPI 시약 (제조업체에서 제공 유리 병 # 5)를 추가하고 조심스럽게 기포를 도입하지 않고 24mm X 60mm 유리 coverslip에 배치합니다. 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉 SKY 이미지를 캡처 장착 된 표면 형광 현미경으로 관찰한다. </li></ol></li></ol>

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<li>Tucker, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAINT%3A+a+proposed+nomenclature+for+structural+aberrations+detected+by+whole+chromosome+painting%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting.</a> Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).</li>
<li>Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH-based+analysis+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+using+different+nomenclature+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems.</a> Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).</li>
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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

몇 가지 중요한 단계는 mFISH과 SKY의 성공을 결정합니다. 첫번째 가장 중요한 단계는 골수 단핵 세포의 생체 유사 분열 정지를위한 콜히친 처리를 최적화한다. 콜히친 농도와 처리 시간을 개별적으로 또는 콘서트에 효과적인 염색체 그림의 유사 분열 지수뿐만 아니라 염색체 응축 - 두 가지 중요한 전제 조건을 결정한다. 높은 콜히친 농도 이상 처리 시간은 적절한 변성과 하이브리드에 대한 호환되지 않는 매우 응축 된 염색체로 연결됩니다. 또한, 응축 된 염색체와 확산 중기 세포의 복잡한 재 배열의 정확한 식별은 달성하기 쉬운 일이 아니다. 22, 26g 사이의 체중을 가진 마우스에서 2 시간 동안 100 μL 0.05 % 콜히친의 복강 내 투여는 중기 세포의 충분한 수가 약간 좁은 염색체 확산 생성한다. 두번째 중요한 단계는 저장성 처리이다.볼륨, 처리 시간, 및 저장성 용액 영향 염색체 형태학의 온도와 유리 슬라이드 상 염색체 확산. 짧은 시간 또는 서브 - 최적의 온도에서 저장 액 처리 중첩 염색체 확산 중기 ...

방사선 유도 염색체 간 안정 이상을 식별하는 가장 신뢰할 수 있는 두 가지 방법은 두 개 이상의 염색체를 동시에 페인팅할 수 있는 다중 형광 제자리 혼성화(mFISH)와 게놈의 각 상동 염색체 쌍에 고유한 색상을 부여하는 스펙트럼 핵형 분석(SKY)입니다. 불안정한 수차와 달리, 안정된 수차는 본질적으로 지속적이며 방사선 조사된 집단에서 여러 세대에 걸쳐 전파될 수있으며1, 방사선 유발 세포유전학적 병변2의 중요한 분자 "서명"으로간주됩니다. 다양한 그룹의 연구에 따르면 안정적인 수차는 암을 포함한 여러 질병의 발병 및 발병과 관련이 있는 것으로 나타났습니다3. 염색체 페인팅(분자 세포 유전학이라고도 함) 시대 이전에는 기존의 G-밴딩 기술이 안정적인 염색체 이상을 감지하는 유일한 방법이었습니다. 그러나 염색체 밴딩은 해상도가 제한되고, 재현성이 불확실하며, 노동 집약적인 절차이고, 신뢰할 수 있는 데이터 해석을 위해 고도로 숙련되고 경험이 풍부한 세포유전학자가 필요하기 때문에 세포유전학자에게 도전이 됩니다4. 더욱이, 고전적인 밴딩 기법은 방사선 손상의 일반적인 결과인 두 개 이상의 염색체 간에 분포된 세 개 이상의 단절의 상호 작용을 포함하는 복잡한 염색체 재배열을 감지할 수 없습니다. 복잡한 수차는 방사선 노출 후 수년이 지난 후에도 개체에서 지속될 수 있으므로 후향적 생물선량 측정에 유용합니다5. 따라서 안정적인 염색체 재배열을 검출하기 위해 기존 밴딩 기술의 한계를 극복하기 위해 대안적인 접근법이 필요했습니다. 
1960년대 후반, 방사성 물질로 표지된 핵산 프로브를 사용한 분자 혼성화에 대한 Gall과 Pardue(1969)의 선구적인 연구는 세포 유전학 분야에서 새로운 시대를 열었고, 6번 염색체에서 특정 DNA 염기서열을 검출할 수있었습니다. 그러나 분자 혼성화를 위한 방사성 프로브의 사용에는 몇 가지 단점이 있었습니다: 방사성 프로브는 상대적으로 불안정하고, 프로브 활성은 사용된 동위원소의 방사성 붕괴에 따라 달라지며, 혼성화에 더 오랜 시간이 걸리고, 해상도가 제한되며, 프로브는 상대적으로 비싸고, 방사성 물질은 건강에 해롭습니다. 따라서 비방사성 프로브를 개발하고 설계해야 했습니다. 1980년대와 1990년대에 형광 표지 핵산 프로브의 도입은 방사성 프로브의 한계를 극복하고 혼성화 기술의 안전성, 민감도 및 특이성을 크게 향상시켰습니다7-10. 형광 프로브는 적절한 여기 및 방출 필터가 장착된 형광 현미경으로 관찰할 때 매우 밝은 신호를 발생시킵니다. 형광 표지된 염색체 또는 염색체의 일부의 손실, 증가 또는 재배열은 이 FISH 기술로 쉽게 식별할 수 있습니다.
FISH 페인팅에 의한 염색체 이상 분석은 수년에 걸쳐 세포유전학 연구에서 현저한 진전을 이뤘습니다. 유전자좌 특이적 프로브에서 전체 염색체 페인팅 프로브에 이르기까지 특정 응용 분야를 위한 형광 표지 프로브를 설계하는 것은 이 분야를 크게 발전시켰습니다. 이것은 또한 기존의 염색체 밴딩으로는 불가능했던 미시적("비밀스러운") 재배열의 감지를 용이하게 했습니다. mFISH와 SKY에 의한 염색체 페인팅은 단순하고 복잡한 염색체 간 재배열을 식별하는 데 유용한 도구임이 입증되었습니다. 두 기술의 기본 원리는 비슷하지만 in situ hybridization 후 형광 신호의 검출 및 식별 방법과 이미지 획득 과정은 다릅니다. mFISH에서는 협대역통과 현미경 필터를 사용하여 4가지 형광 색소 각각의 개별 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 전용 소프트웨어를 사용하여 이미지를 결합합니다. SKY에서 이미지 획득은 epifluorescence microscopy, charge-coupled device imaging 및 Fourier spectroscopy의 조합을 기반으로 하며, 이를 통해 모든 이미지 포인트에서 단일 노출로 전체 방출 스펙트럼을 측정할 수 있습니다. mFISH와 SKY에서 흑백 이미지는 독립적으로 캡처된 다음 병합되고, 마지막으로 각 형광 프로브에 부착된 특정 염료를 기반으로 단색 이미지의 염색체에 고유한 의사 색상이 할당됩니다.
방사선 생물학 분야에서 mFISH와 SKY 분석의 기여는 주목할 만하며, 특히 IR(방사선 생물선량 측정)11-14, 방사선 발암 위험 평가15, 방사선 요법 관련 2차 암의 탐지 및 위험 추정16에 대한 인체 노출의 후향적 선량 추정에 기여하고 있습니다. 쥐를 대상으로 한 최근 연구에 따르면 FISH 기반 염색체 페인팅 기법도 방사선 대책17의 효능을 평가하는 데 중요한 도구인 것으로 나타났습니다. 본 연구에서는 mFISH와 SKY 기법을 사용하여 생쥐의 골수 세포에서 안정적인 염색체 이상 유도에 대한 전신 방사선 노출의 영향을 입증했습니다.

<table><tbody><tr><td>포름 아미드</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>221198-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC 버퍼 20 회; Concentrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>SKY 실험실 시약 마우스</td><td>응용 스펙트럼 이미징</td><td>FPRPR0030/M40</td><td></td></tr><tr><td>CAD - 집중 항체 검출 키트</td><td>응용 스펙트럼 이미징</td><td>FPRPR0033</td><td></td></tr><tr><td>단일 페인트 맞춤형 - 3가지 색상; 마우스 염색체 1: 빨간색, 마우스 염색체 2: 녹색, 마우스 염색체 3: 아쿠아</td><td>응용 스펙트럼 이미징</td><td>FPRPR0182/10</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545B</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>염산, 37%, Acros</td><td>Organics Fisher Scientific</td><td>AC45055-0025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 유리 염색 접시&nbsp; 나사 캡 포함</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-816</td><td></td></tr><tr><td>KaryoMAX 염화칼륨 용액&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10575-090</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>콜세미드 분말</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-464-757&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>히스토파크-1083&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>Shepherd Mark I, 모델 25 137Cs 조사기</td><td>J. L. Shepherd & Associates</td><td>모델 484B</td><td></td></tr><tr><td>주사기 1 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>647911</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올, 200 Proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>MEX02761</td><td></td></tr><tr><td>PBS, (1x PBS Liq.), 칼슘 및 마그네슘 없음</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-437-010</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454SK-4</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC295320010</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 현미경</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager.Z2</td><td></td></tr></tbody></table>

여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (mfish) 및 방사선 조사 마우스의 스펙트럼 핵형 분석 (sky)

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

이온화 방사선(IR)은 수많은 안정 및 불안정한 염색체 이상을 유발합니다. 염색체 형태가 실질적으로 손상된 불안정한 이상(unstable aberrations)은 기존의 염색체 염색 기법으로 쉽게 식별할 수 있습니다. 그러나 염색체 형태학의 상당한 변형 없이 유전 물질의 교환 또는 전좌를 포함하는 안정적인 수차를 검출하려면 형광 제자리(in situ)로 널리 알려진 염색체 페인팅 기술인 형광 표지된 DNA 프로브의 현장 혼성화에 의존하는 정교한 염색체 페인팅 기술이 필요합니다 혼성화(FISH). FISH 프로브는 전체 염색체 또는 염색체의 정확한 하위 영역에 특이적일 수 있습니다. 이 방법은 안정적인 수차의 시각화를 가능하게 할 뿐만 아니라 특정 수차 형성과 관련된 염색체 또는 특정 DNA 염기서열을 검출할 수도 있습니다. 세포 유전학에서는 다양한 염색체 페인팅 기술을 사용할 수 있습니다. 여기에서는 전신 조사에 노출된 후 마우스의 골수 세포에서 형성되는 염색체 간 안정 이상을 식별하기 위해 mFISH(Multiple Fluorescence in situ hybridization)와 SKY(Spectral Karyotyping)라는 두 가지 고감도 방법에 대해 논의합니다. 두 기술 모두 형광 표지된 DNA 프로브에 의존하지만 검출 방법과 형광 신호의 이미지 획득 과정은 다릅니다. 이 두 가지 기술은 방사선 생물학, 암 세포 유전학, 후향적 방사선 생물선량 측정, 임상 세포 유전학, 진화 세포 유전학 및 비교 세포 유전학과 같은 다양한 연구 분야에서 사용되어 왔습니다.

전신 방사선 조사 된 마우스의 골수 세포에서 다수의 염색체 수차를 유도한다. 현재 프로토콜은 방사선 조사 후 골수 세포의 생체 유사 분열 정지를 위해 최적화되고, 밀도 구배 원심 분리, 중기 세포 퍼짐의 제조 및 후속 의해 조사 생쥐 골수 단핵 세포의 분리의 뒷다리 골수 세포의 수확 mFISH과 SKY 기술에 의해 방사선 유발 안정적인 염색체 이상 검출. 염색체 이들 기술은 검색 및 다양한 병태 생리 학적 증상의 위험을 평가하는 데 이용 될 수 그림. 도 1은 대표적인 중기 세포는 정상 및 비정상 마우스 염색체 쌍-1, -2, -3에 확산 나타낸다. 그림 2는 정상 및 비정상 마우스 중기 염색체의 스펙트럼 핵형을 보여줍니다.이러한 결과는 전리 방사선 것은 주로 다양한 세포 유형으로자가...

본 프로토콜은 전신 조사에 노출된 후 마우스의 골 수 세포에서 염색체 간 안정 이상을 식별하는 데 있어 다중 형광 현장 혼성화(mFISH) 및 스펙트럼 핵형 분석(SKY)의 유용성을 설명합니다.

여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (mFISH) 및 방사선 조사 마우스의 스펙트럼 핵형 분석 (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

이 분자 세포유전학적 방법의 전반적인 목표는 전신 조사를 받은 마우스의 골수 세포에서 염색체 간 안정적 변이를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 전신 방사선에 노출된 마우스의 골수 세포에서 안정적 염색체 변이가 유도될 위험성과 같이 방사선 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 세포 세대를 통해 전파될 수 있는, 방사선으로 유도된 마우스 골수 세포 내의 안정적 유전 손상을 시각적으로 안내하여 확인할 수 있다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 마우스 대퇴골과 경골에서 골수를 분리하고 단일 세포 현탁액을 만든 후, 세포 현탁액을 동일한 부피의 골수 단핵구 분리 매질 위에 조심스럽게 층이 지도록 얹습니다. 상온에서 400 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 그런 다음, 나머지 층을 건드리지 않고 버피코트(buffy coat)만 조심스럽게 수집하여 새로운 15 mL 원심분리 튜브에 옮깁니다.중기 세포 도말 표본을 준비하려면, 버피 코트(buffy coat)가 들어 있는 튜브에 PBS 10 milliliters를 넣습니다. 그런 다음 상온에서 400 times G로 5분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 다음으로, 상층액을 조심스럽게 제거하고 튜브를 가볍게 두드려 세포 펠렛을 분쇄합니다.그 후 PBS 10 milliliters를 첨가하고 현탁액을 다시 원심분리합니다. 세포 펠렛이 손상되지 않도록 상층액을 제거합니다. 펠렛을 풀어준 다음, 부드럽고 지속적인 흔들림과 함께 미리 가온된 0.075 molar 저장성 염화칼륨 용액 4 milliliters를 한 방울씩 떨어뜨려 첨가합니다.세포 현탁액을 항온수조에서 37 °C로 20분 동안 배양합니다. 그 다음, 튜브에 동일한 부피의 고정액을 넣고 튜브를 반전시켜 천천히 혼합합니다. 튜브를 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.그다음, 세포 펠릿을 분쇄하고 신선한 고정액을 추가합니다. 원심 분리와 고정액 추가 과정을 5회 더 반복합니다. 400~600 µL의 고정액에 세포를 재부유시킨 후, 45도 각도로 기울인 깨끗하고 젖은 슬라이드 위에 고정된 세포 30 µL를 떨어뜨리고 밤새 완전히 공기 건조시킵니다.mFISH를 이용한 마우스 염색체 painting을 수행하려면, 중기 세포 도말이 포함된 슬라이드를 실온의 2X SSC에 2분 동안 담가 둡니다. 그 다음, 70%, 80%, 100% 에탄올 순으로 각각 2분씩 연속 세척하여 슬라이드를 탈수시킵니다. 유리 코플린 자(coplin jar)에 담긴 40 milliliters의 변성 용액을 70 °C에서 30분 동안 예열합니다.그 다음 슬라이드를 미리 데워둔 용액으로 옮기고, 염색체를 변성시키기 위해 샘플을 1분에서 1분 30초 동안 배양합니다. 변성 과정을 중단하고 변성된 염색체가 다시 결합하는 것을 방지하기 위해, 즉시 얼음처럼 차가운 70% ethanol을 사용하여 2분 동안 슬라이드를 급냉시킵니다. 이어서 80% ethanol부터 시작하는 ethanol 계열을 사용하여 2분 동안 슬라이드를 탈수시킵니다.다음으로, 슬라이드를 100% ethanol에 2분 동안 담급니다. 그런 다음 실온에서 슬라이드를 완전히 건조시킵니다. 프로브를 변성시키기 위해, 제조사에서 제공한 프로브 혼합물을 짧게 원심분리한 후, 10 µL를 500 µL 스냅 캡 원심분리 튜브에 옮기고 80 °C의 항온수조에서 7분 동안 배양합니다.이제 변성된 프로브가 들어있는 튜브를 37°C 워터 배스에 10분 동안 넣어둡니다. 그런 다음, 변성된 염색체가 있는 슬라이드 위에 프로브 혼합물을 도포합니다. 해당 부위를 18mm x 18mm 유리 커버슬립으로 조심스럽게 덮고, 커버슬립을 슬라이드 쪽으로 매우 살살 눌러 눈에 보이는 기포를 모두 제거합니다.고무 시멘트를 사용하여 커버슬립의 네 면을 모두 밀봉하십시오. 그리고 습도가 유지되는 챔버 내의 암실에서 37 °C로 12~16시간 동안 슬라이드를 배양하십시오. 하이브리드화 후, 고무 시멘트와 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 슬라이드를 74 °C로 예열된 0.4X SSC에 5분 동안 담그십시오.그다음 슬라이드를 세 번째 세척 용액에 2분 동안 담급니다. DAPI 대조 염색제가 포함된 항퇴색 마운팅 용액 20 µL를 슬라이드에 추가하고 유리 커버슬립으로 덮습니다. 실험용 티슈 페이퍼를 사용하여 커버슬립을 조심스럽게 눌러 기포와 과잉 마운팅 용액을 제거합니다.그 다음, 매니큐어를 사용하여 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 적절한 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 관찰하십시오. 마우스 염색체의 스펙트럼 핵형 분석(spectral karyotyping)의 경우, 프로브가 변성된 염색체에 하이브리드화되고 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 세척한 후, 슬라이드에 80 µL의 SY5 염색 시약을 도포하십시오.24 x 60 mm 플라스틱 커버슬립을 시료 위에 덮고, 37 °C의 습윤 챔버 내 암실에서 40분 동안 배양합니다. 슬라이드를 미리 데워둔 세척액 3이 담긴 유리 코플린 자(coplin jar)에 담근 후, 45 °C의 항온수조에서 2분 동안 흔들어 줍니다. 이 세척 과정을 3회 반복합니다.샘플에 80 µL의 SY5.5 염색 시약을 처리하고, 24 x 60 mm 플라스틱 커버글라스로 덮은 후 습윤 챔버의 37 °C 암실에서 40분 동안 배양합니다. 미리 데워둔 세척액 3을 사용하여 슬라이드를 3회 세척한 다음, 슬라이드를 종이 타월에 비스듬히 세워 과잉 액체를 제거합니다. 샘플에 20 µL의 antifade DAPI 시약을 첨가하고 공기 방울이 생기지 않도록 주의하며 유리 커버글라스를 위에 덮습니다.매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉하고, 스카이(sky) 이미지 캡처 장비가 갖춰진 에피형광 현미경으로 시료를 관찰합니다. 이 그림은 정상 및 비정상적인 생쥐 1번, 2번, 3번 염색체 쌍이 포함된 대표적인 중기 세포 도말 표본을 보여줍니다. 여기서는 1번 염색체의 일부가 염색되지 않은 DAPI 염색체에 통합되고 다른 일부는 무중심 단편을 형성한 1번 염색체의 안정적 전좌가 나타나 있습니다.이 예시에서는 2번 염색체의 일부가 염색되지 않은 염색체로 통합되었습니다. 이 안정적 이상은 3번 염색체와 관련이 있습니다. 이 중기 분열상에서는 염색된 세 개의 염색체 모두가 관여하는 안정적 이상이 관찰됩니다.여기에 정상 암컷 생쥐의 분광 핵형 분석(spectro karyotyping) 예시가 제시되어 있습니다. 이 패널은 4번과 12번 염색체가 관련된 안정적 변이를 나타냅니다. 마지막으로, 이 패널의 안정적 염색체 변이는 7번과 10번 염색체가 관련되어 있습니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 48에서 72시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 증식하는 세포만 사용해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차와 in band와 같은 다른 방법들을 통해 방사선 조사된 세포에 염색체 간 안정적 이상이 존재하는지 등 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.이 기술의 개발 이후, 분자 세포유전학 분야의 연구자들은 유전적 이상과 다양한 질환 사이의 연관성을 탐구할 수 있는 기반을 마련하였습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 염색체 간 안정적 이상을 결정하는 방법에 대해 더 명확한 개념을 잡으실 수 있을 것입니다. 콜히친(colchicine)은 발암성 물질이므로 취급 시 매우 위험할 수 있으며, 본 실험을 수행하는 동안에는 반드시 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

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Genetics

유전학

이 문서는 단일 셀 생선 blastomere 핵 확산에 대한 기술 및 현장 하이브 리다이 제이션과 임상 설정에서 미리 주입 유전자 진단 (PGD)에 적용되는 신호 골을에 적합한 프로브의 선택을 설명합니다.

사전 이식 유전자 진단 생선

Chromosomics : 수치과 구조 변경의 탐지는 모두 24 인간의 염색체로 동시에 소설 OctoChrome 생선 분석을 사용

스펙트럼 Karyotyping (SKY)는 게놈 및 염색체 aberrations를 식별하기위한 고급 cytogenetics의 기술이다. 이 기술은 모든 염색체의 분류를 허용하는 염색체 페인팅 프로브를 이용 걸립니다. 스카이는 또한 polycystic 신장병 등 각종 질병을 가진 생쥐와 인간의 복잡한 염색체 aberrations 및 분리 결함을 식별할 수 있습니다.

Polycystic 신장 질환과 함께 인간과 마우스의 염색체 이상을 공부하는 스펙트럼 Karyotyping

우리가 직접 라벨 형광 프로브를 사용하여 3D DNA 물고기에 의해 핵 구조를 분석하기위한 강력하고 다양한 프로토콜을 설명합니다.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 세포 내에서 네이티브 환경에서의 핵산을 검출 할 수 있습니다. 우리는 여기에 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는 데 사용할 수있는 FISH에 의해 RNA와 DNA의 결합, 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

결합 된 DNA-RNA 형광<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화 (물고기) 차별화 된 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는

DNA 수리 경로는 게놈 무결성의 유지 보수 및 예방 돌연변이 및 암 필수적이다. 이 프로토콜의 목적은 중기는 텔로미어 DNA 반복위한 원위치 혼성화 (FISH)에 형광체를 사용하여 마우스 B 세포로부터 확산에 염색체 이상을 직접 관찰하여 게놈 불안정성을 정량화하는 것이다.

PNA-FISH에 의해 마우스 B 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석

키나제 억제제 치료에 대한 저항성 유전자의 출현은 효과적인 암 치료를위한 중요한 도전을 포즈. 새로 개발 된 약물에 대한 식별 및 내성 돌연변이의 특성은 더 나은 임상 관리 및 차세대 약물 설계에 도움이됩니다. 여기서 우리는 체외 검사 및 내성 돌연변이의 검증하기위한 우리의 프로토콜을 설명합니다.

키나제 억제제에 대해 내성 돌연변이의 검사 및 검증을위한 방법

이 원고 X를 생성 하는 자세한 방법을 제공-염색체 팔 프로브 및 수행 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 자매의 상태를 검사 하 chromatid 응집력 prometaphase 및 를 체포 하는 분열 초파리 oocytes. 이 프로토콜은 meiotic 팔 단결력은 그대로 또는 다른 genotypes에 방해 여부 결정 하는 데 적합 합니다.

Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes

이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

여기에서, 우리는 다발성 골수종 환자로부터의 골수 도말에 대한 계내 혼성화 검출에서 위상간 형광의 성공을 개선하기 위한 프로토콜을 제시한다.

다발성 골수종의 골수 얼룩의 계내 형광 혼성화

시냅스와 재조합의 감수분열 오류는 포유류 난모세포에 일반적입니다. 이러한 과정에 관여하는 단백질에 대한 엄격한 분석은 난자형성이 어떻게 그리고 왜 잘못되는지를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에 제시된 기술을 통해 재조합 및 시냅스를 종합적으로 모니터링하여 마우스의 난모세포 품질을 평가할 수 있습니다.

시냅스와 재조합 평가를 위한 마우스 난모세포에서 퍼진 감수분열 염색체 준비(Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapse and Recombination)

배우세요 방사선 조사 마우스 골수세포에서 mFISH 및 SKY 기법을 이용한 염색체 안정 수차 검출 방법을. 이 기법은 방사선 유전 손상 시각화 및 세대 간 전파 연구에 활용됩니다.

여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출

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