여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출

이 분자 세포유전학적 방법의 전반적인 목표는 전신 조사를 받은 마우스의 골수 세포에서 염색체 간 안정적 변이를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 전신 방사선에 노출된 마우스의 골수 세포에서 안정적 염색체 변이가 유도될 위험성과 같이 방사선 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 세포 세대를 통해 전파될 수 있는, 방사선으로 유도된 마우스 골수 세포 내의 안정적 유전 손상을 시각적으로 안내하여 확인할 수 있다는 점입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 마우스 대퇴골과 경골에서 골수를 분리하고 단일 세포 현탁액을 만든 후, 세포 현탁액을 동일한 부피의 골수 단핵구 분리 매질 위에 조심스럽게 층이 지도록 얹습니다. 상온에서 400 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 그런 다음, 나머지 층을 건드리지 않고 버피코트(buffy coat)만 조심스럽게 수집하여 새로운 15 mL 원심분리 튜브에 옮깁니다.

중기 세포 도말 표본을 준비하려면, 버피 코트(buffy coat)가 들어 있는 튜브에 PBS 10 milliliters를 넣습니다. 그런 다음 상온에서 400 times G로 5분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 다음으로, 상층액을 조심스럽게 제거하고 튜브를 가볍게 두드려 세포 펠렛을 분쇄합니다.

그 후 PBS 10 milliliters를 첨가하고 현탁액을 다시 원심분리합니다. 세포 펠렛이 손상되지 않도록 상층액을 제거합니다. 펠렛을 풀어준 다음, 부드럽고 지속적인 흔들림과 함께 미리 가온된 0.075 molar 저장성 염화칼륨 용액 4 milliliters를 한 방울씩 떨어뜨려 첨가합니다.

세포 현탁액을 항온수조에서 37 °C로 20분 동안 배양합니다. 그 다음, 튜브에 동일한 부피의 고정액을 넣고 튜브를 반전시켜 천천히 혼합합니다. 튜브를 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.

그다음, 세포 펠릿을 분쇄하고 신선한 고정액을 추가합니다. 원심 분리와 고정액 추가 과정을 5회 더 반복합니다. 400~600 µL의 고정액에 세포를 재부유시킨 후, 45도 각도로 기울인 깨끗하고 젖은 슬라이드 위에 고정된 세포 30 µL를 떨어뜨리고 밤새 완전히 공기 건조시킵니다.

mFISH를 이용한 마우스 염색체 painting을 수행하려면, 중기 세포 도말이 포함된 슬라이드를 실온의 2X SSC에 2분 동안 담가 둡니다. 그 다음, 70%, 80%, 100% 에탄올 순으로 각각 2분씩 연속 세척하여 슬라이드를 탈수시킵니다. 유리 코플린 자(coplin jar)에 담긴 40 milliliters의 변성 용액을 70 °C에서 30분 동안 예열합니다.

그 다음 슬라이드를 미리 데워둔 용액으로 옮기고, 염색체를 변성시키기 위해 샘플을 1분에서 1분 30초 동안 배양합니다. 변성 과정을 중단하고 변성된 염색체가 다시 결합하는 것을 방지하기 위해, 즉시 얼음처럼 차가운 70% ethanol을 사용하여 2분 동안 슬라이드를 급냉시킵니다. 이어서 80% ethanol부터 시작하는 ethanol 계열을 사용하여 2분 동안 슬라이드를 탈수시킵니다.

다음으로, 슬라이드를 100% ethanol에 2분 동안 담급니다. 그런 다음 실온에서 슬라이드를 완전히 건조시킵니다. 프로브를 변성시키기 위해, 제조사에서 제공한 프로브 혼합물을 짧게 원심분리한 후, 10 µL를 500 µL 스냅 캡 원심분리 튜브에 옮기고 80 °C의 항온수조에서 7분 동안 배양합니다.

이제 변성된 프로브가 들어있는 튜브를 37°C 워터 배스에 10분 동안 넣어둡니다. 그런 다음, 변성된 염색체가 있는 슬라이드 위에 프로브 혼합물을 도포합니다. 해당 부위를 18mm x 18mm 유리 커버슬립으로 조심스럽게 덮고, 커버슬립을 슬라이드 쪽으로 매우 살살 눌러 눈에 보이는 기포를 모두 제거합니다.

고무 시멘트를 사용하여 커버슬립의 네 면을 모두 밀봉하십시오. 그리고 습도가 유지되는 챔버 내의 암실에서 37 °C로 12~16시간 동안 슬라이드를 배양하십시오. 하이브리드화 후, 고무 시멘트와 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 슬라이드를 74 °C로 예열된 0.4X SSC에 5분 동안 담그십시오.

그다음 슬라이드를 세 번째 세척 용액에 2분 동안 담급니다. DAPI 대조 염색제가 포함된 항퇴색 마운팅 용액 20 µL를 슬라이드에 추가하고 유리 커버슬립으로 덮습니다. 실험용 티슈 페이퍼를 사용하여 커버슬립을 조심스럽게 눌러 기포와 과잉 마운팅 용액을 제거합니다.

그 다음, 매니큐어를 사용하여 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 적절한 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 관찰하십시오. 마우스 염색체의 스펙트럼 핵형 분석(spectral karyotyping)의 경우, 프로브가 변성된 염색체에 하이브리드화되고 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 세척한 후, 슬라이드에 80 µL의 SY5 염색 시약을 도포하십시오.

24 x 60 mm 플라스틱 커버슬립을 시료 위에 덮고, 37 °C의 습윤 챔버 내 암실에서 40분 동안 배양합니다. 슬라이드를 미리 데워둔 세척액 3이 담긴 유리 코플린 자(coplin jar)에 담근 후, 45 °C의 항온수조에서 2분 동안 흔들어 줍니다. 이 세척 과정을 3회 반복합니다.

샘플에 80 µL의 SY5.5 염색 시약을 처리하고, 24 x 60 mm 플라스틱 커버글라스로 덮은 후 습윤 챔버의 37 °C 암실에서 40분 동안 배양합니다. 미리 데워둔 세척액 3을 사용하여 슬라이드를 3회 세척한 다음, 슬라이드를 종이 타월에 비스듬히 세워 과잉 액체를 제거합니다. 샘플에 20 µL의 antifade DAPI 시약을 첨가하고 공기 방울이 생기지 않도록 주의하며 유리 커버글라스를 위에 덮습니다.

매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉하고, 스카이(sky) 이미지 캡처 장비가 갖춰진 에피형광 현미경으로 시료를 관찰합니다. 이 그림은 정상 및 비정상적인 생쥐 1번, 2번, 3번 염색체 쌍이 포함된 대표적인 중기 세포 도말 표본을 보여줍니다. 여기서는 1번 염색체의 일부가 염색되지 않은 DAPI 염색체에 통합되고 다른 일부는 무중심 단편을 형성한 1번 염색체의 안정적 전좌가 나타나 있습니다.

이 예시에서는 2번 염색체의 일부가 염색되지 않은 염색체로 통합되었습니다. 이 안정적 이상은 3번 염색체와 관련이 있습니다. 이 중기 분열상에서는 염색된 세 개의 염색체 모두가 관여하는 안정적 이상이 관찰됩니다.

여기에 정상 암컷 생쥐의 분광 핵형 분석(spectro karyotyping) 예시가 제시되어 있습니다. 이 패널은 4번과 12번 염색체가 관련된 안정적 변이를 나타냅니다. 마지막으로, 이 패널의 안정적 염색체 변이는 7번과 10번 염색체가 관련되어 있습니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 48에서 72시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 증식하는 세포만 사용해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차와 in band와 같은 다른 방법들을 통해 방사선 조사된 세포에 염색체 간 안정적 이상이 존재하는지 등 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, 분자 세포유전학 분야의 연구자들은 유전적 이상과 다양한 질환 사이의 연관성을 탐구할 수 있는 기반을 마련하였습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 염색체 간 안정적 이상을 결정하는 방법에 대해 더 명확한 개념을 잡으실 수 있을 것입니다. 콜히친(colchicine)은 발암성 물질이므로 취급 시 매우 위험할 수 있으며, 본 실험을 수행하는 동안에는 반드시 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.