여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출 현장에서 하이브리드 (mFISH) 및 방사선 조사 마우스의 스펙트럼 핵형 분석 (SKY)

이 분자 세포 생성 방법의 전반적인 목표는 전신 조사에 노출된 마우스의 골수 세포에서 염색체 간 안정된 이상을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 전신 방사선에 노출된 마우스의 골수 세포에서 안정적인 염색체 이상을 유도할 위험과 같은 방사선 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 세포 세대를 통해 전파될 수 있는 마우스의 골수 세포에서 방사선 유도 안정적인 유전적 손상의 유도 시각화가 가능하다는 것입니다.

마우스 대퇴골 및 경골 뼈에서 골수를 분리하고 텍스트 프로토콜에 따라 단일 세포 현탁액을 만든 후, 동일한 부피의 골수 단핵 세포 분리 배지에 세포 현탁액을 조심스럽게 오버레이합니다. 그래디언트를 실온에서 400배 G로 30분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 나머지 층을 방해하지 않고 버피 코트를 조심스럽게 수집하고 용액을 새로운 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

중기 세포 확산을 준비하려면 버피 코트가 들어 있는 튜브에 PBS 10ml를 추가합니다. 그런 다음 실온에서 400배 G로 튜브를 5분 동안 원심분리합니다. 다음으로 상등액을 조심스럽게 제거하고 튜브를 가볍게 두드려 세포 펠릿을 분해합니다.

그런 다음 PBS 10ml를 넣고 서스펜션을 다시 원심분리합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 제거합니다. 펠릿을 분해하고 부드럽고 지속적으로 흔들면서 예열된 저장성 0.075 몰 염화칼륨 용액 4ml를 한 방울씩 추가합니다.

세포 현탁액을 섭씨 37도의 수조에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브에 같은 양의 고정제를 넣고 튜브를 뒤집어 부드럽게 섞습니다. 튜브를 원심 분리하고 상층액을 제거합니다.

그런 다음 세포 펠릿을 분해하고 새로운 정착제를 추가합니다. 회전과 정착액 추가를 5회 더 반복합니다. 400-600마이크로리터의 고정액에 세포를 재현탁시킨 후, 30마이크로리터의 고정 세포를 45도 각도로 기울어진 사전 세척 및 습식 슬라이드에 떨어뜨리고 슬라이드를 밤새 완전히 자연 건조시킵니다.

mFISH로 마우스 염색체 페인팅을 수행하려면 중기 세포가 포함된 슬라이드를 실온에서 2분 동안 2X SSC에 놓습니다. 그런 다음 70%80%와 100%에탄올로 연속 에탄올 세척으로 슬라이드를 탈수할 때마다 2분 동안 세척합니다. 유리 코플린 병에 담긴 40ml의 변성 용액을 섭씨 70도로 30분 동안 예열합니다.

그런 다음 슬라이드를 예열된 용액으로 옮기고 염색체를 변성시키기 위해 1-1 1/2분 동안 샘플을 배양합니다. 즉시 얼음처럼 차가운 70% 에탄올을 사용하여 슬라이드를 2분 동안 담금질하여 변성 과정을 중단하고 변성된 염색체가 재어닐링되는 것을 방지합니다. 그런 다음 80% 에탄올로 시작하는 에탄올 시리즈를 사용하여 2분 동안 슬라이드를 탈수합니다.

그런 다음 슬라이드를 100% 에탄올에 2분 동안 놓습니다. 그런 다음 슬라이드를 실온에서 완전히 건조시킵니다. 프로브를 변성시키려면 제조업체에서 제공한 프로브 혼합물을 잠시 원심분리한 다음 10마이크로리터를 500마이크로리터 스냅 캡 원심분리기 튜브에 넣고 섭씨 80도의 수조에서 7분 동안 튜브를 배양합니다.

이제 변성된 프로브가 들어 있는 튜브를 섭씨 37도의 수조에 10분 동안 넣습니다. 그런 다음 프로브 혼합물을 변성된 염색체가 있는 슬라이드에 적용합니다. 18mm x 18mm 유리 커버슬립으로 해당 부위를 조심스럽게 덮고 커버슬립을 슬라이드에 아주 부드럽게 눌러 눈에 보이는 기포를 제거합니다.

고무 시멘트를 사용하여 커버슬립의 4면을 모두 밀봉합니다. 그리고 어둠 속에서 슬라이드를 섭씨 37도의 가습실에서 12-16시간 동안 배양합니다. 하이브리드화 후 고무 시멘트와 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 슬라이드를 섭씨 74도에서 5분 동안 예열된 0.4X SSC에 놓습니다.

그런 다음 슬라이드를 세척 용액 3에 2분 동안 옮깁니다. DAPI 카운터스테인이 있는 20마이크로리터의 페이드 방지 장착 매체를 슬라이드에 추가하고 유리 커버슬립으로 덮습니다. 실험실 티슈 페이퍼를 사용하여 커버슬립을 부드럽게 눌러 기포와 과도한 장착 용액을 제거합니다.

그런 다음 매니큐어를 사용하여 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 적절한 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 봅니다. 마우스 염색체의 스펙트럼 핵형 분석의 경우, 프로브를 변성된 염색체에 하이브리드화하고 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 세척한 후 80마이크로리터의 SY5 염색 시약을 슬라이드에 적용합니다.

샘플 위에 24 x 60mm 플라스틱 커버슬립을 놓고 섭씨 37도의 가습 챔버에서 40분 동안 어둠 속에서 배양합니다. 미리 데워진 세척액 3개가 들어 있는 유리 코플린 병에 슬라이드를 담그고 섭씨 45도의 수조에서 2분 동안 흔들면서 배양합니다. 세탁을 세 번 반복합니다.

80마이크로리터의 SY5.5 염색 시약을 샘플에 적용하고 24 x 60mm 플라스틱 커버슬립으로 덮은 다음 섭씨 37도의 가습실에서 40분 동안 어둠 속에서 배양합니다. 예열된 세척액을 세 번 사용하여 슬라이드를 세 번 세척한 다음 종이 타월에 기대어 슬라이드를 기울어진 위치로 잡고 과도한 액체를 배출합니다. 샘플에 20마이크로리터의 퇴색 방지 DAPI 시약을 추가하고 기포가 발생하지 않도록 상단에 유리 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다.

매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉하고 하늘 이미지를 캡처할 수 있는 방현 형광 현미경으로 샘플을 관찰합니다. 이 그림은 정상 및 이상 마우스 염색체 쌍 1, 2, 3을 가진 대표적인 중기 세포 확산을 보여줍니다. 다음은 염색체와 관련된 안정적인 수차로, 염색체의 일부는 도색되지 않은 DAPI 염색체에 통합되고 다른 부분은 심심 단편을 형성합니다.

이 예에서는 염색체 2의 일부가 도색되지 않은 염색체에 통합되었습니다. 이 안정되어 있는 수차는 염색체 3번을 포함한다. 세 개의 색칠된 염색체 모두를 포함하는 안정적인 수차가 이 중기 확산에서 나타납니다.

여기에 표시된 것은 정상적인 암컷 마우스의 분광 핵형 분석의 예입니다. 이 패널은 염색체 4번과 12번과 관련된 안정적인 수차를 나타냅니다. 마지막으로, 이 패널에서 안정적인 염색체 이상은 염색체 7번과 10번을 포함합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 48시간에서 72시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 증식하는 세포만 사용해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따르고 대역 내와 같은 다른 방법을 사용하여 조사된 세포에 염색체 간 안정 이상이 존재하는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 분자 세포 유전학 분야의 연구자들이 다양한 질병과 유전적 이상 사이의 연관성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 염색체 간 안정 수차를 결정하는 방법을 더 명확하게 알 수 있을 것입니다. 콜히친으로 작업하는 것은 발암 물질이기 때문에 매우 위험할 수 있으며 이 실험을 수행하는 동안 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.