E4orf4 - 유도 세포 사망에 최저 효과의 유전자 발현 및 측정의 조건부 최저위한 셀 라인의 작성

다음 실험의 전반적인 목표는 ACF 1 또는 SNF 2 H 녹다운이 E 4 또는 4 유도 세포 사멸에 미치는 영향을 관찰하는 것입니다. 이는 독시사이클린(doxycycline)을 첨가하여 ACF one 또는 SNF two H srna 발현이 조건부로 활성화되는 세포주를 생성함으로써 달성되며, 그 결과 두 번째 단계로 ACF one 또는 SNF two H 단백질의 수치가 감소합니다. 얻어진 세포주의 세포는 ACF 1 또는 SNF 2 H 발현을 감소시키기 위해 독시사이클린으로 처리하거나 치료하지 않고 방치합니다.

다음으로, S-H-R-N-A 내성이 있거나 없는 세포에서 4개 또는 4개의 세포가 발현되며, ACF 1 또는 SNF 2 H.In E에 대한 ACF 1 또는 SNF 2 H의 효과를 조사하기 위해 4 또는 4 유도 세포 사멸 결과를 얻어지며, 이는 JY 분석을 사용하여 자가사멸 형태를 가진 핵의 계수에 기초하여 ACF 1 또는 SNF 2 H 수치가 E 4 또는 4 독성에 미치는 영향을 보여준다. RNA의 일시적 형질주입(transfection)과 같은 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 모든 세포가 S-H-R-N-A를 발현하고 기존 플라스미드와 함께 발현하는 세포의 비율이 더 높다는 것입니다. 이 방법은 4 0 4가 세포 사멸을 유도하는 경우 기저에 있는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하지만 다른 양성자 단백질 연구에도 적용할 수 있습니다.

Ana Lafe 외에도 제 연구실의 연구원이 이 절차의 일부를 시연할 예정입니다: 테트라사이클린이 없는 혈청이 함유된 8밀리리터의 DMEM에 10cm 플레이트당 6개의 세포에 약 5배의 10 밀도로 유도성 세포주 플레이트 T-Rex 2 9 9 3 세포를 생성하는 절차를 시작하고 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양하고 5%다음날 이산화탄소. transfection하기 전에 배지를 8ml의 새 배지로 교체하십시오. transfection을 위한 플라스미드는 ACF 1 또는 SNF 2 H-S-H-R-N-A를 암호화하는 P superior neo plus GFP 플라스미드이며, 테트라사이클린 유도성 H one promoter에 의해 구동되며, GFP를 융합하고 구성적인 PGK promoter에 의해 구동되는 neomycin resistance gene입니다.

10마이크로그램의 플라스미드 DNA를 500마이크로리터의 150밀리몰 염화나트륨과 와류에 추가합니다. 그런 다음 DNA 마이크로그램당 2마이크로리터의 제트 PY 시약을 500마이크로리터의 150밀리몰 염화나트륨 및 와류가 있는 다른 튜브에 추가합니다. DNA에 제트 파이 용액을 넣고 볼텍싱으로 잘 섞습니다.

실온에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후, 70-80%의 합류점을 포함하는 10cm 플레이트에 DNA 복합체를 부드럽게 피펫으로 삽입하십시오. T-Rex 2 9 3 세포는 다음 날에 혼합됩니다.

이 예에서 매체를 이전과 같이 G 4 18의 밀리리터당 500마이크로그램을 포함하는 선택적 매체로 교체합니다. 다음 2주 동안 세포를 모니터링합니다. 콜로니가 나타날 때까지 3-4일마다 선택적 배지를 유사한 새 배지로 교체하십시오.

눈으로 군체를 식별하고 컬러 마커를 사용하여 플레이트 바닥에 군체의 위치를 표시합니다. 현미경으로 군체가 잘 분리되어 있는지 확인합니다. 군체는 현미경 없이 시각화할 수 있을 만큼 충분히 커지면 격리할 수 있습니다.

이 절차의 성공을 위해서는 집락 격리 중에 잘 분리된 집락을 선택하는 것이 중요합니다. 멸균 후드에서 플레이트에서 매체를 흡입합니다. PBS로 부드럽게 헹구고 남은 액체를 모두 흡입하십시오.

세포가 플레이트에서 분리 될 때까지 반복적으로 트립을 애완 동물로 플레이트의 한 콜로니에 EDTA의 0.25 % 트립 3 마이크로 리터를 추가합니다. 세포를 24웰 플레이트의 웰에 있는 선택적 배지로 옮깁니다. 플레이트의 다른 여러 식민지에 대해 이 작업을 반복합니다.

세포가 우물을 채울 때까지 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 성장시킵니다. 그런 다음 각 원래 콜로니의 세포를 각각 별도의 12웰 플레이트에 있는 3개의 웰로 분할하고 다음 날 밤새 배양합니다. 한 플레이트의 매체를 이중 증류수로 준비된 원액에서 추출한 독시사이클린 밀리리터당 1마이크로그램을 함유한 배지로 교체합니다.

대조판의 매체를 독시사이클린이 없는 매체로 교체하십시오. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 72시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 1개의 처리된 웰과 1개의 처리되지 않은 웰의 세포를 웨스턴 블롯 분석을 위해 수확하여 ACF 1 또는 SNF 2 H의 효율을 측정하고 대표적인 결과를 노크다운한 것이 여기에 나와 있습니다.

이 블롯은 SNF 2 H 및 알파 튜불린에 대한 항체로 염색되었습니다. 후자는 클론 중 두 마리의 로딩 컨트롤 역할을 합니다. 4번과 5번은 독시사이클린 유도 시 SNF 2H의 강한 감소를 보였으므로 다음 세그먼트에서 시연될 녹다운 실험에 사용하기 위해 선택되었습니다.

세 번째 플레이트에서 처리되지 않은 세포는 선택된 세포주를 확장하는 데 사용되며 해당 세포의 부분 표본은 이후에 동결됩니다. 10cm 플레이트의 선택적 배지에서 ACF 1 또는 SNF 2 개의 H 플레이트 셀의 녹다운을 유도하기 위해 추가로 사용하려면 플레이트의 절반에 밀리리터당 1마이크로그램의 독시사이클린을 추가하고 48-72시간 동안 섭씨 37도, 5% 이산화탄소를 배양합니다. 각 플레이트 그룹은 각 포인트에 대한 DPI 분석을 위한 2개의 복제본과 각 샘플의 웨스턴 블롯 분석을 위한 1개의 플레이트를 포함하여 12개의 6cm 플레이트에 대한 셀을 제공해야 합니다.

유도 트립신 후 48-72 시간 후 각 세포 그룹의 세포를 코로 만들고 독시사이클린의 유무에 관계없이 동일한 배지에서 6 cm 플레이트당 6 개의 세포에 1.5 배 10 번 플레이트를 계산합니다. 다음 날 밤새 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 세포를 배양하고 세포를 형질주입합니다. 표시된 대로.

처리되지 않은 세포와 독시사이클린이 투여된 세포는 모두 4가지 방법으로 3회에 걸쳐 transfection됩니다. 하나는 빈 플라스미드와 GFP를 발현하는 플라스미드, 2개는 빈 플라스미드와 SHRA 내성 ACF를 발현하는 벡터, 1개의 GFP 또는 SNF는 2개, HGFP 3개는 E4 또는 4를 인코딩하는 플라스미드, GFP를 발현하는 플라스미드는 4개, 모두 4개입니다. 그리고 transfection 후 SHRA 저항성 ACF 1 GFP 또는 SNF 2 HGFP를 발현하는 벡터는 모든 플레이트를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 5%의 이산화탄소로 배양합니다.

세포의 transfection 다음 날, 웨스턴 블롯 분석을 위해 샘플당 하나의 플레이트에서 단백질을 추출하여 ACF 1 또는 SNF 2 H가 효율적으로 녹다운되었는지, 그리고 E, 4 또는 4가 서로 다른 샘플에서 동일하게 발현되었는지 확인합니다. 나머지 16개 플레이트는 DPI 분석에 사용됩니다. DPI 분석을 위한 플레이트에서 배지를 흡인하고 PBS In a chemical hood로 세포를 부드럽게 세척합니다.

PBS에서 제조된 4%파라 포름알데히드 1ml를 첨가하여 세포를 덮고 흔들림 없이 실온에서 15분 동안 배양합니다. 파라 포름알데히드를 흡입하고 PBS로 5분 동안 실온에서 흔들어 세척합니다. 세 번째 PBS 세척 후 총 3회 세척 후 두 번 더 세척합니다.에탄올은 섭씨 영하 20도에서 유지하고 섭씨 영하 20도에서 최소 1시간 동안 배양합니다.

에탄올을 흡인하고 PBS로 세포를 2회 세척하고, 실온에서 5분씩 흔들어 매번 0.5%BSA와 0.05%20 또는 P-B-S-B-T를 함유한 PBS로 실온에서 5분씩 세척한다. 또한 비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 흔들림이 있습니다. 염소 혈청 10%가 함유된 P-B-S-B-T 완충액 1ml에 담긴 세포를 실온에서 흔들면서 20분 동안 차단합니다.

그런 다음 P-B-S-B-T에서 세포를 두 번 세척하십시오 각 세척 5 분. 1차 항체인 E 4 또는 4 특이적 항체(이 경우 1ml의 P-B-S-B-T)를 넣고 실온을 흔들면서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 P-B-S-B-T에서 두 번 세척하고 0.1%BSA를 함유한 PBS에서 한 번 세척할 때마다 5분 동안 세척합니다.

다음으로, 적절한 2차 형광 표지 항체를 포함하는 PBS 0.1%BSA 1ml와 밀리리터당 0.5마이크로그램을 세포에 추가합니다. DPI의 최종 농도는 어둠 속에서 실온에서 흔들면서 40분 동안 배양합니다. 마지막으로 PBS로 5분 동안 씻습니다.

흡인에 의해 우물을 건조시키고 플레이트를 한 시간에서 밤새 더 거꾸로 유지하여 완전히 건조시키고 flora Mount G 솔루션을 사용하여 셀의 알루미늄 호일 마운트 커버 슬라이드로 덮습니다. 계산할 준비가 될 때까지 어둠 속에서 접시를 섭씨 4도로 유지하십시오. 프로토콜에 기술된 다양한 처리를 거친 세포사멸 세포를 고정하고 E, 4개 또는 4개의 특이적 항체 및 DPI로 염색하여 형질주입된 세포의 핵을 시각화했습니다.

이 그림은 E를 4개 또는 4개 발현하는 세포의 예를 보여주고, GFP 패널 A는 GFP 단백질 발현을 단독으로 조절하는 세포를 보여주고, 패널 B는 E를 보여주며, 패널 C에는 4개 또는 4개의 DAPI 염색 핵이 나타나고, 병합된 이미지는 패널 D.The 흰색 화살표 표시, GFP 및 E.4 또는 4개의 형질주입 세포에 표시되며, apoptotic morphology를 가진 핵을 포함하는 4개 또는 4개의 형질주입된 세포입니다. 빨간색 화살표는 apoptotic nucle로 계산되지 않는 불규칙한 모양의 핵을 표시하고, 별표는 유사분열 nuclei 또는 DAPI에 의해 시각화된 응축되거나 단편화된 nuclei의 수를 나눈 nuclei를 표시합니다. 검사의 최적 객관성을 유지하기 위해 형질주입된 세포 집단 내에서 세포사멸 형태를 가진 핵의 비율을 계산하기 위해 염색을 세었습니다.

다양한 샘플에서 apoptotic nucleo의 계수는 계수하는 사람이 샘플 정체성을 인식하지 못하는 블라인드 방식으로 수행되었으며, 대표적인 결과가 이 그래프에 나와 있습니다. E, 4 또는 4 발현 세포에서 더 높은 비율의 핵 이상이 관찰되었으며, T, 4 또는 4가 세포 사멸을 유도한다는 것을 확인했습니다. 핵 이상의 가장 높은 비율은 E, 4 또는 4 발현 세포에서 관찰되었는데, ACF 1의 수준은 SHR에 의해 감소하고 ACF 1 녹다운은 E 4 또는 4 Inge 세포 사멸을 증가시키고 E 4 또는 4 세포의 독성을 향상시켰음을 나타내는 매개 녹다운이었습니다.

ACF 1의 낮은 수치를 나타내는 것은 웨스턴 블롯에서 볼 수 있는 것처럼 E 4 또는 4 수치의 증가로 인한 것이 아닙니다. 이 절차를 수행하는 동안 DPI를 사용한 자가사멸 핵 스텐트의 조언 계수를 용이하게 하고 이 핵의 식별에 대해 엄격한 기준을 적용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 절차 외에도, 이러한 절차에 따라 DA pse의 결과를 검증하기 위해 클론 유전자 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

추가 질문에 답하기 위해 co immunoprecipitation assay와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 조사된 단백질 사이에 물리적 상호 작용이 있는지 여부입니다.