TALEN 매개 표적 유전자 통합: 형광 단백질 유전자를 hiPSC에 정밀하게 삽입하기 위해 엔지니어링된 염기서열 특이적 뉴클레아제 사용

배지에 인간 유도 만능 줄기 세포 또는 hiPSC 현탁액으로 시작합니다. 한 쌍의 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 또는 TALEN 암호화 플라스미드를 추가합니다. 항생제 내성 유전자와 결합된 형광 단백질 유전자를 포함하는 기증자 플라스미드로 보충하고, 표적 유전자좌에 대한 특정 정렬을 위한 인접한 상동성 암이 있습니다.

혼합물을 전기천공하여 세포막에 일시적인 기공을 생성하여 플라스미드 내재화를 가능하게 합니다. 일단 세포 내부로 들어가면 TALEN을 암호화하는 플라스미드가 처리되어 비특이적 FokI 제한 엔도뉴클레아제 절단 도메인에 융합된 부위 특이적 TALE DNA 결합 도메인으로 구성된 키메라 단백질인 TALEN을 생성합니다.

탠덤 아미노산 반복 모듈로 구성된 DNA 결합 도메인을 통해 각 TALEN 단량체는 스페이서 서열로 분리된 반대 방향의 각 DNA 가닥에서 뉴클레오티드당 하나의 모듈인 표적 유전자좌를 인식하고 결합합니다. 그런 다음 FokI 도메인은 스페이서 서열 내에서 DNA를 이량체화하고 절단하여 돌출부가 있는 이중 가닥 절단을 생성합니다.

절단된 부위 측면의 영역에 상보적인 상동성 팔을 포함하는 기증자 플라스미드가 있는 경우, 이중 가닥 절단을 연결하기 위해 DNA 복구 합성을 위한 주형으로 상동 서열을 활용하여 상동성 지향 복구가 발생합니다. 흠집을 결찰한 후 중재하는 형광 단백질과 항생제 내성 유전자가 숙주 게놈에 통합됩니다.

성장을 지원하기 위해 피더 세포층에 파종된 hiPSC를 항생제 함유 배지로 처리합니다. 업스트림 내인성 프로모터에 의해 구동되는 프로모터가 없는 항생제 내성 유전자는 TALEN 편집 세포의 선택을 용이하게 합니다.

먼저 iPSC 배양액을 PBS로 각각 한 번 세척한 다음 섭씨 37도의 부드러운 세포 해리 시약 1밀리리터를 각 웰에 첨가하고 세포를 섭씨 37도에서 약 5분 동안 배양합니다. 세포의 50% 이상이 배양 용기에서 해리되면 P1000 피펫을 사용하여 남아 있는 세포 덩어리 또는 부착된 세포를 기계적으로 파괴합니다. 그런 다음 각 웰에 2밀리리터의 E8 배지를 추가하고 10밀리리터 피펫을 사용하여 배양물을 단일 세포 현탁액으로 추가로 분해합니다.

이제 수확한 세포를 15밀리리터 원뿔형 튜브에 붓고 아래로 돌립니다. 계수를 위해 펠릿을 최소량의 E8 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 트리판 블루 배제에 의한 배양의 생존력과 충분한 해리를 확인한 후, 300만 개의 세포를 2개의 15밀리리터 원뿔형 튜브 각각으로 옮깁니다.

세포가 원심분리되는 동안 전기천공 시스템을 인간 배아 줄기 세포주인 H9에 대한 세포 유형 특이적 프로그램으로 설정합니다. 그런 다음 대조군 샘플의 경우 상동 재조합 공여체 10마이크로그램을 펠릿 1개에 단독으로, 실험 샘플의 경우 상동 재조합 공여체 플라스미드 10마이크로그램과 각 TALEN 플라스미드 5마이크로그램을 추가합니다.

다음으로, 100마이크로리터의 실온 완전 P3 1차 세포 형질감염 용액을 대조군 및 실험 펠릿 각각에 첨가하고 세포를 재현탁합니다. 샘플을 개별 큐벳으로 옮긴 다음 샘플을 전기 천공합니다. 형질감염 직후, 각 큐벳에 500마이크로리터의 실온 E8 배지를 첨가한 다음, 절단된 iPSC 샘플을 DR4 마우스 배아 섬유아세포를 포함하는 개별 10센티미터 접시에 적하 단위로 옮깁니다.