Name: 원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 배우세요 원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이를 도입하는 방법을. Cas9 니카제와 piggyBac 기반 기증자 플라스미드를 활용하여 HNF4α 유전자에 정밀한 변형을 가하고 푸로마이신 선택으로 편집된 세포를 효율적으로 분리합니다.

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pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK 및 pCMV-hyPBase 플라스미드를 공유해 주신 Kosuke Yusa에게 감사드립니다. 게놈 편집에 대한 유용한 토론을 해주신 Jia-Yin Yang과 Karamjit Singh-Dolt에게 감사드립니다. D.C.H. 연구소는 Chief Scientist Office (TC / 16 / 37) 및 UK Regleative Medicine Platform (MR / L022974 / 1)의 상을 수상했습니다. Y.W.는 중국 장학금 위원회와 에든버러 대학교가 후원하는 박사 장학금의 지원을 받았습니다.

1. CRISPR/Cas9n-sgRNA 발현 플라스미드 설계 및 구성
<ol><li>수정할 부위 근처의 5'-NGG의 바로 업스트림에 있는 20bp 가이드 시퀀스를 검색합니다. 스트렙토코커스 화농성의 Cas9 니카제(Cas9n)를 사용할 때는 한 쌍의 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 필요합니다. 한 쌍의 sgRNA는 -4 내지 20 bp 오프셋6으로 니킹 시 5' 오버행을 생성할 수 있어야 한다.</li>
	<li>필요한 올리고와 pSpCas9n-2A-퓨로 벡터를 주문하십시오.</li>
	<li>공개된 프로토콜12에 따라 Cas9n과 공동 발현하기 위해 pSpCas9n 벡터 내로 sgRNA를 복제합니다.</li>
</ol>2. piggyBac 기반 타겟팅 벡터 설계 및 구성
<ol><li>표적 유전자 서열을 다운로드하고 변형할 부위 근처의 TTAA 부위를 검색한다. 참고: TTAA 사이트와 수정할 사이트 사이의 거리는 가능한 한 작아야 합니다. 코딩 서열 내에 있고 TTAA 부위가 100-bp 거리 내에 존재하지 않는 경우, 동의어 뉴클레오티드 치환을 만들어 TTAA 부위를 도입할 필요가 있다.</li>
	<li>상동성 암(HA)을 설계하고 HA에 원하는 점 돌연변이를 통합합니다. HA의 최적 길이는 약 500 - 1200 bp 여야합니다. 참고: 잠재적인 Cas9n 재절단을 피하기 위해 PAM 서열을 돌연변이시키기 위해 동의어 뉴클레오티드 치환을 도입하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>확립된 프로토콜10에 따라 최종 표적화 벡터를 구축한다. 참고: 여기에 사용된 표적화 벡터에서, PGK 프로모터 구동 puro-deltaTK 선택 카세트는 트랜스포존 반전 반복에 의해 측면에 있다.</li>
</ol>3. 인간 만능줄기세포의 유전자 편집
<ol><li>mTeSR1 배지13의 재조합 라미닌 521 코팅 표면 (5 μg / mL)에서 37 ° C 및 5 % CO2의 가습 인큐베이터에서 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC)를 유지합니다. 세포는 1:3 분할 비율 후 72시간 후에 70-85% 컨플루언시에 도달해야 합니다. 참고: 존재하는 경우, 매일 배지를 바꾸기 전에 자발적으로 분화된 세포를 부드럽게 흡인하여 제거하십시오.</li>
	<li>형질주입 당일에, 24웰 플레이트의 웰을 37°C에서 300μL의 라미닌 521 용액(5μg/mL)으로 최소 2시간 동안 코팅합니다.</li>
	<li>코팅 용액을 부드럽게 제거하고 10μM ROCK 억제제가 보충된 신선한 mTeSR1 배지 300μL를 각 웰에 추가한 다음 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣어 세포를 받습니다. 알림: 라미닌 코팅 용액을 제거할 때 플레이트가 건조되지 않도록 하십시오.</li>
	<li>인큐베이터에서 스톡 hPSC를 옮기고 사용한 배지를 제거한 다음 멸균 1x DPBS 1mL를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다.</li>
	<li>1mL의 부드러운 세포 해리 시약을 6웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 37°C에서 6-8분 동안 배양하여 세포를 해리합니다. 알림: 플레이트를 부드럽게 두드리고 세포가 쉽게 분리될 수 있는지 확인하여 소화가 충분히 긴지 여부를 결정합니다.</li>
	<li>P1000 팁을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 모든 hPSC를 들어 올립니다.</li>
	<li>10μM ROCK 억제제(Y-27632)가 보충된 신선한 mTeSR1 배지 2mL를 세포 현탁액에 추가하여 해리를 종료합니다.</li>
	<li>잘 혼합하고 단일 세포 현탁액을 50mL 튜브로 옮기고 실온에서 3분 동안 200 x g 에서 원심분리합니다.</li>
	<li>상청액을 제거하고, 10 μM ROCK 억제제가 보충된 2 mL의 신선한 mTeSR1 배지에 세포를 웰 재현탁시킨다.</li>
	<li>혈구계를 사용하여 생존 세포를 계수하십시오. 트리판 블루를 사용하여 죽은 세포를 염색하고 배제합니다.</li>
	<li>각 뉴클레오펙션 반응을 위해 8 x 105 대 1 x 106 개의 살아있는 세포를 1.5mL 튜브로 옮기고 200 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 조심스럽게 흡인하십시오.</li>
	<li>인간 줄기 세포 핵 절제 키트의 혼합 핵 펙션 용액 / 보충제 100μL에 쌍을 이루는 Cas9n-sgRNA 발현 플라스미드 3μg과 표적 벡터 플라스미드 5μg을 혼합합니다. 키트로부터의 GFP 대조군 플라스미드를 사용하고 GFP 대조군 플라스미드 믹스도 제조한다. 참고: 핵형성 전에 내독소 오염을 줄이기 위해 모든 플라스미드의 맥시 프렙을 만드는 것이 중요합니다. 플라스미드의 농도는 약 1μg/μL이어야 합니다.</li>
	<li>DNA 믹스(부피 ~111μL)를 사용하여 준비된 세포를 재현탁하고 기포를 피하면서 전기천공 큐벳(뉴클레오펙션 키트와 함께 제공됨)으로 옮깁니다.</li>
	<li>핵 장치를 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포에 최적화 된 조건을 선택하여 세포를 전기 천공합니다. 참고 : 인간 다 능성 줄기 세포에 핵 펙션 키트를 처음 사용하는 경우 전기 천공 프로그램을 테스트하고 가장 효율적인 프로그램을 선택해야합니다.</li>
	<li>전기천공된 세포에 10μM ROCK 억제제가 보충된 37°C mTeSR1 배지에 신선하고 따뜻한 500μL를 즉시 추가합니다. 혼합물을 단계 3.2 및 3.3으로부터 제조된 24-웰 플레이트의 2웰로 옮긴다.</li>
	<li>플레이트를 신속하게 37 ° C / 5 % CO2 인큐베이터에 다시 넣고 세포가 회복되도록합니다.</li>
	<li>12-16시간 후에 셀 유지 관리 매체를 교체합니다. 세포가 세포-세포 접촉을 확립한 경우, ROCK 억제제를 중단하고, 그렇지 않다면, 억제제로 배지를 계속 보충한다.</li>
	<li>24-48시간 사이에 대조군 세포에서 GFP 발현을 검사하여 뉴클레오펙션 효율을 확인합니다. GFP 양성 세포는 30% 이상이어야 합니다.</li>
	<li>핵 형성 48시간 후, mTeSR1 배지에 1μg/mL 퓨로마이신을 보충하여 세포 선택을 시작합니다.</li>
	<li>핵 채취 후 72시간 후에 mTeSR1 배지에 0.5μg/mL 퓨로마이신을 보충합니다. 세포 컨플루언시가 30% 미만인 경우, 또한 10 μM ROCK 억제제로 배지를 보충한다.</li>
	<li>핵체 채취 후 4-6일 후, 퓨로마이신 내성 세포를 0.8 세포/웰의 농도로 10-15 x 96-웰 플레이트에 계대합니다. 참고: 10μM ROCK 억제제와 0.5μg/mL 퓨로마이신으로 배지를 보충하는 것이 필수적입니다.</li>
	<li>이들 세포를 37°C/10%CO2 에서 10-12일 동안 유지하여 단일 세포 유래 콜로니를 형성한다. 파종 후 7 일 후에 한 번 매체를 채우십시오. 알림: 증가 된 CO2 수준은 우리의 경험에서 단일 hPSC가 식민지를 형성하는 데 도움이됩니다.</li>
	<li>단일 콜로니가 포함된 웰을 표시하고 배지를 0.5μg/mL 퓨로마이신이 포함되지만 ROCK 억제제가 없는 신선한 mTeSR1 배지로 교체합니다. 참고: 이 시점부터 세포는 37°C/5%CO2 하에서 성장합니다.</li>
	<li>이틀 후, 미분화 콜로니를 포함하는 웰의 배지를 변경하십시오. 배지에 10μM ROCK 억제제와 0.5μg/mL 퓨로마이신을 보충합니다. 참고: 일부 웰에서는 세포가 분화되어 폐기해야 할 수 있습니다.</li>
	<li>P2 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 부드럽게 긁어냅니다. 하나의 콜로니에서 파생된 세포 현탁액을 별도의 96웰 플레이트에 있는 2개의 새로운 웰로 옮기고 하나는 유전형 분석에 사용하고 다른 하나는 유지에 사용합니다. 알림: 콜로니를 조심스럽게 유지하고 자발적인 분화 수준을 최소한으로 유지하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>대부분의 웰에서 컨플루언스가 50% 이상에 도달하면 유전형 분석을 위해 세포가 들어 있는 플레이트를 꺼냅니다. 사용한 배지를 덤프 한 다음 DPBS로 세포를 한 번 세척하십시오.</li>
	<li>Bradley 용해 완충액을 사용하여 웰에서 세포를 용해하고 관련 프로토콜(https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate)에 따라 플레이트의 각 웰에서 게놈 DNA를 분리합니다.</li>
	<li>3-프라이머 접합 PCR 방법을 사용하여 좌측 및 우측 상동성 모두를 독립적으로 유전자형화한다10. 참고: PCR 방법을 보여주는 체계가 그림 2에 나와 있습니다.</li>
	<li>Sanger 시퀀싱을 위해 4-5개의 콜로니에서 두 상동성 암에 대한 접합 PCR 산물을 보내고 서열을 얻습니다. 참고: 2개의 확립된 콜로니의 시퀀싱 결과는 그림 3A에 나와 있습니다.</li>
	<li>올바른 유전자형으로 식민지를 유지하고 나머지는 폐기하십시오.</li>
	<li>지속적인 puromycin 선택하에 올바른 콜로니를 확장하고 가능한 한 빨리 동결하십시오.</li>
</ol>4. 표적 인간 만능 줄기 세포에서 트랜스포존 제거
<ol><li>0.5 μg/mL 퓨로마이신 선택 하에서 올바른 유전자형을 가진 하나의 콜로니를 유지하십시오.</li>
	<li>뉴클레오펙트 8 x 10 5 내지 1 x 10 상기 기재된 바와 같이5 μg 과민성 트랜스포아제 (pCMV-hyPBase)를 갖는6 세포 (섹션 3, 단계 3.4-3.18). GFP 대조군 뉴클레오펙션을 병렬로 수행합니다. 알림: 퓨로 마이신은 이러한 세포를 핵 형성 한 직후 mTeSR1 배지에서 제거해야합니다.</li>
	<li>공개된 절차10에 따라 제거된 puro-deltaTK 선택 카세트로 세포를 성장시키고 스크리닝합니다. 참고: 원래 절차를 주의 깊게 따르는 것이 중요합니다. FIAU 또는 1-(2-데옥시-2-플루오로-β-d-아라비노푸라노실)-5-요오도라실)는 단순 포진 바이러스 유래 티미딘 키나아제(HSV-tk)계 음성 선택을 위한 티미딘 유사체로서 사용되었다.</li>
	<li>트랜스포존의 제거를 확인하기 위해 변형된 영역을 시퀀싱한다. 참고: 3개의 확립된 콜로니의 시퀀싱 결과는 그림 3B에 나와 있습니다.</li>
	<li>올바른 유전자형으로 식민지를 유지하고 추가 사용을 위해 확장하십시오.</li>
	<li>추가 분석을 위해 사용하기 전에 선택한 콜로니에서 다 능성 마커의 특성화를 수행하십시오. 참고: 확립된 두 콜로니의 특성은 그림 4에 나와 있습니다.</li>
</ol>

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<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).</li>
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</ol>

D.C.H는 Stemnovate Limited의 공동 설립자, 주주 및 이사입니다.

본원에 기재된 프로토콜은 hPSC의 내인성 유전자좌에 소정의 점 돌연변이를 도입하는데 사용될 수 있다. piggyBac 기반 표적 벡터와 쌍을 이루는 CRISPR/Cas9n 발현 플라스미드의 조합은 신뢰할 수있고 효율적인 것으로 입증되었습니다11. HNF4α 유전자 편집 후, 분석된 클론 43개 중 12개가 접합 PCR 스크리닝에 의해 결정된 대로 정확하게 표적화되었다. 구체적으로, 이중 대립 유전자 표적화 효율은 약 21 % (9/43)이고 단일 대립 유전자 표적화 효율은 약 7 % (3/43)였다.
표적화 실험 후, 첫 번째 스크리닝 동안 표적 유전자좌가 piggyBac 트랜스포아제에 접근할 수 있도록 퓨로마이신 선택을 유지하는 것이 중요합니다. 이는 PGK 프로모터 구동 puro-deltaTK 선택 카세트의 침묵을 최소화하고 스크리닝(10)의 제2 라운드에서 배경을 감소시킬 것이다. 최근 보고서에 따르면 CAG 프로모터는 hPSC14에서 PGK 프로모터보다 침묵에 더 내성이 있습니다. 따라서 선택 카세트의 프로모터를 변경하면 향후 이 시스템을 개선할 수 있습니다. hyPBase- 및 GFP- 형질감염된 세포의 내성 콜로니의 수를 비교하는 것도 중요합니다. 트랜스포존이 성공적으로 제거되면, GFP-형질감염된 세포보다 hyPBase-로부터 더 많은 생존 콜로니가 있어야 한다. 트랜스포존 절제의 PCR 분석 외에도 절제 충실도를 확인하기 위해 변형 된 영역의 직접 시퀀싱이 필요합니다.
Yusa의 piggyBac 트랜스포존 기반 표적 벡터 전략 9,10을 기반으로 위에서 설명한 절차는 hPSC 뉴클레오펙션 및 단일 세포 클로닝 효율성을 개선하는 데 중점을 두었습니다. 세포 파종 밀도는 이질적인 콜로니 형성 가능성을 줄이기 위해 최적화되었습니다. 우리는 또한 유전자형 스크리닝을 위한 콜로니 생산을 향상시키기 위해 10% CO2 미만의 10-12일 배양을 사용했습니다. 우리의 경험에 따르면 각 20웰 플레이트에서 약 96개의 콜로니를 얻을 수 있습니다. 이 단계는 다른 방법보다 시간이 오래 걸릴 수 있지만 안정적이고 매우 효율적입니다.
필요에 따라 표적화 벡터를 설계하여 점 돌연변이를 도입하거나 교정하고, 리포터 세포주를 생성하고, 녹아웃 유전자 발현을 할 수 있습니다. 결론적으로, CRISPR/Cas9(n) 시스템과 표적 벡터의 조합은 다양한 유형의 유전자 변형 hPSC를 전달하는 효율적인 방법입니다.

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 연구 또는 클리닉1을위한 체세포의 무제한 공급원을 나타냅니다. hPSC의 유전자 표적화는 세포 사양 동안 유전자 기능을 연구하고 질병의 메커니즘을 이해하는 강력한 방법을 제공합니다. 효율적인 게놈 편집 방법이 존재하지만 hPSC에서 유전자를 수정하는 것은 기술적으로 여전히 어렵습니다. hPSC에서 상동 재조합에 의한 표준 유전자 표적화는 낮은 빈도에서 발생하거나 일부 유전자2에서 검출할 수 없으며, 따라서 DNA 이중 가닥 절단(DSB) 자극 유전자 표적화(유전자 편집이라고 함)가 이들 세포에서 필요하다 2,3. 추가로, hPSC의 형질감염 및 후속 단일 세포 클로닝은 단일 세포 관련 아폽토시스가 Rho-관련 단백질 키나아제 (ROCK) 억제제4의 사용을 통해 감소될 수 있음에도 불구하고 매우 효율적이지 않다. 마지막으로, 관심 유전자에서의 잠재적 인 표적 및 표적 외 돌연변이도 문제가 될 수 있습니다. 따라서 hPSC에서 맞춤형 유전적 변화를 일으키기 위해서는 신뢰할 수 있는 프로토콜이 필수적입니다.
RNA 유도 CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) 및 CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 기술은 이제 유전자 편집에서 잘 확립 된 도구입니다. 전사된 CRISPR RNA(crRNA)와 트랜스-활성화 RNA(tracrRNA)는 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 형성하며, 이는 Cas9 단백질과 복합체를 이루어 유전자 특이적 절단5을 허용합니다. CRISPR/Cas9 시스템은 sgRNA의 20bp 가이드 서열을 변경하여 프로그래밍할 수 있으며, 이는 원형계-인접 모티프(PAM) 요구 사항을 충족하는 거의 모든 유전자좌를 편집할 수 있음을 의미합니다. 그러나 야생형 Cas9는 가이드 서열과 DNA 표적 사이의 일부 불일치를 견딜 수 있으며, 이는 원치 않는 표적 외 효과를 유발할 수 있습니다. 특이성을 향상시키기 위해 닉카제 돌연변이 체 (Cas9n)가 개발되었습니다. D10A 또는 N863A 돌연변이를 포함하는 Cas9n은 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인만 가지고 있으며 결과적으로 한 가닥에만 DNA를 닉닉할 수 있습니다. 적절하게 이격되고 배향된 한 쌍의 Cas9n은 DNA DSB를 효과적으로 유도할 수 있으며 표적 외 효과는 극적으로 감소합니다6. 효율적인 Cas9n 변형을 보장하기 위해, 2개의 Cas9n-sgRNA는 이상적으로 -4 내지 20 bp 오프셋으로 배치되어야 하고 항상 5'오버행6을 생성해야 하는 것으로 나타났다.
Cas9(n)-sgRNA 유도 DSB는 hPSC 7,8에서 게놈 편집에 활용될 수 있습니다. 비상동 말단 접합 복구를 통해 유전자 녹아웃을 생성하거나 기증자 DNA 주형이 있는 경우 상동성 지향 복구(HDR)를 통해 유전자 변형을 도입할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 HDR을 위해 piggyBac 트랜스포존 기반 공여 플라스미드(또는 표적화 벡터)를 사용하며, 여기서 약물 내성 마커는 트랜스포존 반전 반복에 의해 측면에 있습니다. 이 접근법의 장점은 Yusa et al.9,10에 의해 처음 입증 된 바와 같이 효율적인 스크리닝과 원활한 유전자 편집을 포함합니다. 약물 선택 카세트를 사용하면 통합 벡터로 세포를 농축 할 수 있으며, 이후 접합 PCR로 스크리닝하여 HDR로 유도 된 세포를 식별합니다. 또한 약물 선택 카세트를 배치하여 Cas9(n) 절단을 위한 표적 서열을 대체할 수 있으므로 HDR 후 더 이상 DNA 파손이 발생하지 않으므로 Cas9(n) 재절단으로 인한 'on' 표적 돌연변이를 제거합니다. 또한, piggyBac 전이 효소에 의해 촉매되는 정확한 절제를 이용함으로써, 선택 마커는 흉터를 남기지 않고 게놈에서 절제됩니다. piggyBac 삽입을 위한 원래의 내인성 TTAA 서열만이 약물 선택 마커9의 제거 후에 남는다. TTAA 사이트가 대체를 도입하여 생성되어야 하는 경우에도 다른 방법(10)에 비해 규제 요소를 방해할 가능성이 줄어듭니다.
여기에서는 hPSC에서 원활한 게놈 편집을 구현하기 위한 자세한 절차를 설명합니다. piggyBac 기반 기증자 플라스미드와 CRISPR-Cas9 닉카제 돌연변이를 2단계 유전자 선택에서 결합하여 간세포 핵인자 4 알파(HNF4α) 유전자11에 두 개의 미리 결정된 점 돌연변이를 도입했습니다. 이 접근법은 신뢰할 수 있고 효율적이며 인간 다 능성 줄기 세포11의 내배엽 및 간세포 사양에서 HNF4α가 수행하는 중요한 역할에 대한 심층 분석을 허용했습니다.

<table><tbody><tr><td>Anti-Human SSEA4 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-8843-42</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human TRA-1-60 PE</td><td>eBioscience</td><td>11-0159-42</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td> 칼슘 및 마그네슘이 함유된 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>FIAU</td><td>Moravek</td><td>M251</td><td></td></tr><tr><td>Gentle cell 해리 시약</td><td>줄기 세포 기술</td><td>07174</td><td></td></tr><tr><td>H9 인간 배아 줄기 세포</td><td>WiCell</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>인간 NANOG 항체</td><td>R& D 시스템</td><td>AF1997</td><td></td></tr><tr><td>인간 OCT4 항체</td><td>Abcam</td><td>AB19857</td><td></td></tr><tr><td>인간 줄기 세포 핵세포 키트 1</td><td>Lonza</td><td>VPH-5012</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG3 이소타입 제어 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4742-41</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 매체</td><td>줄기 세포 기술</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>핵세포 2b 장치</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-hyPBase</td><td>Wellcome Trust Sanger Institute</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pMCS-AAT_PBPGKpuroTK</td><td>Wellcome Trust Sanger Institute</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)</td><td>Addgene</td><td>PX462</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep spin maxiprep kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep 스핀 미니프렙 키트</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>재조합 라미닌 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 솔루션, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632(Dihydrochloride)</td><td>Millipore</td><td>SCM075</td><td></td></tr></tbody></table>

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

RNA 유도 클러스터형 규칙적인 간격 짧은 회문 반복(CRISPR)-Cas9와 같은 맞춤형 설계 엔도뉴클레아제는 포유류 세포에서 효율적인 게놈 편집을 가능하게 합니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포의 예로서 간세포 핵 인자 4 알파(HNF4α) 유전자좌를 원활하게 게놈 편집하는 자세한 절차를 설명합니다. piggyBac 기반 기증자 플라스미드와 CRISPR-Cas9 니카제 돌연변이를 2단계 유전자 선택에서 결합하여 HNF4α 유전자좌의 정확하고 효율적인 표적화를 입증합니다.

타겟팅 벡터 기반 녹인 전략 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자는 엑손 8에 2 개의 점 돌연변이를 도입하기 위해 표적 게놈 편집을 위해 선택되었습니다. 11 bp 오프셋을 갖는 Cas9n-sgRNA 쌍을 변형시킬 부위에 가깝게 설계하였다. piggyBac 기반 표적화 벡터는 원하는 점 돌연변이를 도입하기 위한 상동성 지향 복구 템플릿으로 작동했습니다. 동의어 뉴클레오티드 치환 또는 원하는 점 돌연변이를 통합하는 967 bp 5'-HA 및 1142 bp 3'-HA를 증폭하고 최종 표적화 벡터로 클로닝하였다. piggyBac 삽입 부위는 2개의 원하는 점 돌연변이로부터 16bp 및 22bp 떨어져 있었다. puro-deltaTK 선택 카세트를 함유하는 콜로니를 제1 라운드에서 퓨로마이신과 함께 선택하였다. 선택 카세트가 두 번째 라운드에서 트랜스포아제 절제에 의해 제거되면, 표적 부위는 유전자에 통합된 원하는 점 돌연변이만으로 원활하게 수정되었습니다(그림 1).
인간 만능 줄기 세포의 유전자 편집 올바르게 표적화된 세포를 스크리닝하기 위해 3개의 프라이머 기반 PCR 방법을 유전형 분석에 사용했습니다(그림 2). PCR 결과를 확인하기 위해 Sanger 시퀀싱을 수행하였다(도 3의 A). 선택 카세트를 제거한 후, 변형된 영역을 다시 시퀀싱하여 원하는 점 돌연변이의 올바른 도입을 확인하였다(도 3B).
편집된 인간 만능줄기세포의 콜로니 확립 및 특성 분석 올바른 유전자형을 가진 콜로니를 선택하고 필요에 따라 확장했습니다. 확립 된 식민지는 추가 분석을 위해 사용하기 전에 특성화해야합니다. 편집된 세포는 모 세포와 동일한 형태를 가지고 있습니다(그림 4A). 이들은 또한 전사 인자 NANOG 및 OCT4(도 4B)와 세포 표면 마커 SSEA4 및 TRA-1-60(도 4C)을 포함한 대표적인 인간 만능 줄기세포 마커를 발현한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig1.jpg"> 그림 1: 타겟팅 벡터 기반 녹인 전략11. 한 쌍의 Cas9n-sgRNA 발현 플라스미드를 사용하여 HNF4α 유전자의 엑손 8에서 DNA 이중 가닥 절단을 유도했습니다. 선택 카세트를 갖는 표적화 벡터를 사용하여 16 bp 및 22 bp 떨어진 곳에 위치한 미리 결정된 점 돌연변이를 도입하였다. 이 선택 카세트는 구성 활성 프로모터 (PGK)에 의해 구동되는 양성-음성 선택 마커 (puro-deltaTK)로 구성된 piggyBac 트랜스포존 내에 포함되었습니다. 상동성 지향 복구 경로를 통해, 표적화된 세포는 선택 카세트를 통합하였다. 트랜스포아제에 의해 매개되는 트랜스포존 절제는 점 돌연변이만 존재하는 원활한 변형을 초래합니다. 적십자는 원하는 점 돌연변이의 위치를 나타냅니다. HA = 상동성 암; PB = 피기박; PM = 점 돌연변이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig2.jpg"> 그림 2: 3가지 프라이머 기반 PCR 방법. 유전자 표적 세포를 스크리닝하기 위해, PCR 기반 유전형 분석이 사용되었다. 3개의 프라이머, LA-F1, -R1 및 -R2를 사용하여 좌측 상동성 암 영역을 증폭시켰다. 독립적으로, RA-F1, -F2 및 -R1을 오른쪽 상동성 암 영역을 증폭하기 위해 사용하였다. 겔 전기영동 결과에 기초하여, 비표적 세포, 및 이형접합체 및 동형접합체 세포는 서로 구별되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig3.jpg"> 그림 3: 유전자 변형 세포의 시퀀싱 결과11. 2개의 클론으로부터의 PCR 산물을 시퀀싱하고, 표적 유전자좌 (A)에서 선택 카세트의 정확한 삽입을 확인하였다. 5' 및 3' 피기박 반전 말단 반복(ITR)은 TTAA 직접 반복에 의해 측면화되었다. 3개의 클론을 트랜스포존 절제 후 시퀀싱하였다(B). 11 bp 오프셋을 갖는 Cas9n-sgRNA 쌍을 사용하여 DNA 이중 가닥 절단을 도입하였다. 2개의 소정의 점 돌연변이(A 내지 G 및 A 내지 C)를 유전자 내로 도입하였다. 하나의 동의어 돌연변이는 프로토 스페이서 인접 모티프 (PAM)를 돌연변이시키기 위해 도입되었고, 다른 하나는 piggyBac 절제에 필요한 TTAA 부위를 생성하기 위해 도입되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig4.jpg"> 그림 4 : 편집 된 인간 다 능성 줄기 세포의 특성. 2개의 편집된 세포주와 모 세포의 형태(A), 스케일 바 = 100 μm. 만능줄기세포 마커인 NANOG 및 OCT4의 발현을 2개의 변형된 세포주와 모 세포에서 유세포분석(C)에 의해 SSEA4 및 TRA-1-60 이외에 면역염색법(B, scale bar = 50 μm)으로 조사하였다. IgG는 음성 대조군으로 사용하였다. DAPI는 핵을 염색하는 데 사용되었습니다. 백분율은 3개의 독립적인 실험의 평균으로 계산되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

인간 만능 줄기세포에서 유전자를 편집하는 것은 어려운 일입니다. 이 프로토콜은 표적화 벡터와 결합된 쌍의 Cas-90 케이스를 사용하여 이러한 세포에서 게놈 편집을 위한 세부 절차를 제공합니다. 신뢰할 수 있고 따라하기 쉽습니다.이 프로토콜의 주요 장점은 원활한 게놈 편집이라는 것입니다. 2단계 선택은 표적 세포를 증가시키는 데 도움이 되며 유전형 분석 스크리닝을 보다 효율적으로 만들었습니다. mTeSR1 배지의 재조합 라미닌 21 코드 표면에서 인간 만능 줄기 세포를 유지합니다.세포는 70에서 85% 농도, 1에서 3 분할 비율 후에 72 시간에 도달해야 합니다. transfection 당일에는 24웰 플레이트의 웰에 300마이크로리터의 laminin 521 용액을 충분히 코팅하고 플레이트를 섭씨 37도에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 코팅 용액을 부드럽게 제거하고 즉시 300마이크로리터의 새로운 mTeSR1 배지를 첨가하고 각 웰에 10마이크로몰 ROCK 억제제를 보충합니다.그런 다음 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 인큐베이터에서 재고가 있는 인간 만능 줄기 세포를 꺼냅니다. 사용한 배지를 제거하고 1ml의 멸균 DPBS로 세포를 한 번 세척합니다.그런 다음 각 웰에 1ml의 부드러운 세포 해리 시약을 추가하고 섭씨 37도에서 6-8분 동안 배양하여 세포를 해리합니다. 플레이트를 부드럽게 두드려 세포가 쉽게 분리될 수 있도록 합니다. 그런 다음 P1000 팁을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 세포를 들어 올립니다.ROCK 억제제가 있는 mTeSR1 배지 2ml를 첨가하여 해리를 종결합니다. 서스펜션을 잘 섞어 50ml 튜브로 옮깁니다. 200G에서 3분 동안 세포를 원심분리합니다.그런 다음 상층액을 제거하고 ROCK 억제제로 2ml의 mTeSR1 배지에 세포를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세고 트리판 블루를 사용합니다. 각 nucleofection 반응을 위해 800, 000에서 100만개의 세포를 1.5 밀리리터 관으로 옮기고 3 분 동안 200 G에 그(것)들을 원심분리한다.그런 다음 상층액을 조심스럽게 흡입하십시오. 인간 줄기 세포 핵 제거 키트의 혼합 핵 추출 용액 100 마이크로리터에 쌍을 이루는 Cas-9n 단일 가이드 RNA 발현 플라스미드 3마이크로그램과 표적 벡터 플라스미드 5마이크로그램을 혼합합니다. GFP 대조군 플라스미드 혼합물도 준비합니다.DNA 혼합물로 세포를 재현탁시키고 전기천공법 큐벳으로 옮겨 기포를 피하십시오. 인간 만능 줄기 세포에 최적화된 조건을 사용하여 nucleofection 장치로 세포를 전기천공합니다. 즉시 10마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 신선하고 따뜻한 mTeSR1 배지 500마이크로리터를 전기천공된 세포에 추가합니다.그런 다음 혼합물을 이전에 준비된 24웰 플레이트의 두 웰로 옮깁니다. 세포가 회복할 수 있도록 섭씨 37%의 이산화탄소가 공급되는 5°C 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다. 12-16시간 후에 세포 유지 배지를 교체하고 세포가 세포 간 접촉을 확립하면 ROCK 억제제를 회수합니다.24-48시간 후, 대조 세포의 GFP 발현을 검사하여 핵 절제 효율을 확인합니다. 핵 절제 후 48시간 후에 mTeSR1 배지에 밀리리터당 1마이크로그램의 푸로마이신을 보충하여 세포 선택을 시작합니다. 72시간 후 배지에 밀리리터당 0.5마이크로그램의 푸로마이신을 보충합니다.세포 밀도가 30% 미만인 경우 배지에 10마이크로몰 ROCK 억제제를 보충합니다. 뉴클레오펙션 계대 후 4-6일 후에 퓨로마이신 내성 세포를 웰당 0.8 세포의 농도로 10-15,96 웰 플레이트에 노출시킵니다. 배지에 ROCK 억제제와 퓨로마이신을 보충해야 합니다.세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 10%로 10-12일 동안 유지하여 단세포 유래 군체를 형성합니다. 파종 후 7일 후에 배지를 보충합니다. 단일 콜로니를 포함하는 웰을 표시하고 배지를 밀리리터당 0.5마이크로그램의 퓨로마이신을 함유하지만 ROCK 억제제는 포함하지 않는 새로운 mTeSR1 배지로 교체합니다.섭씨 37도에서 이틀 더 세포를 성장시키고 이산화탄소를 5%로 만듭니다. 그런 다음 미분화 군체를 포함하는 우물의 매체를 변경합니다. 콜로니를 부드럽게 긁어내고 한 콜로니의 세포 현탁액을 별도의 96웰 플레이트에 있는 두 개의 새로운 웰로 옮깁니다.하나는 유전형 분석용이고 다른 하나는 유지 관리용입니다. 유전형 분석 세포의 밀도가 50% 이상에 도달하면 사용한 배지를 버리고 DPBS로 세포를 한 번 세척합니다. Bradley Lysis Buffer로 세포를 용해하고 각 웰에서 게놈 DNA를 분리합니다.3개의 프라이머 접합 PCR을 수행하고 산물을 염기서열분석한 후 올바른 유전자형을 가진 콜로니를 유지하고 나머지는 폐기합니다.지속적인 퓨로마이신 선택에서 올바른 콜로니를 확장하고 가능한 한 빠른 통과 시 동결합니다. 이 프로토콜은 간세포 핵 인자 4 알파 유전자의 Exon8에 2점 돌연변이를 도입하는 데 사용되었습니다.올바르게 표적화된 세포를 스크리닝하기 위해 3개의 프라이머 기반 PCR 방법을 사용했으며, PCR 결과를 확인하기 위해 Sanger 염기서열분석을 수행했습니다. 선택 카세트를 제거한 후, 원하는 점 돌연변이의 올바른 도입을 확인하기 위해 변형된 영역을 다시 염기서열분석했습니다. 올바른 유전자형을 가진 콜로니를 선택하고 추가 분석 전에 세포를 특성화했습니다.편집된 세포는 부모 세포와 동일한 형태를 가지고 있으며 전사 인자 Nanog 및 Oct4, 세포 표면 마커 SSEA-4 및 TRA-160을 포함한 대표적인 인간 만능 줄기 세포 마커를 발현합니다. 이 절차를 시도할 때 처음 24시간 동안 퓨로마이신 선택 후 세포 밀도를 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 중앙값을 ROCK 억제제로 보충하는 것이 필수적입니다.세포 밀도가 30% 미만인 경우 세포를 계속 유지합니다. 게놈 편집 만능 줄기 세포주가 확립되면 유전자 기능 또는 유도 분화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 연구자들이 유전자의 특정 기능 또는 유전 질환에 대한 표적 유전자 보정과 같은 다양한 질문을 연구할 수 있는 길을 열어줍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

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