원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

인간 만능 줄기세포에서 유전자를 편집하는 것은 어려운 일입니다. 이 프로토콜은 표적화 벡터와 결합된 쌍의 Cas-90 케이스를 사용하여 이러한 세포에서 게놈 편집을 위한 세부 절차를 제공합니다. 신뢰할 수 있고 따라하기 쉽습니다.

이 프로토콜의 주요 장점은 원활한 게놈 편집이라는 것입니다. 2단계 선택은 표적 세포를 증가시키는 데 도움이 되며 유전형 분석 스크리닝을 보다 효율적으로 만들었습니다. mTeSR1 배지의 재조합 라미닌 21 코드 표면에서 인간 만능 줄기 세포를 유지합니다.

세포는 70에서 85% 농도, 1에서 3 분할 비율 후에 72 시간에 도달해야 합니다. transfection 당일에는 24웰 플레이트의 웰에 300마이크로리터의 laminin 521 용액을 충분히 코팅하고 플레이트를 섭씨 37도에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 코팅 용액을 부드럽게 제거하고 즉시 300마이크로리터의 새로운 mTeSR1 배지를 첨가하고 각 웰에 10마이크로몰 ROCK 억제제를 보충합니다.

그런 다음 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 인큐베이터에서 재고가 있는 인간 만능 줄기 세포를 꺼냅니다. 사용한 배지를 제거하고 1ml의 멸균 DPBS로 세포를 한 번 세척합니다.

그런 다음 각 웰에 1ml의 부드러운 세포 해리 시약을 추가하고 섭씨 37도에서 6-8분 동안 배양하여 세포를 해리합니다. 플레이트를 부드럽게 두드려 세포가 쉽게 분리될 수 있도록 합니다. 그런 다음 P1000 팁을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 세포를 들어 올립니다.

ROCK 억제제가 있는 mTeSR1 배지 2ml를 첨가하여 해리를 종결합니다. 서스펜션을 잘 섞어 50ml 튜브로 옮깁니다. 200G에서 3분 동안 세포를 원심분리합니다.

그런 다음 상층액을 제거하고 ROCK 억제제로 2ml의 mTeSR1 배지에 세포를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세고 트리판 블루를 사용합니다. 각 nucleofection 반응을 위해 800, 000에서 100만개의 세포를 1.5 밀리리터 관으로 옮기고 3 분 동안 200 G에 그(것)들을 원심분리한다.

그런 다음 상층액을 조심스럽게 흡입하십시오. 인간 줄기 세포 핵 제거 키트의 혼합 핵 추출 용액 100 마이크로리터에 쌍을 이루는 Cas-9n 단일 가이드 RNA 발현 플라스미드 3마이크로그램과 표적 벡터 플라스미드 5마이크로그램을 혼합합니다. GFP 대조군 플라스미드 혼합물도 준비합니다.

DNA 혼합물로 세포를 재현탁시키고 전기천공법 큐벳으로 옮겨 기포를 피하십시오. 인간 만능 줄기 세포에 최적화된 조건을 사용하여 nucleofection 장치로 세포를 전기천공합니다. 즉시 10마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 신선하고 따뜻한 mTeSR1 배지 500마이크로리터를 전기천공된 세포에 추가합니다.

그런 다음 혼합물을 이전에 준비된 24웰 플레이트의 두 웰로 옮깁니다. 세포가 회복할 수 있도록 섭씨 37%의 이산화탄소가 공급되는 5°C 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다. 12-16시간 후에 세포 유지 배지를 교체하고 세포가 세포 간 접촉을 확립하면 ROCK 억제제를 회수합니다.

24-48시간 후, 대조 세포의 GFP 발현을 검사하여 핵 절제 효율을 확인합니다. 핵 절제 후 48시간 후에 mTeSR1 배지에 밀리리터당 1마이크로그램의 푸로마이신을 보충하여 세포 선택을 시작합니다. 72시간 후 배지에 밀리리터당 0.5마이크로그램의 푸로마이신을 보충합니다.

세포 밀도가 30% 미만인 경우 배지에 10마이크로몰 ROCK 억제제를 보충합니다. 뉴클레오펙션 계대 후 4-6일 후에 퓨로마이신 내성 세포를 웰당 0.8 세포의 농도로 10-15,96 웰 플레이트에 노출시킵니다. 배지에 ROCK 억제제와 퓨로마이신을 보충해야 합니다.

세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 10%로 10-12일 동안 유지하여 단세포 유래 군체를 형성합니다. 파종 후 7일 후에 배지를 보충합니다. 단일 콜로니를 포함하는 웰을 표시하고 배지를 밀리리터당 0.5마이크로그램의 퓨로마이신을 함유하지만 ROCK 억제제는 포함하지 않는 새로운 mTeSR1 배지로 교체합니다.

섭씨 37도에서 이틀 더 세포를 성장시키고 이산화탄소를 5%로 만듭니다. 그런 다음 미분화 군체를 포함하는 우물의 매체를 변경합니다. 콜로니를 부드럽게 긁어내고 한 콜로니의 세포 현탁액을 별도의 96웰 플레이트에 있는 두 개의 새로운 웰로 옮깁니다.

하나는 유전형 분석용이고 다른 하나는 유지 관리용입니다. 유전형 분석 세포의 밀도가 50% 이상에 도달하면 사용한 배지를 버리고 DPBS로 세포를 한 번 세척합니다. Bradley Lysis Buffer로 세포를 용해하고 각 웰에서 게놈 DNA를 분리합니다.

3개의 프라이머 접합 PCR을 수행하고 산물을 염기서열분석한 후 올바른 유전자형을 가진 콜로니를 유지하고 나머지는 폐기합니다.지속적인 퓨로마이신 선택에서 올바른 콜로니를 확장하고 가능한 한 빠른 통과 시 동결합니다. 이 프로토콜은 간세포 핵 인자 4 알파 유전자의 Exon8에 2점 돌연변이를 도입하는 데 사용되었습니다.

올바르게 표적화된 세포를 스크리닝하기 위해 3개의 프라이머 기반 PCR 방법을 사용했으며, PCR 결과를 확인하기 위해 Sanger 염기서열분석을 수행했습니다. 선택 카세트를 제거한 후, 원하는 점 돌연변이의 올바른 도입을 확인하기 위해 변형된 영역을 다시 염기서열분석했습니다. 올바른 유전자형을 가진 콜로니를 선택하고 추가 분석 전에 세포를 특성화했습니다.

편집된 세포는 부모 세포와 동일한 형태를 가지고 있으며 전사 인자 Nanog 및 Oct4, 세포 표면 마커 SSEA-4 및 TRA-160을 포함한 대표적인 인간 만능 줄기 세포 마커를 발현합니다. 이 절차를 시도할 때 처음 24시간 동안 퓨로마이신 선택 후 세포 밀도를 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 중앙값을 ROCK 억제제로 보충하는 것이 필수적입니다.

세포 밀도가 30% 미만인 경우 세포를 계속 유지합니다. 게놈 편집 만능 줄기 세포주가 확립되면 유전자 기능 또는 유도 분화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 연구자들이 유전자의 특정 기능 또는 유전 질환에 대한 표적 유전자 보정과 같은 다양한 질문을 연구할 수 있는 길을 열어줍니다.