유세포 분석을 사용한 박테리아 표면에 대한 Vitronectin 결합 검출

헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae, type f)의 야생형 및 돌연변이 균주가 들어 있는 유세포 분석기 튜브를 가져 가십시오.

차단 단백질과 비트로넥틴이 포함된 완충액을 피펫팅합니다. 인큐베이트.

차단 단백질은 박테리아 표면의 비특이적 상호 작용을 감소시키는 반면, 비트로넥틴 분자는 야생형 박테리아 표면의 비트로넥틴 결합 단백질인 단백질 H에 결합합니다. 돌연변이 균주에서 비트로넥틴은 단백질 H가 없기 때문에 결합하지 않습니다.

원심 분리기. 결합되지 않은 비트로넥틴과 차단 단백질을 제거합니다.

야생형 박테리아 표면에 부착된 비트로넥틴에 특이적으로 결합하는 1차 항비트로넥틴 항체를 포함하는 완충액을 추가합니다.

다음으로, 비트로넥틴의 1차 항체에 결합하여 비트로넥틴 검출을 용이하게 하는 형광단 접합 2차 항체를 도입합니다.

원심 분리기. 결합되지 않은 2차 항체를 제거합니다. 완충액에 박테리아를 재현탁합니다.

유세포 분석을 수행하여 박테리아 표면에 대한 비트로넥틴 결합을 결정합니다.

야생형 및 돌연변이 균주의 형광 신호를 비교합니다. 야생형 박테리아에서 형광 신호의 이동은 박테리아 표면에 대한 비트로넥틴 결합을 확인합니다.

유세포 분석을 준비하려면 250나노몰 비트로넥틴을 함유한 50마이크로리터의 차단 완충액으로 박테리아 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 흔들지 않고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 박테리아를 3,500 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 그런 다음 PBS 및 유사한 원심분리 단계를 사용하여 펠릿을 세 번 세척합니다.

세척 후, 50마이크로리터의 1차 양 항-인간 비트로넥틴 다클론 항체를 박테리아 펠릿에 PBS/BSA에서 1 내지 100 희석으로 첨가합니다. 현탁액을 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 박테리아를 PBS로 세 번 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.

다음으로, 플루오레세인 이소티오시아네이트 접합 당나귀 항양 다클론 항체를 함유한 PBS/BSA 50마이크로리터를 펠릿에 첨가합니다. 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 3단계의 세척 후 박테리아 펠릿을 300마이크로리터의 PBS로 재현탁하고 유세포 분석법으로 분석합니다.