면역조절 화합물 스크리닝을 위해 엔지니어링된 림프구를 사용한 형광 기반 분석

형질전환 마우스 유래 T 림프구의 현탁액을 포함하는 형광 호환 멀티웰 플레이트로 시작합니다.

이러한 림프구는 T 세포 수용체 또는 면역 조절 화합물과의 TCR 결합에 의해 제어되는 녹색 형광 단백질 또는 GFP 발현 카세트를 포함합니다.

전위가 다른 면역 조절 화합물을 포함하는 용액으로 각 웰을 처리하십시오.

배양하는 동안 면역 조절 화합물은 T 림프구의 TCR과 상호 작용합니다.

자극 화합물과의 TCR 상호 작용은 유전자 카세트의 활성화를 유발하여 GFP 발현을 증가시킵니다.

대조적으로, 억제 화합물과의 TCR 상호작용은 유전자 카세트를 억제하고 GFP 발현을 감소시킵니다.

다음으로 세포에 핵산 형광 염료를 겹쳐 핵을 염색합니다.

정확한 형광 측정을 위해 플레이트를 원심분리하여 세포를 침전시킵니다.

형광 현미경에서 생존 가능한 T 림프구는 세포핵과 녹색 형광 단백질에 해당하는 두 개의 형광 신호를 나타냅니다.

강화된 녹색 형광은 T 림프구의 성공적인 자극을 의미하며, 희미한 세포내 녹색 형광 신호는 T 림프구에 대한 면역 조절 화합물의 억제 효과를 확인합니다.

소분자 고처리량 스크리닝의 경우, 384웰 플레이트에 웰당 40마이크로리터의 세포를 플레이트하고, 세포 배양 인큐베이터에서 원하는 처리 기간 동안 선택한 약물 또는 비히클로 적절한 웰을 처리합니다.

GFP 분석 30분 전에 적절한 농도의 Hoechst 용액으로 세포를 염색하고 부드러운 피펫팅으로 염색을 완전히 분산시킵니다. 모든 웰이 염색되면 플레이트를 원심분리하여 웰 바닥에 세포를 수집하고 세포를 실온에서 15분 동안 휴지시킵니다.

제조업체의 지침에 따라 플레이트를 로드하십시오. 그런 다음 대물렌즈를 40X 이상으로 설정합니다. UV 램프에 카메라 번호 4를 설정한 다음 레이저 1에 카메라 번호 488를 설정합니다. 플레이트를 고함량 스크리닝 시스템에 로드합니다. 다음으로, 자동화된 공초점 고함량 스크리닝 시스템을 웰당 6-10개의 필드를 읽도록 설정하고, 488나노미터 및 UV 광선에서 필드당 2개의 순차적 판독