인간 거대세포바이러스의 중화를 측정하기 위한 면역형광 방법

인간 거대세포바이러스 또는 HCMV에 특이적인 항체를 연속적으로 희석하십시오.

HCMV를 추가하면 항체는 바이러스 외피의 당단백질 B에 결합하여 바이러스를 중화합니다.

혼합물을 인간 섬유아세포에 옮기고 배양합니다.

중화되지 않은 바이러스의 삼량체 당단백질 복합체는 특정 세포 수용체에 결합하여 당단백질 B 매개 바이러스-숙주막 융합을 유발하고 내부의 게놈 DNA 함유 뉴클레오캡시드를 방출합니다.

방출된 게놈은 핵에 들어가 핵에 국한된 즉 초기 또는 IE 단백질을 암호화합니다.

항체 중화는 바이러스가 세포로 들어가는 것을 방지합니다.

내재화되지 않은 바이러스를 제거합니다. 영하의 온도에서 에탄올로 처리하여 세포를 고정하고 투과시킵니다.

IE 단백질에 결합하는 1차 항체를 도입합니다.

1차 항체에 결합하는 형광단 접합 2차 항체와 DNA에 결합하는 형광 염색을 추가합니다.

현미경으로 바이러스에 감염된 이중 염색 세포를 검출합니다. 감염된 세포의 백분율을 계산하여 다양한 항체 농도에서 바이러스 중화를 결정합니다.

실험 전날, 멸균 96웰 플레이트에서 10% FBS가 보충된 DMEM으로 구성된 완전 배지에서 성장한 섬유아세포 세포를 배양하여 감염을 위한 표적 세포를 준비합니다.

24시간 후, 희석된 항체 용액 90마이크로리터를 신선한 96웰 플레이트의 웰에 첨가하여 바이러스-항체 혼합물을 준비합니다. 완전한 배지를 사용하여 항체 용액의 연속 희석액을 준비합니다.

또한, 완전한 배지에서 미리 희석된 60마이크로리터의 바이러스 용액을 각 항체 함유 웰에 첨가하여 다양한 농도의 바이러스-항체 혼합물을 생성하고 배양합니다.

이제 표적 세포를 감염시키려면 섬유아세포가 파종된 플레이트를 가져 가십시오. 100마이크로리터의 서로 다른 농도의 바이러스-항체 혼합물을 세포에 첨가하고 표적 플레이트를 24시간 동안 배양합니다.

24시간 후 면역형광을 이용하여 바이러스 감염을 검출하기 위해 세포를 무수 에탄올로 고정하고 섭씨 -20도 냉동고에서 배양합니다. 고정 후 실험실 벤치에서 후속 단계를 진행하십시오.

플레이트의 모든 웰에 1차 항체 100μl를 피펫팅합니다. 접시를 실온에 한 시간 동안 두십시오.

웰에서 1차 항체 용액을 제거합니다. 형광단 접합 2차 항체와 DAPI 용액의 혼합물을 모든 웰에 추가합니다. 어둠 속에서 한 시간 동안 플레이트를 배양하고 플레이트를 세척합니다.

감염을 정량화하려면 현미경으로 플레이트를 시각화하고 파란색 및 빨간색 채널을 사용하여 이미지를 획득합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 우물당 감염 비율을 계산합니다.