Name: 혈액과 문화 매체에서 파생 Exosomes의 정화 및 마이크로 RNA 프로파일 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 학습하세요 혈액과 문화 매체에서 exosome을 차등 원심분리법으로 정제하고 microRNA를 분리 분석하는 방법을. 이 기술은 세포 간 소통 연구와 질병 바이오마커 발굴에 활용됩니다.

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이 연구는 리타 알렌 재단 보조금에서 Seena 아지트에 기금에 의해 지원되었다. 저자는 장비 사용, 과학 및 기술 지원을위한 사우스 캐롤라이나 전자 현미경 센터의 대학에서 에리카 Balogh 다음과 박사 Soumitra Ghoshroy을 인정하고 싶습니다.

인간과 설치류의 혈액 샘플을 사용하여 모든 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행되었다. 사람을 대상으로이 약 기관 검토위원회의 드렉 셀 대학과 동물을 사용하여 수행 연구에 대한 모든 절차 드렉의 기관 동물 관리에 의해 승인 및위원회를 사용했다가 승인 한 동의서를 제공 한 후 등록되었습니다. 1. 혈액에서 Exosome 정화 (~ 5.5 시간) 팁 <ul><li class="jove_content"> 우리는 mirVana의 miRNA의 절연 키트에서 300 μL RNA 용해 버퍼의 혈액 튜브 1 (~ 10 ㎖ 인간의 혈액과 1 ~ 2 ML 마우스 혈액)에서 exosomes를 resuspend을. </li><li class="jove_content"> 세포 배양 매체에서 exosomes을 정화, 미디어 세포를 제거하기 위해 10 분 500 XG에 스핀도 12,000 X g에서 원심 분리 한 후 필터 0.22 μm의를 통해 필터링됩니다. 세포 배양 매체에서 exosome 정화PBS, PBS 세척 또는 제 원심 단계에서 희석이 필요하지 않습니다. </li><li class="jove_content"> 정제 exosomes는 원심 단계 이후 자당 기울기 원심 분리 단계를 추가, 프로테오믹스 연구에 사용되는 경우 단백질 집계 및 오염 물질 (15)의 양을 감소합니다. </li><li class="jove_content"> exosomes의 관찰 형태는 소스와 TEM에 대한 처리 단계 모두에 따라 다를 수 있습니다. 우리는 이전에 샘플 처리 9,15의 차이에 기인 한 exosomes의 컵 모양의 형태를 관찰하지 않았다. immunogold 라벨 등 우리의 TEM 이미지 exosomes 9,16,17 파생 된 담즙과 대뇌 피질의 문화 혈액 등 서로 다른 소스에서 이전의보고와 비슷합니다. </li></ul><ol><li> 10-60 분 동안 실온에서 수직 배와 장소 혈액을 포함 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 코팅 튜브를 반전. </li><li> 4 ℃에서 15 분 2,000 XG에 원심 분리기 </리&gt; <li> 15 ML 튜브에 꼭대기 층, 플라즈마를 수집하고 얼음에 보관하십시오. </li><li> PBS의 동일한 볼륨 액을 희석. 4에서 2,000 XG에서 30 분 원심 분리기 ° C. </li><li> 4 ° C.에서 튜브를 원심 분리기 24 ML의 총 볼륨 1X PBS를 추가하고, 12,000 XG에서 45 분 원심 분리로 전송 </li><li> 4 ° C.에 튜브를 원심 분리기와 110,000 XG에서 2 시간을 원심 분리로 전송 </li><li> 을 Resuspend PBS의 펠렛과 4 ℃에서 100,000 XG에서 1 시간 원심 분리 </li><li> 적절한 버퍼를 Resuspend 펠렛 (RNA 용해 버퍼). </li><li> 전자 현미경과 서양 얼룩 분석 각각에 대한 PBS 또는 RIPA 버퍼에 resuspend을. </li></ol> 2. 수정 mirVana의 miRNA의 절연 키트 (~ 1 시간)를 사용하여 RNA 정화 팁 <ul><li class="jove_content"> 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하여 RNA를 분리 RNase의 기력과 표면과 피펫을 닦아, 그리고 살균 필터 팁과 튜브를 사용하기위한 영역을 준비합니다. </li><li클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 공급 업체의 프로토콜은 miRNA의 정화의 옵션을 제공하지만, 우리는 항상 우리가 모두 동일한 시료에서 공부할 수 있도록 mRNA를 포함하여 총 RNA를 분리하고 miRNA의. </li><li class="jove_content"> 에 열 DNase의 처리 단계를 추가하는 것은있을 수있는 DNA의 흔적을 제거합니다. exosomes의 소스에 따라 DNA는 마우스와 인간 비만 세포 라인 8 만 염색체 DNA 서열은 배양 심근 18 미디어에서 정제 exosomes에서 발견 된 등 일부 소스에서 정제 exosomes에없는 것으로보고되었다. </li><li class="jove_content"> 공급 업체는 충분 하나의 700 μl를 추가하기 위해 솔루션 1을 씻으 제공하기 때문에 우리는 세척 용액 1-350 μL (아래 단계 2.4)의 양을 감소. 볼륨이 감소되지 않으면 전체 키트 내용물을 사용하기 위해 남겨 충분한 해결책은 없습니다. 나머지 단계는 제조업체의 권장 사항에 따라 수행 하였다. </li></ul><ol><li> 1 / 10 VO 추가10 분 동안 얼음에 miRNA의 균질 첨가제 (30 μL)와 부화의 LUME. </li><li> 산성 페놀의 볼륨 추출 초기 해물 양에 해당 클로로포름. 원심과 신선한 튜브 상단 위상을 복구 할 수 있습니다. </li><li> 1.25 볼륨을 100 % 에탄올 (375 μL)를 추가합니다. 소용돌이. 카트리지를 필터링하고 10,000 X g에서 15 초 원심 분리에 적용됩니다. </li><li> 권장 볼륨 miRNA의 세척 방법 1 (350 μL)의 절반을 추가하고 10,000 X g에서 15 초 원심 분리기. </li><li> 각 샘플에 대해 10 μL DNase의 1-70 μL 버퍼 RDD (Qiagen의)를 추가합니다. 열을 80 μl를 추가하고 실온에서 15 분 알을 품다. </li><li> 해결 방법 1을 세척 (350 μL) 10,000 X g에서 15 초 원심 분리기 추가합니다. </li><li> 솔루션을 씻으 추가 2 / 3 (500 μL) 10,000 X g에서 15 초 원심 분리기. 반복합니다. </li><li> 40 ㎕의 95 용출 ° C nuclease가없는 H 2 O </li><li> RNA의 농도를 결정하고 100 NG / μL로 RNA를 희석. </li></ol> 3. Bloo에서 Exosomes의 miRNA의 프로파일D는 TAQMAN 저밀도 어레이 (TLDA) 카드 (~ 6.5 시간) 사용 팁 <ul><li class="jove_content"> , PPE를 착용하여 RNA를 분리 RNase의 기력과 표면과 피펫을 닦아, 그리고 살균 필터 팁과 튜브를 사용하기위한 영역을 준비합니다. </li><li class="jove_content"> 프리 앰프 (프리 앰프) 단계는 1-350 NG RNA (350-1,000 NG 샘플의 cDNA 합성 후 프리 앰프 단계가 필요하지 않음)을 권장합니다. 그것은 당신이 동등한 조건 하에서 모든 샘플을 처리해야하기 때문에 프리 앰프는 샘플 필요 여부를 결정하는 것이 중요합니다. 프리 앰프 단계에서 비용을 추가하고의 CT 값은 낮은 허용 컷 오프 (32 대신 40)가있다. </li><li class="jove_content"> 그것은 하루에 실행할 수있는 카드의 수에 따라 접시 대신 스트립 튜브의 cDNA 반응을 준비하는 데 유용합니다. 이 같은 날에 처리되지 않습니다 cDNA를 샘플의 동결 - 해동을 최소화 할 수 있습니다. </li><li class="jove_content"> 서로 다른 소스에서 수집 Exosomes는 diffe가RNA의 양을 임대. 이 프로토콜은 cDNA를 합성 반응에 대한 3 μL RNA 템플릿의 최대 수 있습니다. 소스에 따라 분리 될 수 exosomal RNA의 양이 아마 제한됩니다. 일반적으로 조직의 cDNA은 3 μL 볼륨 100 겨 RNA, 인간의 혈액이나 인간의 세포 배양 매체에서 exosomes 만든 것이라고 충분히 RNA를 얻을 것이지만 종종 작은 RNA를 포함하고 cDNA를이 적은 원료로 만든되어야합니다. 마우스의 혈액 exosomes는 RNA의 높은 수준을 포함​​, 3 μL에서 적어도 100 NG를 얻을 수 있습니다. </li></ul><ol><li> Megaplex 풀을 사용하여 RNA를 정제에서 cDNA를 준비하는 것은 효소의 프라이머 (풀과 풀 B 미세 카드에 miRNA에 대한 프라이머를 포함하는 배열 A와 B) 반대로 얼음에 반응 구성 요소를 녹여. </li><li> 라벨 RT 풀 프라이머 또는 풀 B 프라이머와 반응 차트 순서로 구성 요소를 추가 두 RNase가없는 1.5 ML 튜브. 2 개 이상의 반응에 대한 구성 요소 중 하나 이상 추가 볼륨을 추가 또는 t가 추천하는 마스터 믹스를 만들그는 공급 업체. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> RT 반응 구성 요소 </td><td> 성분 농도 </td><td> 1 샘플 볼륨 (총 V / 샘플 = 4.5 μL) </td></tr><tr><td> 핵산이없는 물 </td><td></td><td> 0.20 μL </td></tr><tr><td> Megaplex RT 버퍼 (10X) </td><td> 1X </td><td> 0.80 μL </td></tr><tr><td> dNTPs (100 밀리미터) </td><td> 4.4 mM의 </td><td> 0.20 μL </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 MM) </td><td> 5 밀리미터 </td><td> 0.90 μL </td></tr><tr><td> RNA 분해 효소 억제제 (20U/μl) </td><td> 2 U </td><td> 0.10 μL </td></tr><tr><td> Megaplex RT 프라이머 또는 B (10X) </td><td> 1X </td><td> 0.80 μL </td></tr><tr><td> 역전사 효소를 MultiScribe </td><td> 75 U </td><td> 1.50 μL </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 튜브 반전 6 배 센트간단히 rifuge. 그런 다음, 피펫 4.5 마이크로 암페어에 μL RT 반응 혼합 8 튜브 스트립 또는 96 - 웰 마이크로 암페어 광 반응 플레이트. </li><li> RNA 100 NG를 추가하고 DEPC 처리 된 물 3 μL 볼륨을 조절하거나 3 μL 총 RNA를 추가, 피펫 팁 저어, 그리고 튜브 또는 플레이트를 밀봉하십시오. 간단히 스핀, 5 분 동안 얼음에 품어. </li><li> PCR 기계에 반응을로드하고 (같은 적용되는 생물계 Megaplex 풀 프로토콜에 의해 권장) 다음과 같은 조건 하에서 실행 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 단계 </td><td> 온도 </td><td> 시간 </td></tr><tr><td> 사이클 (40X) </td><td> 16 ° C </td><td> 2 분 </td></tr><tr><td></td><td> 42 ° C </td><td> 1 분 </td></tr><tr><td></td><td> 50 ° C </td><td> 1 초 </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 85 ° C </td><td> 5 분 </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> -20 ° C (1 주일 이상 좋은)에서 cDNA를 저장하거나 일주일 동안 저장할 수있는 프리 앰프 단계를 계속합니다. </li><li> 얼음에 풀 및 풀 B를위한 전치 증폭기 프라이머를 해동 및 혼합하는 반전. 소용돌이 TAQMAN 프리 앰프 마스터 믹스도 얼음에 보관하십시오. </li><li> 2 개 이상의 반응에 대한 구성 요소 중 하나 이상 추가 볼륨을 추가 차트를 수행 또는 공급 업체가 추천하는 마스터 믹스를 확인하십시오. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 프리 앰프 반응 구성 요소 </td><td> 1 샘플 볼륨 </td></tr><tr><td> 핵산이없는 물 </td><td> 7.5 μL </td></tr><tr><td> TAQMAN 전치 증폭기 마스터 믹스 (2X) </td><td> 12.5 μL </td></tr><tr><td> Megaplex 전치 증폭기 프라이머 또는 B (10X) </td><td> 2.5 μL </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> 피펫 2.5 μL RT produ의CT 마이크로 암페어에 8 튜브 스트립 또는 96 - 웰 마이크로 암페어 광 반응 플레이트와 각 우물에 22.5 μL 전치 증폭기 반응 믹스를 분배. </li><li> 얼음 5 분에 배양 플레이트를 밀봉 한 후 PCR 기계로 샘플을로드합니다. 다음과 같은 조건에서 실행됩니다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 단계 </td><td> 온도 </td><td> 시간 </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 95 ° C </td><td> 10 분 </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 55 ° C </td><td> 2 분 </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 72 ° C </td><td> 2 분 </td></tr><tr><td> 사이클 (12 배) </td><td> 95 ° C </td><td> 15 초 </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> 4 분 </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 99.9 ° C </td><td> 10 분 </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="11"><li> 프리 앰프 반응이 완료된 후, 간단히 튜브 또는 플레이트를 원심 분리 한 후 각각의 well 또는 튜브에 75 μL 0.1X TE 산도 8.0을 추가합니다. </li><li> 밀봉 혼합하고 짧게 스핀. -20 ° C에서 일주일 동안 희석 된 제품을 저장하거나 접시를로드 할에 계속합니다. </li><li> 얼음 RNase가없는 1.5 ML 튜브에 다음을 결합합니다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 1 카드의 볼륨 </td></tr><tr><td> TAQMAN 범용 PCR 마스터 믹스, 아니 AmpErase UNG (2X) </td><td> 450 μL </td></tr><tr><td> 희석 프리 앰프 제품 </td><td> 9 μL </td></tr><tr><td> 핵산이없는 물 </td><td> 441 μL </td></tr></tbody></table><ol start="14"><li> 혼합하고 간단히 원심 분리 튜브를 반전. 의 TaqMan 마이크로 RNA 배열 카드의 각 포트에 100 ㎕의 PCR 반응 믹스를 분배. </li><li> 1 분 카드 2 개 1,000 XG에 원심 분리기. 카드를 봉인하고 응용 Biosystems의 설명서와 384도 TAQMAN 저밀도 어레이 설정에서 프라이머와 함께 제공되는 템플릿을 사용하여 실행합니다. 우리는 적용되는 생물계 7900HT 빠른 실시간 PCR 시스템을 사용합니다. </li></ol> 4. TAQMAN (~ 1.5 시간)으로 분석 mRNA의 <ol><li> qPCR의 반응을 준비하려면 차트의 순서로 반응 구성 요소를 섞는다. 모든 샘플은 노말 유전자와 같은 관심뿐만 아니라, 18S rRNA의의의 유전자에 대한 프라이머 프로브로 분석됩니다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 의 TaqMan 반응 구성 요소 </td><td> 1 샘플 볼륨 </td></tr><tr><td> 핵산이없는 물 </td><td> 7 μL (각 샘플에 따라 조정) </td></tr><tr><td> TAQMAN 빠른 마스터 믹스 (2X) </td><td> 10 μL </td></tr><tr><td> 의 TaqMan 프라이머 프로브 (20X) </td><td> 1 μL </td></tr><tr><td> 100 NG RNA로부터 cDNA를 </td><td> 2 &amp; 무, L (개별 샘플에 따라 조정) </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> 제조 (바이오 시스템 7900HT 빠른 실시간 PCR 시스템을 적용)에서 권장하는대로 빠른 96도 블록을 사용하여 96 웰 플레이트를 실행합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

이 프로토콜에서는, 우리는 혈액과 문화 미디어 차등 원심 분리하여 정제 exosomes에서의 miRNAs과의 mRNA의 정량을 보여줍니다. Exosomes는 그들의 기원에 의존 다양한 구성 요소가 면역 반응, 항원 제시 세포 내 통신 및 RNA와 단백질 9,11,12,19,20의 전송을 포함한 생물학적 기능의 숫자에 참여하고 있습니다. 크기와 모양이 exosome 순도의 결정이지만, EM에게 exosomes의 데이터를 표시 논문의 숫자는이 소포는 그들이 고정을 위해 사용되는 방법뿐만 아니라 분비되는 소스 및 영상 9에 따라 크기와 형태에 이르기까지 다양 할 수 있음을 나타냅니다 15. 30-100 ㎚의 exosomes에 허용되는 크기는 소스 21,22, 여러 방법이 exosomal 순도의 유효성을 검사하는 데 사용되는 하나의 이유에 따라 큰 직경 exosomes의 작은 인구를 포함하는 평균 범위입니다. 분비의 miRNAs는 많은 필수 featur있다...

짧은 비 암호화의 miRNAs는 대상의 mRNA에 결합하여 유전자 발현을 조절. ~ 7 기본 쌍의 씨앗 시퀀스 보완은 번역의 억제 또는 대상 단백질 1의 감소 표현 될 수 있습니다 둘 다의 mRNA의 안정성 감소의 결과로 대상의 mRNA에 결합하는 miRNA의 수 있습니다. 지난 10 년간 연구 명백하게 세포 기능을 중재에 miRNA에 대한 근본적인 역할을 입증했다. 또한 각종 질병에게 2,3 기본 miRNA의 매개 분자 변화를 해부쪽으로 이동 상당한 노력이 있었다. 또한, 체액 4-6에서 안정 miRNAs는 최근 식별 임상 진단 의무 새로운 바이오 마커 등의 사용에 대한 방법을 용이하게했다. 체액의 miRNA의 전송 모드 하나는 조직의 혈액 circulat를 통해받는 세포에 exosomes, mRNA를 운반 작은 소포, 단백질, 지질 매개체, 그리고 miRNA에 경유이온 7-14. 받는 사람 세포에서 유전자 발현의 변조,이 결과는 세포 통신의 새로운 메커니즘을 나타냅니다. 예를 들어, 세포 성장 인자-β5 (TGFβ5)를 변환, 분비 및 / 또는 인터루킨-1β (IL1β), 종양 괴사 인자-α (TNFα)와 같은 염증과 관련된 생체 분자를 포함하는 흡수 exosomes가 면역 조절 과정을 조절하고 있습니다 이러한 유전자에게 13 조절하는 miRNA에. 탈선 miRNA의 발현은 인간의 질병의 다양한 일반적인 기능이기 때문에, 이러한 분자는 새로운 치료 표적 (2)의 발견과 검증을위한 새롭고 흥미로운 기회를 제공합니다. 순환의 miRNAs의 모든 체액에 존재하며 그것은 exosomes의 조성이 발매 된에서 원본 셀에 따라 다른 것으로 알려져있다. 따라서 그들은 세포의 생리적 상태를 연구하는 수단을 제공하는 방법과 세포도 신호 alter입니다질병 등 스트레스 님의 질문에 답변 TS. exosome 구성의 변화를 공부하는 것은 신호 전달에 대한 통찰력을 제공하고 생체 또는 치료 적 개입 경로로 자신의 잠재력 유틸리티를 조사 할 수 있습니다. 여기 게시 된 프로토콜에 따라 여러 소스에서 exosomes의 정화를 보여줍니다. 이러한 exosomes는 exosomes에 존재하는 miRNA에의 수준을 파악하고 측정하는 qPCR에 이어 RNA 분리에 사용됩니다.

<table><tbody><tr><td>EDTA 코팅 바큐테이너(10ml 튜브)</td><td>BD 진단</td><td>366643</td><td>인간 혈액에서 엑소좀 정제</td></tr>용<tr><td>EDTA 코팅 바큐테이너(2ml 튜브)</td><td>BD 진단</td><td>367841</td><td>마우스 혈액에서 엑소좀 정제</td></tr><tr><td>PAXgene 혈액 RNA 튜브</td><td>BD 진단</td><td>762165</td><td>총 혈액에서 miRNA 분리용</td></tr><tr><td>miRVana microRNA 분리 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>산-페놀 : CHCl3</td><td>Ambion</td><td>9721G</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 범용 PCR 마스터 믹스, 없음 AmpErase UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4326614</td><td>TLDA 카드</td></tr><tr><td>용 Megaplex RT 설치류 풀 세트 v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444746</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex 프리 앰프 설치류 풀 세트 v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4444747 Taqman Array 설치류 MicroRNA A+B 세트 V3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444909</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT Human Pool set V3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444745</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex Preamp Human Pool set v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444748</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444913</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA RT kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman fast universal PCR 마스터 믹스 </td><td>Applied Biosystems</td><td>4366072</td><td>mRNA qRT-PCR</td></tr><tr><td>종양 괴사 인자 (프라이머 프로브)</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs01113624_g1</td><td></td></tr><tr><td>혈관 내피 성장 인자 A (프라이머 프로브)</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00900055_m1</td><td></td></tr><tr><td>Maxima First Strand cDNA RT-qPCR용 합성 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1642</td><td>mRNA</td></tr><tr><td>HSP70 항체</td><td>Abcam</td><td>ab94368</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>IgG-Gold</td><td>Sigma</td><td>G7402</td><td>전자 현미경용</td></tr><tr><td>Rabbit-anti CD81</td><td>Sigma</td><td>SAB3500454</td><td></td></tr><tr><td>Nickel 300 mesh carbon formvar grids</td><td>전자 현미경 과학</td><td>FCF300-Ni</td><td></td></tr><tr><td>구리 300 메쉬 탄소 formvar 그리드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">표 1. 특정 시약 표.</td></tr></tbody></table>

혈액과 문화 매체에서 파생 exosomes의 정화 및 마이크로 rna 프로파일

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

안정되어있는 miRNA의 모든 체액에 존재하는 어떤 순환의 miRNAs는 exosomes라는 작은 소포에 격리에 의해 분해로부터 보호됩니다. Exosomes는 대상 세포에 RNA와 단백질의 이동의 결과 세포막과 융합 할 수 있습니다. 자신의 생물학적 기능은 면역 반응, 항원 프레 젠 테이션 및 세포 통신을 이용하실 수 있습니다. 혈액을 통해받는 사람 세포에서 유전자 발현을 조절할 수있는 miRNA의 배달 대상의 개입에 대한 새로운 길을 열었습니다. 약물이나 RNA 치료제의 전달을위한 전략을 제공 할뿐 아니라, exosomal 내용은 처리 옵션 및 예후를 결정하는 진단에 도움이 될 수 있습니다 생체 역할을 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 양적으로 혈액과 세포 배양 배지에서 분비 exosomes에서의 miRNAs 및 메신저 RNAs (mRNA의)를 분석하기위한 절차를 설명합니다. 정제 exosomes는 EXOS을위한 서양 얼룩 분석을 사용하여 특성화 될 것입니다관심의 mRNA에 대한 OMAL 마커와 PCR. 투과 전자 현미경 (TEM)과 immunogold 라벨은 exosomal 형태와 무결성을 검증하는 데 사용됩니다. 총 RNA는 우리가 동일한 샘플의 발현 및 miRNA의 모두 공부를 할 수 있도록 이러한 exosomes에서 정화 될 것입니다. Bioanalyzer에 의해 RNA 무결성을 검증 후에, 우리는 TAQMAN 저밀도 어레이 (TLDA) 카드와 그 성적에 대한 유전자 발현 연구를 사용하여 exosomal miRNA의를 식별하는 중간 처리 정량 실시간 PCR (qPCR에)을 수행합니다. 이러한 프로토콜은 약물 개입 전후 환자, 설치류 모델 및 세포 배양 매체 exosomal의 miRNAs의 변화를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. Exosomal 내용으로 인해 원래의 소스와 분비 exosomes 그 세포의 생리적 상태에 따라 다릅니다. 이러한 변화는 세포 시스템이 스트레스 생​​리 교란에 대처하는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 우리의 대표적인 데이터는 V 표시miRNA에있는 ariations 마우스 혈액, 인간의 혈액과 인간의 세포 배양 매체에서 정제 exosomes에 제시한다. 여기에서 우리는 양적으로 혈액과 세포 배양 배지에서 분비 exosomes에서의 miRNAs 및 메신저 RNAs (mRNA의)를 분석하기위한 절차를 설명합니다. 정제 exosomes의 관심의 mRNA에 대한 exosomal 마커와 PCR을위한 서양 얼룩 분석을 사용하여 특성화 될 것입니다. 투과 전자 현미경 (TEM)과 immunogold 라벨은 exosomal 형태와 무결성을 검증하는 데 사용됩니다. 총 RNA는 우리가 동일한 샘플의 발현 및 miRNA의 모두 공부를 할 수 있도록 이러한 exosomes에서 정화 될 것입니다. Bioanalyzer에 의해 RNA 무결성을 검증 후에, 우리는 TAQMAN 저밀도 어레이 (TLDA) 카드와 그 성적에 대한 유전자 발현 연구를 사용하여 exosomal miRNA의를 식별하는 중간 처리 정량 실시간 PCR (qPCR에)을 수행합니다. 이러한 프로토콜은 exosomal의 miRNAs의 변화를 정량화하는 데 사용할 수있는 전약물 개입 전후 N 환자, 설치류 모델 및 세포 배양 매체. Exosomal 내용으로 인해 원래의 소스와 분비 exosomes 그 세포의 생리적 상태에 따라 다릅니다. 이러한 변화는 세포 시스템이 스트레스 생​​리 교란에 대처하는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 우리의 대표적인 데이터의 miRNAs의 변화 마우스 혈액, 인간의 혈액과 인간의 세포 배양 매체에서 정제 exosomes에 존재하는 표시

혈액이나 세포 배양 매체에서 exosomes를 분리 한 후, exosomes의 순도는 전자 현미경 (EM)와 서양 얼룩 (그림 1A와 1B)에서 테스트 할 수 있습니다. 우리는 EM 여러 항체를 사용하여 서양 얼룩으로 다양한 소스로부터 우리 exosome 준비를 확인했다. 그림 1A는 exosomes는 ~의 직경 30 ~ 100 m로 그대로이며, immunogold 라벨로 CD81를 포함하는 것을 확인 EM 이미지를 보여줍니다. 일반적으로 사용되는 exosomal 마커 Hsp70의 및 tetraspannin 가족 당 단백질 CD63, CD81과 CD9 14아르. 정제 exosomes의 무결성을 확인한 후, 우리는 그림 1B에있는 Hsp70의에 대한 서양 얼룩을 수행하고 미디어를 혼자 (대조군)하지 않지만 exosomes는 Hsp70의 포함 된 것으로 나타났다. Bioanalyzer 추적 RAW 세포 배양 매체에서 격리...

exosomes에서 안정 마이크로 RNA (miRNA에)의 존재는 생체로 및 치료 개입에 대한 경로로 자신의 잠재력 유틸리티, 간 커뮤니케이션의 새로운 형태로 엄청난 관심을 생성했습니다. 여기에 우리가 전송되는 miRNA에를 식별하는 정량 PCR에 의해 다음 혈액과 문화 미디어에서 exosome 정화를 보여줍니다.

혈액과 문화 매체에서 파생 Exosomes의 정화 및 마이크로 RNA 프로파일

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

이 절차의 전반적인 목표는 혈액 또는 세포 배양 배지에서 얻은 엑소좀에 존재하는 microRNA를 식별하고 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 차등 원심분리를 사용하여 혈액 또는 세포 배양 배지로부터 엑소좀을 정제함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 nirvana micro RNA isolation kit를 사용하여 총 엑소좀 RNA를 정제하는 것입니다.정제된 RNA의 무결성과 농도를 확인한 후, Megaplex 역전사 효소 반응 키트의 시약을 사용하여 cDNA로 전환합니다. 다음으로, Megaplex 프리앰플리피케이션 프라이머와 TaqMan 프리앰프 마스터 믹스를 사용하여 사전 증폭 단계를 수행합니다. 마이크로RNA를 증폭하기 위한 마지막 단계는 건조된 TaqMan 프라이머 프로브가 포함된 384-웰 마이크로플루이딕 카드 또는 TaqMan 저밀도 어레이 카드를 사용하여 실시간 PCR 반응을 진행하는 것입니다.궁극적으로, 이 절차를 통해 최대 758종의 알려진 microRNA를 검출할 수 있습니다. 이 기술은 엑소좀 microRNA 함량의 변화를 측정하며, 이러한 변화는 엑소좀이 분비되는 기원 및 생리적 조건에 따라 달라집니다. 이러한 고유한 시그니처를 정량화함으로써 얻는 시사점은 바이오마커 개발 및 새로운 치료적 개입으로 확장됩니다.전략.이 절차를 시작하려면, 전혈 10 milliliters가 들어 있는 EDTA 코팅 튜브를 5회 반전시켜 항응고제가 잘 섞이게 한 후, 상온에서 10분에서 60분 동안 세워 둡니다. 그다음 혈액을 분리하기 위해 샘플을 2000 times G, 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. 15분 후, 원심분리기에서 튜브를 꺼내 새로운 15 milliliter 튜브에 혈장을 수집합니다. 혈장을 얼음 위에 두고 동일한 부피의 PBS로 희석합니다.그런 다음 샘플을 부드럽게 혼합하고, 2000 ×g, 4 °C에서 30분 동안 원심분리기에 넣고 원심분리합니다. 다음으로 원심분리기에서 샘플을 꺼냅니다. 이를 새로운 원심분리 튜브로 옮깁니다.XPBS 1ml를 24ml에 첨가하고 12,000 ×g, 4°C에서 45분간 원심분리합니다. 그 후 상층액을 초원심분리 튜브로 옮겨 110,000 ×g, 4°C에서 2시간 동안 원심분리합니다. 2시간 후.초원심분리기로부터 샘플을 꺼내고 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 펠렛을 차갑게 식힌 PBS에 재부유시킨 후 샘플을 다시 초원심분리기에 넣습니다.

purification-microrna-profiling-exosomes-derived-from-blood-culture

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

본 논문은 격리, 정화 및 exosomes의 감지,뿐만 아니라 분자의 콘텐츠 분석 기술에 대한 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 세포 배양 매체와 생물 학적 체액 모두에서 exosome 고립에 대한 적응력, 그리고 분자 내용의 분석을 넘어도 기능성 연구에 유용할 수 있습니다.

RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성

인간 면역결핍 바이러스(HIV) 입자에서 엑소좀을 분리하는 그래디언트 절차를 설명하는 기술을 설명합니다. 이 절차는 HIV에 감염된 사람의 인간 혈장에 있는 HIV 입자로부터 엑소좀을 분리하는 데 사용되었습니다. 분리된 엑소좀은 사이토카인/케모카인 함량을 분석했습니다.

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

담즙액은 잠재적으로 중요한 바이오마커를 포함하는 세포 외 소포체/엑소좀의 귀중한 공급원입니다. 이 프로토콜은 miRNA 프로파일링을 포함한 추가 분석을 위해 인간 담즙에서 엑소좀을 분리하는 강력한 방법을 나타냅니다.

격리 및 프로파일 링 마이크로 RNA-포함하는 인간의 담즙에서 엑소 좀을

마이크로 RNA는 중요한 조절 역할을하고 다양한 인간 질병에 대한 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다. miRNAs의 고밀도 지단백질에 수행되는 것을 도시하고있다. 우리는 빠른 속도로 인간 혈장에서 miRNA의 분석에 적합한 정제 HDL을 분리하는 간단한 방법을 개발했다.

고도로 정제 된 고밀도 지단백질에서의 miRNA의 높은 넣어 관통 분리에 대한 신속하고 단순화 된 방법

혈액에 존재하는 세포외 소포체는 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커로 제안되었습니다. 여기에서는 말초 혈액 샘플에서 대형 원형질막 유래 미세소포를 분리하고 기존 유세포 분석 및 웨스턴 블로팅(Western Blotting)을 통한 후속 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다.

말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성

여기, 선물이 exosomes 플라즈마와 비 exosomal 혈액 단백질의 감소 공동 정화와 혈 청에서 순화 하는 프로토콜. 최적화 된 프로토콜 적용, 효소 치료, 및 크기 배타 착 색 인쇄기를 포함 한다. Exosomes 혜택 다운스트림 분석, 소포 및 proteomic 특성의 더 정확한 정량화를 포함 하 여 향상 된 정화.

단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하

여기, 두 세포 외 기 격리 프로토콜, 한 원심 분리 및 밀도 그라데이션 원심 분리, extracellular 소포 murine bronchoalveolar 게 액체 샘플에서 분리 된 ultracentrifugation 설명 합니다. 두 방법으로 murine bronchoalveolar 게 액체에서 파생 된 세포 외 소포는 계량 하 고 특징.

Extracellular 소포 Murine Bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리

이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

exosome 마약 배달 사업자의 새로운 세대입니다. 우리는 높은 수율 및 순도 siRNA 전달 exosome 격리 프로토콜을 설립. 우리는 또한 exosomes에 놓여있는지 이라는 일반적인 siRNA를 캡슐화 하 고 siRNA 로드 exosomes 암 세포에서의 세포질 통풍 관을 조사.

SiRNA 암 세포에 배달에 대 한 Exosomes의 준비

이 프로토콜은 1) 성체 마우스 비복근에서 일차 섬유아세포를 분리하고 배양하는 방법과 2) 자당 밀도 구배와 웨스턴 블롯 분석을 결합한 차등 초원심분리 방법을 사용하여 엑소좀을 정제하고 특성화하는 방법을 보여줍니다.

골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

학습하세요 혈액과 문화 매체에서 exosome을 차등 원심분리법으로 정제하고 microRNA를 분리 분석하는 방법을. 이 기술은 세포 간 소통 연구와 질병 바이오마커 발굴에 활용됩니다.

혈액과 문화 매체에서 파생 Exosomes의 정화 및 마이크로 RNA 프로파일

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