혈액과 문화 매체에서 파생 Exosomes의 정화 및 마이크로 RNA 프로파일

이 절차의 전반적인 목표는 혈액 또는 세포 배양 배지에서 얻은 엑소좀에 존재하는 microRNA를 식별하고 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 차등 원심분리를 사용하여 혈액 또는 세포 배양 배지에서 엑소좀을 정제함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 nirvana micro RNA 분리 키트를 사용하여 총 엑소 오말 RNA를 정제하는 것입니다.

정제된 RNA의 무결성과 농도를 확인한 후 Megaplex 역전사효소 반응 키트의 시약을 사용하여 RNA로 전환합니다. 다음으로, Megaplex 프리앰프 프라이머와 어택맨 프리엠포트 마스터 믹스를 사용하여 프리 앰프 단계를 수행합니다. microRNA를 증폭하기 위한 마지막 단계는 2,384웰 미세유체 카드 또는 건조된 TAC MAN 프라이머 프로브를 포함하는 TAC man 저밀도 어레이 카드를 사용하여 실시간 PCR 반응을 실행하는 것입니다.

궁극적으로 이 절차를 통해 최대 758개의 알려진 microRNA를 검출할 수 있습니다. 이 기술은 분비되는 근원 및 생리학적 조건에 따라 달라지는 엑소 오말 마이크로 RNA 함량의 변화를 측정합니다. 이러한 고유한 시그니처를 정량화하는 것의 의미는 바이오마커 및 새로운 치료 개입의 개발로 확장됩니다. 전략.

이 절차를 시작하려면 10ml의 전혈이 들어 있는 EDTA 코팅된 튜브를 5회 뒤집어 항응고제의 혼합을 확인하고 실온에서 10-60분 동안 똑바로 세운 다음 G의 2000배, 섭씨 4도에서 15분 동안 샘플을 원심분리하여 혈액을 분리합니다. 15분 후 원심분리기에서 튜브를 제거하고 새 15ml 튜브에 혈장을 수집합니다. 플라즈마를 얼음 위에 놓고 동일한 부피의 PBS로 희석합니다.

그런 다음 샘플을 부드럽게 혼합하고 2000회 G와 섭씨 4도의 원심분리기에 30분 동안 놓습니다. 그런 다음 원심분리기에서 샘플을 제거합니다. 새 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

24 밀리리터에 1개의 XPBS를 추가하고 12, 000 시간 G 및 45 분 동안 섭씨 4도에서 원심분리하십시오. 그런 다음 상등액을 초원심분리기 튜브로 옮기고 2시간 동안 110, 000배 G 및 섭씨 4도에서 원심분리기를 사용합니다. 두 시간 후.

샘플을 제거하십시오.amp울트라에서 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 식힌 PBS에 입천장을 재현탁하고 검체를 초원심분리기에 다시 넣습니다. 100, 000 시간 G 및 4 섭씨 온도에서 원심 분리 후 1 시간 동안 회전합니다.

피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 300마이크로리터의 RNA 용해 완충액에 입천장을 재현탁합니다. 또는 샘플을 PBS 또는 RIPPA 버퍼에 현탁시킬 수 있습니다. 전자 현미경 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 각각 개인 보호 장비를 착용하고 R a's zap으로 표면과 피펫을 닦고 멸균 필터 팁과 튜브를 사용하여 RNA 분리 영역을 준비합니다.

그런 다음 350 나노그램 이상의 RNA 사전 증폭이 있는 샘플에 대해 분광계로 분리된 RNA를 정량화하여 RNA의 사전 증폭이 필요한지 여부를 결정하며, 관심 전사체의 양이 적지 않은 한 사전 증폭이 필요하지 않을 수 있습니다. 다음으로, megaplex pool을 사용하여 정제된 RNA로부터 CD NA를 준비합니다. 역전사효소 프라이머.

프라이머를 얼음에서 해동하는 것으로 시작합니다. Pool A 및 Pool B에는 미세유체 카드 어레이 A 및 B의 마이크로 RNA에 대한 프라이머가 포함되어 있으며, 풀 A 프라이머 또는 풀 B 프라이머로 역전사를 위한 두 개의 RNA 무료 1.5ml 튜브를 해동하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 구성 요소와 별도로 각각에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. 풀 A와 풀 B 프라이머를 분리하여 보관하도록 주의하십시오.

그런 다음 마스터 믹스로 튜브를 6 회 뒤집고 RT 반응 믹스의 4.5 마이크로 리터를 마이크로 램프의 각 튜브에 8 개의 튜브 스트립으로 간단히 원심 분리하십시오. 다음으로, 1-350나노그램의 RNA를 포함하는 RNA 샘플 3마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다. 피펫 팁으로 샘플을 저어주고 튜브를 덮습니다.

샘플을 잠시 돌리고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 반응 튜브를 PCR 기계에 넣고 다음 조건에서 실행하십시오. PCR이 완료되면 CDNA를 최대 1주일 동안 섭씨 음의 20도에서 보관하거나 350나노그램 미만의 샘플에 대해 사전 증폭을 계속합니다.

또는 관심 전사체의 농도가 낮은 경우 다음 preem 증폭 단계를 수행합니다.얼음 위의 풀 A와 풀 B에 대한 프리앰프 프라이머를 따라 시작하고 뒤집어 혼합합니다. 다음으로, tack man preempert 마스터 믹스를 휘젓고 얼음 위에 보관하십시오. 또한 증폭 마스터 믹스를 준비합니다.

다음으로 CD NA 생성물 2.5 마이크로 리터를 마이크로 앰프 8 튜브 스트립에 피펫 한 다음 22.5 마이크로 리터의 프리 앰프 반응 마스터 믹스를 첨가합니다. 마지막으로 얼음 위에서 튜브를 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 PCR 기계에 로드하고 다음 조건에서 실행합니다.

preem 증폭 반응이 완료된 후 튜브를 간단히 원심분리한 다음 각 튜브에 75마이크로리터의 0.1 x tris, EDTA pH 8.0을 추가합니다. 다음으로 튜브를 잠시 혼합하고 스핀다운합니다. 계속해서 tach man micro RNA 어레이를 로드하거나 희석된 제품을 섭씨 영하 20도에서 최대 1주일 동안 보관하십시오.

tac MAN 마이크로 RNA 어레이를 위한 샘플을 준비하려면 450마이크로리터의 tac man universal PCR master Mix 9마이크로리터의 희석된 프리앰프 증폭 제품과 441마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 얼음 위의 RNA가 없는 1.5밀리리터 튜브에 결합합니다. 그런 다음 튜브를 6회 뒤집어 혼합하고 샘플을 원심분리합니다. PCR 반응 혼합물 100마이크로리터를 tac man micro RNA 어레이 카드의 각 포트에 간단히 분배합니다.

그런 다음 1000배 G로 1분 동안 카드를 두 번 원심분리한 다음 카드를 밀봉합니다. 그런 다음 어레이를 thermocycler에 로드합니다. 다음으로, applied Biosystem 7, 900 HG fast real-time PCR 시스템에서 mRNA 분석을 실행하기 위해 384 well TAC Man 저밀도 어레이에 대한 Applied Biosystems 매뉴얼의 프라이머와 함께 제공된 기본 열 순환 조건을 사용하여 샘플을 실행합니다.

먼저 96웰 플레이트를 실행하도록 열 블록을 변경합니다. 왼쪽에 보이는 투과 전자 현미경 이미지는 쥐의 혈액에서 분리된 엑소좀입니다. 이 비디오에 설명된 방법을 사용합니다.

오른쪽 이미지는 세포 배양 배지에서 정제한 엑소좀과 금 표지된 anti CD 81 엑소좀의 모습으로, 일반적으로 직경이 30-100나노미터입니다. 설치류 혈액, 인간 혈액 및 인간 대동맥 내피 세포 배양에서 분리된 엑소좀에서 발견되는 정규화된 microRNA의 상대적 풍부함 배지는 U 6 RNA 내인성 대조군 양성 델타 CT 값으로 정규화된 델타 CT 값이 마이크로 RNA의 함량이 낮고 음성임을 나타냅니다. 델타 CT 값은 마이크로 RNA가 더 풍부하다는 것을 나타냅니다.

모든 microRNA가 각 샘플 유형에 존재하는 것은 아닙니다. 예를 들어, 설치류의 혈액 엑소좀에서는 1,26개만 검출되지 않았으며, H-A-O-E-C 엑소좀에서는 200C만이 검출되지 않았습니다. 나머지 4개의 microRNA는 3개의 샘플 모두에 다양한 양으로 존재합니다.

이 프로토콜은 엑소오말 마이크로RNA를 특성화하는 데 중점을 두고 있지만, 전혈의 Mr.NA 과 비교할 때 QPCR을 사용하여 엑소좀에서 개별 Mr.NA 전사체를 정량화할 수도 있습니다. Exo Omal, RNA는 TNF 알파와 혈관 내피 성장 요인 A.Combining 둘 다 TNF 알파와 관 내피 성장 요인 A.Combined의 유사한 표정을 보여주었습니다 회람 RNAs의 기능을 탐구하는 RNA 생물학의 분야에 있는 연구원을 위한 길을 닦았습니다. 유전자 발현 변화를 매개하고 정상 상태와 질병 상태 모두에서 엑소좀과 관련된 분자 신호를 식별합니다.