식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

다음 실험의 전반적인 목표는 높은 민감도와 특이도로 세포 수준에서 mRNA 발현 패턴을 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 일련의 솔루션을 통해 형식 및 고정 및 파라핀 내장 조직 절편을 취하여 왁스를 제거하고 조직을 제거하고 배경 신호를 생성할 수 있는 조직에서 양전하를 띤 소그룹을 차단함으로써 달성됩니다. 그 후, 관심 유전자에 특이적인 DIG 표지된 RNA 프로브가 조직 섹션에 침투하고 슬라이드가 하룻밤 사이에 혼성화됩니다.

다음으로, 슬라이드는 RNA로 처리됩니다. A를 사용하여 절편에서 비특이적으로 결합된 프로브를 제거한 다음 anti DIG 항체로 배양합니다. 이를 통해 컬러 메트릭 화학 반응에 의한 하이브리드화된 프로브를 시각화할 수 있습니다.

그 결과, 관심 유전자가 발현되는 조직 내의 세포에서 특히 광학 현미경으로 검출할 수 있는 짙은 파란색 신호가 나타납니다. R-T-P-C-R, 마이크로레이 또는 차세대 염기서열분석 접근법과 같은 다른 발현 분석의 이 기술의 주요 장점은 여기에 표시된 I 혼성화 프로토콜이 조직 맥락에서 관심 유전자의 발현 패턴을 나타낸다는 것입니다. 이러한 방법에는 시각적 데모를 통해 가장 잘 배울 수 있는 많은 단계가 포함되어 있습니다.

조직을 절편하고 삽입하는 방법과 Al Hybridization pro 프로토콜의 주요 단계를 보여드리겠습니다. 파라알데히드 고정 조직을 포매하는 방법은 분석할 조직의 유형에 따라 다릅니다. 여기서 가장 중요한 점은 나중에 절편화할 수 있도록 샘플의 방향이 올바른지 확인하는 것입니다.

임베딩의 한 가지 방법은 플라스틱 몰드와 링을 사용하는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 섭씨 60도의 보온판에서 금형을 예열한 다음 용융된 파라핀을 금형에 붓습니다. 다음으로, 데워진 집게를 사용하여 조직 샘플을 각 금형으로 옮기고 원하는 위치로 방향을 잡습니다.

플레이트에서 벤치로 금형을 조심스럽게 옮기고 흰색 링을 금형에 놓습니다. 추가 mol과 왁스를 추가하십시오. 절단하기 전에 왁스를 식히고 점차적으로 굳히십시오.

블록을 실온으로 데운 다음 각 블록을 사다리꼴 모양으로 자르고 샘플 주위에 약 1mm의 왁스를 남깁니다. 두 개의 평행한 면 중 더 긴 면이 아래쪽에 오도록 트리밍된 블록을 마이크로톰에 놓습니다. 블록을 블레이드 쪽으로 조심스럽게 가져오고 블록의 표면이 블레이드 섹션과 평행한지 확인하십시오.

8-10 미크론의 두께로. 왁스 리본을 알루미늄 호일과 같이 달라붙지 않는 표면에 정렬하고 해부 범위에서 관심 부분을 선택합니다. 다음으로, 연필로 prob bon plus 슬라이드를 표시합니다.

마커에 펜은 INI 2 하이브리드화 프로토콜 중에 지워지므로 마커에 펜을 사용하지 마십시오. 각 슬라이드에 깨끗한 milli Q 물 1ml를 분배합니다. 실온에서 물 표면에 관심 부분을 조심스럽게 띄웁니다.

반짝이는 면이 물을 향하도록 하십시오. 슬라이드를 슬라이드 워머로 천천히 옮깁니다. 섭씨 35도에서 37도로 설정합니다.

일반적으로 사용되는 섭씨 42도와는 반대되는 이 온도 범위는 섹션 아래에 기포가 형성되는 것을 방지합니다. 5분 후 조심스럽게 물을 붓되 리본이 슬라이드 위로 내려가도록 한 번의 부드러운 동작으로 물을 붓습니다. 슬라이드를 최소 몇 시간 동안 또는 섭씨 37도에서 밤새 건조시켜 조직이 조직 절편을 준비하기 위해 부착되도록 합니다.

현장 교잡의 경우, 그들은 먼저 depa이고 depa 완결을 위해 재수화됩니다. 각각 10분 동안 histic clear solution을 두 번 변경하여 슬라이드를 배양합니다. 조직 부분을 재수화하려면 각각 30초 동안 일련의 감소하는 농도의 에탄올을 슬라이드에 통과시킵니다.

이 비디오에 표시되지 않은 프로테아제 치료 중에는 0.1몰 트라이애슬론 아민 용액이 든 유리 접시를 준비하고 이를 흄 후드의 교반 플레이트에 설정합니다. 금속 슬라이드 랙을 용액에 넣기 직전에 1.25ml의 무수아세트산을 트라이애슬론 아민, 버퍼 및 계단통에 추가합니다. 또한 클램핑 시스템과 슬라이드 랙을 고정하기 위한 스탠드를 설정합니다.

Starr cl의 속도를 줄이십시오.amp 슬라이드 랙을 스탠드에 놓고 랙을 용액으로 내리고 교반 막대 위로 올려 놓습니다. PBS로 헹구고 에탄올 시리즈를 통해 다시 탈수한 후 10분 동안 천천히 계속 저어줍니다. 조직 절편은 교잡을 위해 준비되어 있습니다.

슬라이드를 깨끗한 표면에 놓고 5-10분 동안 공기를 완전히 건조시킵니다. 변성된 프로브를 80마이크로리터의 혼성화 완충액에 첨가하여 프로브 혼성화 완충액 혼합물을 준비합니다. 각 슬라이드에 대해 피펫팅으로 잘 혼합하고 거품을 만들지 마십시오.

프로브 혼성화 버퍼를 피펫팅합니다. 슬라이드의 오른쪽 가장자리에 믹싱합니다. 커버 슬립을 슬라이드로 점차적으로 내리고 혼성화 솔루션이 기포 없이 모든 섹션을 덮는지 확인합니다.

거품이 형성되는 부분을 손가락으로 가볍게 두드려 모든 조직 섹션에서 제거합니다. 섹션이 손상될 수 있으므로 덮개 가위를 잡아당기지 마십시오. UE 물로 적신 watman 종이가 들어 있고 param으로 크게 덮인 습도 챔버에 슬라이드를 놓습니다.

상자를 단단히 밀봉하고 원하는 혼성화 온도(일반적으로 섭씨 50-55도)에서 16-20시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 하이브리드화 프로토콜이 완료되면 슬라이드에서 커버 슬립을 조심스럽게 제거합니다. 슬라이드를 똑바로 세웠을 때 커버 슬립이 단순히 떨어질 수 있지만, 그렇지 않은 경우 섹션이 손상될 수 있으므로 커버 슬립을 잡아당기지 마십시오.

대신, 슬라이드를 따뜻한 0.2배 SSC에 1-2분 동안 담그고 커버 슬립을 제거한 후 커버 슬립을 씻어내고 슬라이드를 랙에 놓고 섭씨 0.2도에서 SSC 55배로 여러 번 세척합니다. RNA 처리 후 랙의 슬라이드를 평평한 플라스틱 상자 바닥으로 옮기고 최소한의 차단 용액으로 덮습니다. 천천히 흔들리는 플랫폼에서 실온의 45분 동안 슬라이드를 차단합니다.

다음으로, 각 슬라이드에 최소한의 항체 용액을 직접 도포합니다. 실온에서 2-3시간 동안 어두운 곳에서 슬라이드를 배양합니다. 배양이 완료되면 슬라이드를 깨끗하고 평평한 상자로 옮기고 실온의 진탕 플랫폼에서 최소한의 세척 버퍼로 슬라이드를 4회 세척합니다.

TBS에서 한 번, TN 완충액에서 두 번 슬라이드를 헹구어 새로 준비된 염색 용액을 슬라이드에 바릅니다. 먼저 염색 용액을 작은 플라스틱 계량 접시에 붓습니다. 그런 다음 섹션이 서로 마주보도록 두 개의 슬라이드를 함께 끼웁니다.

샌드위치를 용액에 담그면 모세관 작용이 용액을 끌어올릴 수 있습니다. 김 물티슈로 슬라이드를 배수합니다. 슬라이드에 염색 용액을 채웁니다.

다시 말하지만, 거품을 피하기 위해 용액이 유입될 때 슬라이드를 두드려야 할 수도 있으며, 슬라이드를 플라스틱 상자에 넣고 어두운 곳에서 실내 온도를 보관해야 할 수도 있습니다. 다양한 프로브와 애기장대 조직으로 얻은 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 보라색 신호는 관심 유전자의 발현 패턴에 대한 세포 해상도에서 직접 시각화를 제공합니다.

패널 A는 식물 싹 정점에서 싹 Meli one 전사체의 국소화를 보여줍니다. 분열체의 불확정성에 자주색 파란색 신호가 존재하고 주변 잎에 신호가 없다는 점에 유의하십시오. 패널 B 2D는 애기장대 어뢰 단계 배아의 단면으로, B는 소수의 배아 줄기 세포에서 코바타 3 발현을 보여줍니다.

C는 표피층에서 T ML one 발현을 나타내고, D는 무작위 음성 대조군 RNA로 조사된 섹션에서 신호 부족을 나타냅니다. 다음 이미지는 미로 조직에서 다른 프로브로 얻은 결과를 보여주었습니다. 패널 E는 발달 중인 미로 배아에서 매듭을 지은 STM Humalog의 국소화를 보여줍니다.

특히 식물 슈트 정점을 통한 배아 줄기 및 뿌리 세로 부분에서 강한 신호는 ARF 3 A가 패널 F의 축 방향 바닥 잎 표면에서 발현되고 A T ML 1 상동 OCL 4가 표피에서 특이적으로 발현됨을 보여줍니다. 패널 G.As 에서는 패널 H의 음성 대조군 프로브에 대해 혼성화 신호가 관찰되지 않았으며, 프로브의 시험관 내 전사 중 다른 체크포인트의 예상 결과가 여기에 나와 있습니다. in situ hybridization probe는 DNA의 처리 후 in vitro transcription 후 표준 ARAZ gel에서 확인되며, 탄산염 가수분해 후 in vitro transcription reaction의 후속 정제 후 프로브 1과 같이 길이가 250 염기쌍 이상인 프로브에 사용할 준비가 되면 탄산염 가수분해를 통해 다양한 더 작은 probe fragments를 생성할 수 있습니다.

이 그림은 10에서 마이너스 1에서 10, 마이너스 5 사이의 점도 블롯 분석 희석에 의한 프로브의 색상 및 미터법 적격성 평가 결과를 보여주며, 3개의 새로 라벨링된 DIG 라벨링 프로브는 항 DIG 항체 및 분석으로 배양된 전달 멤브레인에서 발견됩니다. 이 분석은 프로브 2의 경우 마이크로리터당 100나노그램, 프로브 3의 경우 마이크로리터당 10나노그램, 프로브 4의 경우 마이크로리터당 1나노그램의 추정 농도를 시사하며, 이는 프로브 4가 혼성화 신호에 대해 양호한 잡음을 생성할 가능성이 없음을 나타냅니다. 마지막으로, Mace의 식물 낙하산 정점을 통한 이러한 세로 단면은 불특정 배경 신호와 잘 작동하는 프로브 패널을 비교합니다.

A는 비특이적 배경 신호를 나타내고, 패널 B는 외부 세포층의 OC 5 프로브에 대한 특이적 in situ 2 혼성화 신호를 보여줍니다. 이것을 보고 나면 init hybridization 프로토콜의 많은 까다로운 단계를 수행하는 방법을 잘 이해하여 좋아하는 십대의 정확한 압력 시간 표현 패턴을 결정할 수 있습니다.