Name: 식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 배우세요 파라핀 포매 식물 조직에서 mRNA 발현 패턴을 시각화하는 원위치 하이브리드화 기법을. DIG 표지 RNA 프로브와 색소 반응을 활용하여 세포 수준에서 유전자 발현을 정밀하게 분석하는 방법입니다.

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MT의 연구실에서 연구는 국립 과학 재단 (DBI - 0820610 및 IOS - 1022102)와 건강의 뉴욕과 (NYSTEM - C024308)에서 기금에 의해 지원됩니다. CM은 교육과 과학 (2007-0937)와 재단 라파엘 델 피노, 스페인의 스페인 교육부에서 박사 장학금을 받았습니다.

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<li>Li, P., Ponnala, L., Gandotra, N., Wang, L., Si, Y., Tausta, S. L., Kebrom, T. H., Provart, N., Patel, R., Myers, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nat. Genet. 42, 1060-1067 (2010).</li>
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<li>Brooks, L., Strable, J., Zhang, X., Ohtsu, K., Zhou, R., Sarkar, A., Hargreaves, S., Elshire, R. J., Eudy, D., Pawlowska, T., Ware, D., Janick-Buckner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+shoot+meristem+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microdissection of shoot meristem functional domains.</a> PLoS. Genet. 5, e1000476-e1000476 (2009).</li>
<li>Galbraith, D. W., Birnbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+studies+of+cell+type-specific+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Global studies of cell type-specific gene expression in plants.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 57, 451-475 (2006).</li>
<li>Ohtsu, K., Smith, M., Emrich, S., Borsuk, L., Zhou, R., Chen, T., Zhang, X., Timmermans, M., Beck, J., Buckner, B., Janick-Buckner, D., Nettleton, D., Scanlon, M., Schnable, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+analysis+of+the+shoot+apical+meristem+of+maize+%28Zea+mays+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant.+J%22%5BJournal%5D)">Global gene expression analysis of the shoot apical meristem of maize (Zea mays L.).</a> Plant. J. 52, 391-404 (2007).</li>
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<li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399, 144-148 (1999).</li>
<li>Stuurman, J., Jäggi, F., Kuhlemeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot+meristem+maintenance+is+controlled+by+a+GRAS-gene+mediated+signal+from+differentiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells.</a> Genes Dev. 16, 2213-2218 (2002).</li>
<li>Kim, M., McCormick, S., Timmermans, M., Sinha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+domain+of+PHANTASTICA+determines+leaflet+placement+in+compound+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The expression domain of PHANTASTICA determines leaflet placement in compound leaves.</a> Nature. 424, 438-443 (2003).</li>
<li>Kramer, E. M., Holappa, L., Gould, B., Jaramillo, M. A., Setnikov, D., Santiago, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elaboration+of+B+gene+function+to+include+the+identity+of+novel+floral+organs+in+the+lower+eudicot+Aquilegia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Elaboration of B gene function to include the identity of novel floral organs in the lower eudicot Aquilegia.</a> Plant Cell. 19, 750-766 (2007).</li>
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<li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li>
<li>Jackson, D., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+phyllotaxy+in+maize+by+the+abphyl1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of phyllotaxy in maize by the abphyl1 gene.</a> Development. , 126-315 (1999).</li>
<li>Chuck, G., Whipple, C., Jackson, D., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maize+SBP-box+transcription+factor+encoded+by+tasselsheath4+regulates+bract+development+and+the+establishment+of+meristem+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maize SBP-box transcription factor encoded by tasselsheath4 regulates bract development and the establishment of meristem boundaries.</a> Development. 137, 1243-1250 (2010).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 명시된 현장 하이브 리다이 제이션 방식의 좋은 세포 해상도, 높은 감도와 특이성과 관심의 유전자의 spatiotemporal 표현 패턴의 직접 시각화 수 있습니다. 프로토콜은 유전자 간의 표현 수준의 양적 비교를 허용하지 않습니다. 그러나, 방법의 높은 감도와 해상도가 유전자 발현을 분석 대부분의 다른 방법으로 가능하지 않은 조직이 8, 18, ​​내의 유전자 발현의 그라디언트를 공개하실 수 있습니다. 프로토콜 문제 해결은 문제가 만들 수있는 단계가 포함되어 있습니다. 프로토콜의 가장 중요한 단계는 조직의 고정 및 프로브의 선택과 라벨입니다. 낮은 발굴의 설립과 함께 저조한 침투 조직 및 프로브는 배경 위에 감지하기 어려울 수도 매우 약한 신호를 얻을 것입니다. 관심 각각의 새로운 유전자 들어, diffe에서 파생된 몇 가지 뚜렷한 프로브를 시도하는 것이 좋습니다명시 지역을 임대. 때때로, 유전자의 다른 작은 지역을 대상으로 두 개 또는 세 탐사선이 강하고 특정 하이브 리다이 제이션 신호를 얻기 위해 결합해야 할 수도 있습니다. 또한, 같은 온도와 하이브 리다이 제이션 버퍼 구성으로 하이브 리다이 제이션 조건, 각각의 유전자 또는 하이브 리다이 제이션 엄중을 낮추거나 높일 조직에 대해 최적화할 수 있습니다. 또한 단백 분해 효소 처리 단계는 변수이며 다른 식물 종 (种) 또는 매우 낮은 풍부한 성적의 검출을위한 프로토콜을 적응 변경할 수 있습니다. 모두 긍정적이고 부정적인 제어 프로브의 포함은 프로토콜의 문제 지점을 식별하는데 도움이 될 것입니다. 절차는 파라핀 - 임베디드 식물 조직 섹션에 최적화되어 있지만 사소한 수정은 현장 하이브리드화에서 전체 마운트에도 사용할 수 있습니다로. 널리 원위치 하이브리드화에서 동물 연구 19 전체 마운트에 사용되는 것은 있지만 리터 것입니다이러한 배아, 뿌리 또는 젊은 meristematic 조직 20,21 쉽게 침투 수있는 식물 조직에 imited. 프로토콜은 쉽게 동시에 두 개의 mRNAs를 검색하거나 단백질 15,22,23 함께 성적표를 집중하기 위해 수정할 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 식물의 작은 RNA 표현 패턴의 시각화에이 방법의 응용 프로그램을 확장하는 것이 가능합니다. miRNA 발현 패턴은 옥수수와 Arabidopsis 8,14 모두에서이 프로토콜을 사용하여 결정되었습니다. 최근 체외 베꼈는데 프로브에있는가에 의해 대체되었습니다 상용 파다 - 레이블 잠금 핵산 (LNA) oligo 프로브 그 증가 신호 감도 18, 24.

<table border="1"><tbody><tr><th> 제품 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 비고 </th></tr><tr><td> Cytoseal 60 4온스 </td><td> 어부 </td><td> 23-244-256 </td><td> 톨루엔 기반 8310-4 </td></tr><tr><td> Histoclear </td><td> 어부 </td><td> 50-899-90147 </td><td></td></tr><tr><td> 조직 경로 Paraplast 플러스 </td><td> 어부 </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> N + 나일론 막 Hybond - N + </td><td> GE 헬스케어 </td><td> RPN203B </td><td></td></tr><tr><td> RNase OUT, 40 U / μL </td><td> Invitrogen </td><td> 10777019 </td><td></td></tr><tr><td> RQ1 RNase - 무료 DNase, 1 U / μl </td><td> Promega </td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> 발굴 - 라벨 컨트롤 RNA </td><td> 호슈 </td><td> 11585746910 </td><td></td></tr><tr><td> 발굴 RNA 라벨 믹스 </td><td> 호슈 </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA 효소 1,000 U </td><td> 호슈 </td><td> 10810274001 </td><tD&gt; </td></tr><tr><td> T3 RNA 효소 1,000 U </td><td> 호슈 </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA 효소 1,000 U </td><td> 호슈 </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase - A </td><td> 호슈 </td><td> 109,142 </td><td> 글리세롤 50% 트리스 100mM pH8.0에서 용해 </td></tr><tr><td> 시약을 차단 </td><td> 호슈 </td><td> 1 096 176 </td><td> ° C TBS 버퍼 70 개까지 열 </td></tr><tr><td> 안티 Digoxygenin - AP, 양 150 U의 팹 조각 </td><td> 호슈 </td><td> 1 093 274 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP 재고 솔루션 </td><td> 호슈 </td><td> 1 681 451 </td><td></td></tr><tr><td> 미니 빠른 스핀 RNA 열 </td><td> 호슈 </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> E.에서 tRNA 대장균 </td><td> 호슈 </td><td> 109,541 </td><td></td></tr><tr><td> 트라 이튼 ® X - 100 </td><td> 시그마 </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반 - 2​​0</td><td> 시그마 </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Deionized 포름 아미드 </td><td> 시그마 </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> Streptomyces griseus 유형 XIV에서 프로 테아제 </td><td> 시그마 </td><td> P5147 </td><td> 37 milliQ 물, 사전 다이제스트 4 시간 만에 희석 ° C </td></tr><tr><td> Triethanolamine </td><td> 시그마 </td><td> 90,279 </td><td> 물에 희석, HCL와 pH8.0 데리고 </td></tr><tr><td> 아세트산 무수물 </td><td> 시그마 </td><td> A6404 </td><td></td></tr><tr><td> Leuconostoc 종에서 Dextran 황산 나트륨 소금. </td><td> 시그마 </td><td> D8906 - 5G </td><td> Dextran 황산은 ° C가 용해에 80 가열한다. </td></tr><tr><td> Denhardt의 솔루션 50x 컨센트레이트 </td><td> 시그마 </td><td> D2532 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민에서 - ≥ 98% </td><td> 시그마 </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin Y 나트륨 소금 </td><td> 시그마 </td><td> E4382 </td><td> 포화까지 96~100%의 에탄올에 용해 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 시그마 </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 절대 200 증명 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 페놀 / 클로로포름 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 기본 틀 </td><td> 전자 Microsocpy 과학 </td><td> 62352-15 </td><td></td></tr><tr><td> 퍼가기 반지 </td><td> 어부 </td><td> 22-038-197 </td><td></td></tr><tr><td> 모자와 20ml 일회용 섬광 튜브, </td><td> VWR </td><td> 66020-326 </td><td></td></tr><tr><td> 프로브 -에서 - 플러스 슬라이드 </td><td> 어부 </td><td> 22-230-900 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 커버 24x50 mm 안경 </td><td> VWR </td><td> 48404-452 </td><td></td></tr><tr><td> 워트 먼지 용지 3mm </td><td> VWR </td><td> 89022-360 </td><td></td></tr><tr><td> 세 유리 요리 한 - 안녕 -nless 철강 슬라이드 선반 </td><td> 전자 Microsocpy 과학 </td><td> 71420-25 </td><td> 두 유리 histoclear 치료에 필요한 걸려, 마지막 하나는 아세트산 무수물 치료에 사용됩니다 </td></tr><tr><td> 18 깨끗한 플라스틱 용기 </td><td> 전자 Microsocpy 과학 </td><td> 71,402 </td><td></td></tr><tr><td> sea​​lable 뚜껑 2 개 또는 3 크고 평평한 플라스틱 상자 </td><td></td><td></td><td> 하이브 리다이 제이션 및 항체 단계에 필요한 </td></tr><tr><td> 좋은 브러쉬 </td><td></td><td></td><td> 왁스 리본을 나눠 도움말 </td></tr><tr><td> 마이크로톰 </td><td></td><td></td><td> Leica </td></tr><tr><td> 셀프 클리닝 드라이 진공 시스템 </td><td> 웨일스 사람 </td><td> 2025 </td><td></td></tr><tr><td> 따뜻한 슬라이드 </td><td> 어부 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 가열 블록 </td><td></td><td></td><td> 60 ° C와 85 ° C에서 필요</td></tr><tr><td> 58-60시 인큐베이터 ° C </td><td> 어부 </td><td></td><td> 용융 Paraplast과 단계 </td></tr><tr><td> 55 ° C와 37 ° C에 대한 오븐이나 물을 욕조 </td><td> 어부 </td><td></td><td> 온도 사이의 빠른 변화로 인해 두 필요 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 (4 ° C - 20 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 퓸 후드 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

몇 십년의 게놈 연구의 발전과 함께, 식물 생물학은 유전자 발현의 대규모 양적 분석을 제시 수많은 연구를 볼 수 있습니다. Microarray 및 차세대 시퀀싱 접근 방식은, 발달, 생리학 및 스트레스 반응 과정을 조사 epigenetic과 작은 RNA 경로를 해부하다, 그리고 1-3 대규모 유전자 규제 네트워크를 구축하는 데 사용되고있다. 이 기술이 대규모 유전자 세트의 동시 분석을 용이하게하는 동안, 그들은 일반적으로 유전자 발현 변화의 매우 제한된 spatiotemporal 해상도를 제공합니다. 이 제한은 부분적으로 lasermicrodissection 또는 4-7를 정렬 형광 - 활성 세포와 함께 방법을 사용하거나 프로 파일링하여 극복할 수 있습니다. 그러나, 완전히 유전자의 생물 학적 역할을 이해하기 위해, 세포 해상도로 표현의 spatiotemporal 패턴에 대한 지식이 필수적입니다. 특히, 개발 또는 환경 STI의 효과를 공부하면muli 및 돌연변이 유전자의 표현 패턴의 상세한 분석이 필수적이 될 수 있습니다. 특정 세포 유형에 표현의 손실 또는 이득과 관련된 경우 예를 들어, 핵심 규제 유전자의 표현 수준에 미묘한 양적 차이가 극적인 phenotypes 발생할 수 있습니다. 여러 가지 방법은 정기적으로 유전자 발현 패턴의 세부 심사에 사용됩니다. 하나는 유전자 변형 기자 라인의 분석을 통해이다. 여러 개의 유전자를 분석하거나 변화에 완강히 저항하는 식물에서 작업할 때 이러한 분석은, 그러나, 시간이 많이 걸리는 될 수 있습니다. 또한, transgene 표현식 패턴이 내생 유전자의를 모방 수 있도록 독립적인 검증은 일반적으로 필요합니다. 현장 하이브 리다이 제이션에 Immunohistochemical 단백질 지방화 또는 mRNA는 세포와 조직 내에서 유전자 발현의 직접적인 시각화에 대한 비교적 빠른 대안을 제시한다. 후자는 쉽게 U 수있는 독특한 장점을 가지고관심의 유전자에 SED. 원위치 하이브 리다이 제이션에 관심의 유전자의 시험 관내 전사에 의해 얻은 프로브 표시 안티 - 감각의 RNA와 하이브리드화하여 세포 표적 mRNAs의 탐지 수 있습니다. 여기 우리는 높은 감도와 구체적인 식물의 유전자 표현의 현장 지방화에 대한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 paraformaldehyde에 고정, 파라핀 - 임베디드 섹션, 조직학 우수 보존을주고 단백질 감지 및 알칼리성 인산 가수 분해 효소 - colorimetric 반응에 의해 시각 아르 발굴 - 분류 프로브와 함께 사용하기위한 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 성공적으로 식물 종의 다양한 조직의 숫자에 적용되었으며, mRNAs뿐만 아니라 작은 RNAs 8-14의 표현을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

<em&gt; 현장에서</em여기에 설명된&gt; 하이브 리다이 제이션 프로토콜은 높은 민감도와 특이성과 세포 수준에서 mRNA 작은 RNA 표현의 직접적인 지역화 가능합니다. 절차는, 파라핀 - 임베디드 식물 조직 섹션에 최적화된 식물과 조직의 다양한 적용, 10 일 이내에 완료될 수 있습니다.

지난 10년간 게놈 연구의 발전과 더불어, 식물 생물학 분야에서는 유전자의 대규모 정량 분석을 제시하는 수많은 연구가 수행되었습니다...

다음 실험의 전반적인 목표는 고감도 및 고특이성으로 세포 수준에서의 mRNA 발현 패턴을 시각화하는 것입니다. 이를 위해 우선 포르말린 고정 및 파라핀 포매된 조직 절편을 일련의 용액에 처리하여 왁스를 제거함으로써 조직을 투과시키고, 배경 신호를 유발할 수 있는 조직 내 양전하를 띤 아미노기를 차단합니다. 그 후, 표적 유전자에 특이적인 DIG 표지 RNA 프로브를 조직 절편에 침투시킨 뒤 슬라이드를 하룻밤 동안 하이브리드화합니다.다음으로, 슬라이드를 RNA로 처리합니다. 섹션에서 비특이적으로 결합된 프로브를 제거한 후, anti-DIG 항체와 함께 배양합니다. 이를 통해 발색 화학 반응으로 하이브리드화된 프로브를 시각화할 수 있습니다.결과는 광학 현미경으로 관찰했을 때, 조직 내에서 목적 유전자가 발현된 세포에서만 특이적으로 진한 파란색 신호가 검출됨을 보여줍니다. R-T-P-C-R, 마이크로어레이 또는 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing)과 같은 다른 발현 분석법과 비교하여 이 기술의 주된 장점은, 여기에서 제시된 In Situ Hybridization 프로토콜이 조직 맥락 내에서 목적 유전자의 발현 패턴을 드러내 준다는 점입니다. 이러한 방법들은 시각적 시연을 통해 학습하는 것이 가장 효과적인 많은 단계들을 포함하고 있습니다.조직의 섹셔닝 및 임베딩 방법과 더불어, 독학으로 익히기 어려운 Al Hybridization pro 프로토콜의 핵심 단계들을 보여드리겠습니다. 파라알데히드로 고정된 조직의 임베딩 방법은 분석하려는 조직의 종류에 따라 달라집니다. 여기서 가장 중요한 점은 향후 섹셔닝을 위해 샘플의 방향을 정확하게 설정하는 것입니다.포매의 한 가지 방법은 플라스틱 몰드와 링을 사용하는 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 60 °C 가열판 위에서 몰드를 예열한 다음 용융 파라핀을 몰드에 붓습니다. 다음으로, 예열된 핀셋을 사용하여 조직 샘플을 각 몰드로 옮기고 원하는 위치로 방향을 잡습니다.몰드를 플레이트에서 벤치로 조심스럽게 옮기고 몰드 위에 흰색 링을 배치하십시오. 몰드와 왁스를 추가로 넣습니다. 섹셔닝을 하기 전, 왁스가 서서히 식어 굳을 때까지 기다리십시오.블록을 실온으로 가온한 후, 시료 주변에 약 1mm의 왁스가 남도록 각 블록을 사다리꼴 모양으로 다듬습니다. 두 평행한 면 중 더 긴 면이 바닥으로 가도록 다듬어진 블록을 마이크로톰 위에 놓습니다. 블록을 칼날 쪽으로 조심스럽게 이동시켜 블록의 표면이 칼날 단면과 평행한지 확인합니다.8~10 µm 두께로 제작합니다. 알루미늄 호일과 같은 비점착성 표면 위에 왁스 리본을 정렬하고, 해부 현미경 하에서 관심 영역을 선택합니다. 그다음, 연필로 prob bon plus 슬라이드에 표시합니다.INI two 하이브리다이제이션 프로토콜 중에 지워질 수 있으므로 마커 위에 펜을 사용하지 마십시오. 각 슬라이드에 깨끗한 milli Q water 1 mL를 분주합니다. 실온에서 관심 있는 절편을 수면에 조심스럽게 띄웁니다.반짝이는 면이 물을 향하게 하십시오. 슬라이드를 슬라이드 워머 위로 천천히 옮깁니다. 온도를 35 to 37 °C로 설정하십시오.일반적으로 사용되는 42°C와 달리 이 온도 범위에서는 절편 아래에 기포가 형성되는 것을 방지할 수 있습니다. 5분 후, 리본이 슬라이드 위로 내려올 수 있도록 한 번의 부드러운 동작으로 물을 조심스럽게 따라냅니다. 조직이 잘 부착되도록 슬라이드를 37°C에서 최소 수 시간 또는 하룻밤 동안 건조하여 조직 절편을 준비합니다.in situ hybridization을 위해, 먼저 최종 탈파라핀화를 위한 탈파라핀 및 재수화 과정을 거칩니다. 슬라이드를 xylene 용액으로 10분씩 두 번 교체하며 침전시킵니다. 조직 절편을 재수화하기 위해, 농도가 점차 낮아지는 일련의 에탄올 용액에 슬라이드를 각각 30초 동안 통과시킵니다.이 비디오에는 표시되지 않은 프로테아제 처리 과정 동안, 0.1 M 트리아민 용액이 담긴 유리 접시를 준비하여 흄 후드 내의 교반기에 설치하십시오. 금속 슬라이드 랙을 용액에 넣기 직전에, 트리아민, 완충액 및 교반액에 1.25 mL의 무수 아세트산을 첨가하십시오. 또한, 슬라이드 랙을 고정하기 위한 클램핑 시스템과 스탠드를 설치하십시오.Starr 클램프의 속도를 줄여 슬라이드 랙을 스탠드에 고정하고, 교반 자석(stir bar)보다 높게 유지하며 랙을 용액 속에 내립니다. PBS로 헹구고 에탄올 시리즈를 통해 다시 탈수시킨 후 10분 동안 천천히 계속 교반합니다. 이제 조직 절편이 하이브리드화(hybridization)를 위한 준비가 되었습니다.슬라이드를 깨끗한 표면에 놓고 5~10분 동안 공기 중에서 완전히 건조시킵니다. 변성된 프로브를 80 µL의 하이브리다이제이션 완충액에 첨가하여 프로브 하이브리다이제이션 완충액 혼합물을 준비합니다. 각 슬라이드에 대해 피펫팅으로 잘 섞어주되, 기포가 생기지 않도록 주의합니다.프로브 하이브리다이제이션 버퍼를 피펫으로 분주합니다. 슬라이드의 오른쪽 가장자리에서 혼합합니다. 하이브리다이제이션 용액이 기포 없이 모든 섹션을 덮도록 확인하며 커버 슬립을 슬라이드 위에 서서히 내립니다.기포가 형성된 부위의 커버 슬립을 손가락으로 가볍게 두드려 모든 조직 절편에서 기포를 제거합니다. 커버 슬립을 잡아당기면 절편이 손상될 수 있으므로 주의하십시오. 슬라이드를 UE water로 적신 watman paper가 들어 있고 param으로 대부분 덮인 습도 챔버에 넣습니다.박스를 단단히 밀봉하고 슬라이드를 원하는 하이브리디제이션 온도(통상 50~55 °C)에서 16~20시간 동안 배양하십시오. 하이브리디제이션 프로토콜이 완료되면 슬라이드에서 커버슬립을 조심스럽게 제거합니다. 슬라이드를 세우면 커버슬립이 자연스럽게 떨어질 수 있으나, 그렇지 않은 경우 커버슬립을 강제로 잡아당기지 마십시오. 이는 절편을 손상시킬 수 있습니다.대신에, 커버 슬립을 제거한 후 슬라이드를 따뜻한 0.2배 SSC에 1~2분간 담가 커버 슬립을 씻어내고, 슬라이드를 랙에 넣어 55 °C의 0.2배 SSC에서 여러 번 세척합니다. RNase 처리 후, 슬라이드를 랙에서 평평한 플라스틱 상자 바닥으로 옮기고 최소량의 블로킹 용액으로 덮습니다. 완만한 진동이 있는 플랫폼 위에서 실온으로 45분 동안 슬라이드를 블로킹합니다.다음으로, 각 슬라이드 위에 항체 용액을 최소량만 직접 도포합니다. 슬라이드를 실온의 암소에서 2~3시간 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 슬라이드를 깨끗한 평평한 상자로 옮기고, 실온의 쉐이킹 플랫폼 위에서 세척 버퍼의 최소량을 사용하여 슬라이드를 4회 세척합니다.슬라이드를 TBS에서 한 번, TN 완충액에서 두 번 헹군 후, 갓 준비한 염색 용액을 슬라이드에 도포합니다. 먼저, 염색 용액을 작은 플라스틱 weighing dish에 붓습니다. 그런 다음, 절편 면이 서로 마주 보게 하여 두 슬라이드를 겹쳐 샌드위치 형태로 만듭니다.샌드위치를 용액에 담가 모세관 현상으로 용액이 흡수되도록 합니다. 슬라이드를 킴와이프로 닦아냅니다. 슬라이드에 염색액을 채웁니다.용액이 흘러 들어갈 때 기포가 생기지 않도록 슬라이드를 다시 가볍게 두드려야 할 수도 있습니다. 슬라이드를 플라스틱 상자에 넣고 실온의 어두운 곳에 보관하십시오. 서로 다른 프로브와 애기장대(arabidopsis) 조직을 사용하여 얻은 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 보라색 신호는 관심 유전자의 발현 패턴을 세포 해상도에서 직접적으로 시각화하여 보여줍니다.패널 A는 영양 줄기 정단부에서 shoot Meli one 전사체의 국소화를 보여줍니다. 분열 조직의 부정정 성장 부위에서는 보라색-푸른색 신호가 나타나며, 주변 잎에서는 신호가 나타나지 않음에 유의하십시오. 패널 B-D는 Arabidopsis의 어뢰기 단계 배아 단면이며, B는 소수의 배아 줄기 세포에서 covata three의 발현을 보여줍니다.C는 표피층에서 T ML one의 발현을 보여주며, D는 무작위 음성 대조군 RNA로 탐색한 절편에서 신호가 나타나지 않음을 보여줍니다. 다음 이미지들은 옥수수 조직에서 서로 다른 프로브를 사용하여 얻은 결과입니다. 패널 E는 발달 중인 옥수수 배아에서 STM Humalog knotted one의 국소화 위치를 보여줍니다.배아 메리스템과 영양 shoot 정단부를 통과하는 뿌리 종단면에서 특히 강한 신호가 나타나며, 패널 F에서는 ARF3A가 축 하단 잎 표면에 발현되고, 패널 G에서는 ATML1 상동체인 OCL4가 표피에 특이적으로 발현됨을 알 수 있습니다. 예상대로 패널 H의 음성 대조군 프로브에서는 하이브리드화 신호가 관찰되지 않았습니다. 프로브의 시험관 내 전사 과정 중 각 단계별 기대 결과가 여기에 제시되어 있습니다. in situ 하이브리드화 프로브는 시험관 내 전사 후, DNAse 처리 및 후속 정제 과정을 거쳐 표준 ARAZ 젤에서 확인되었습니다. 프로브 1과 같이 길이가 250 base pair를 초과하는 프로브의 경우, 사용 전 탄산 가수분해를 거치면 다양한 크기의 더 작은 프로브 단편들이 생성됩니다.이 그림은 100 ng/µL 농도의 대조군 프로브와 새로 DIG 표지된 3종의 프로브를 10⁻¹에서 10⁻⁵까지 희석하여 닷 블롯 분석(dot blot analysis)으로 수행한 색상 및 정량 검정 결과를 보여주며, 이들은 anti-DIG 항체 및 분석 시약과 함께 배양된 전이 막에 점적되었습니다. 분석 결과, 프로브 2의 추정 농도는 100 ng/µL, 프로브 3은 10 ng/µL, 프로브 4는 1 ng/µL로 나타났으며, 이는 프로브 4가 양호한 in situ hybridization 신호를 생성할 가능성이 낮음을 시사합니다. 마지막으로, Mace의 영양 생장 추 정단(vegetative shoot apex)을 가로지르는 이 종단면들은 비특이적 배경 신호와 정상적으로 작동하는 프로브 패널 간의 비교를 제공합니다.A는 비특이적 배경 신호를 보여주는 반면, 패널 B는 외세포층에서 OC five 프로브에 대한 특이적인 in situ 이중 hybridization 신호를 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 in situ hybridization 프로토콜의 까다로운 단계들을 수행하는 방법을 충분히 익혀, 연구 대상 유전자의 정밀한 시공간적 발현 패턴을 결정할 수 있을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

비 - 방사성 현장에서 하이브 리다이 제이션 노르웨이 스프루스에 대한 해당 프로토콜과 식물 종의 범위

이 프로토콜이 성공적으로 양적 척추 종의 여러 조직 유형의 수준과 mRNA의 표현의 공간적 패턴을 감지하는 데 사용됩니다. 방법은 낮은 풍요로움의 성적 증명서를 감지하고 동시에 슬라이드 수백 처리 가능합니다. 우리는 예제와 같은 조류 배아 뇌의 형성의 표현 프로파일을 사용하여이 프로토콜을 제시한다.

방사성 현장에서</em조직에서 다양한 유전자 발현 패턴을 검출> 하이브리드화

여기 우리는 전체 마운트 형광을...

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

제브라 피쉬, 작은 열대어, 척추 발달과 질병 중 유전자 기능 연구를위한 대중적인 모델이되고있다. 표적 유전자의 시간적, 공간적 표현에 의해 결정될...

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

우리는 곤충과 식물 조직에서 바이러스와 박테리아의 현지화 여기 현장 하이브리드 화에 간단한 형광 (FISH) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 전체 산에서의 mRNA의 시각화 및 미세한 부분에 대한 확장 할 수 있습니다.

형광<em&gt; 현장에서</em바이러스 및 식물과 곤충 조직에서 Endosymbiotic 박테리아의 지역화를위한&gt; 혼성화 (FISH)

RNA in situ hybridization (ISH)는 세포와 조직에서 RNA를 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 RNAscope ISH와 면역조직화학 또는 조직학적 염료의 조합을 사용하여 마우스와 인간 뇌 섹션에서 축삭돌기에 국한된 mRNA를 검출하는 방법을 보여줍니다.

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

이 프로토콜은 난치성 식물 조직에 유용한 간단한 Hybrid-Cut 조직 절편 방법을 설명합니다. 양질의 조직 절편은 해부학적 연구 및 현장 교잡(ISH)을 포함한 기타 생물학적 연구를 가능하게 합니다.

하이브리드 컷 : 난 분해성 식물 조직 샘플에 대한 개선 단면 방법

교 잡 프로토콜 설명된 RNA 제자리에 전체 초파리 배아 또는 해 부 조직에서 RNA의 검출을 허용 한다. 96-잘 결정 접시와 tyramide 신호 증폭에 사용 하 여, 성적 감지할 수 있습니다 높은 해상도, 감도, 및 처리량, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

이 원고 붙일 표시 된 DNA 프로브, 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 개별 메신저 RNA (mRNA) 성적표를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH 동시 탐지, 지역화, 고 고정된 개별 셀에 단일 mRNA 분자의 정량화를 허용 하는 시각화 방법입니다.

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

이 비디오는 현장 하이브리드화, 2 개의 다른 유전자의 공간과 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 배아에서 시각 될 수있는 방법 2 색 전체 마운트를 보여줍니다. 이 방법은 원래 데이비드 윌킨슨, 도밍고스 헨리크, 필 잉엄 데이비드 이쉬 - Horowicz에 의해 도입되었다.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

배우세요 파라핀 포매 식물 조직에서 mRNA 발현 패턴을 시각화하는 원위치 하이브리드화 기법을. DIG 표지 RNA 프로브와 색소 반응을 활용하여 세포 수준에서 유전자 발현을 정밀하게 분석하는 방법입니다.

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

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