Name: 2D 및 3D 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 배우세요 신경 전구 세포의 전기장 유도 이동을 2D 및 3D 환경에서 실시간 추적하는 방법을. 맞춤형 전기이동 챔버와 타임랩스 기록을 활용하여 세포 행동을 관찰하고 신경 발달 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 왕립 학회 URF 부여 UF051616, 영국 및 BS에 대한 유럽 연구 협의회 StG 보조금 243,261에 의해 지원되었다. MZ 연구실의 작업은 또한 재생 의료 보조금 RB1-01417의 캘리포니아 공과 대학에서 지원됩니다.

1. 신경 전구 세포 격리 <ol><li> 추운 DMEM/F12 기초 중간에 E14-16 생쥐와 장소에서 전체 뇌를 해부. 35mm 배양 접시에 해부 현미경 및 전송 두뇌 아래의 모든 meninges를 제​​거합니다. </li><li> 기계적 조직 파편에 머리를 해리 및 15 ML 관에게 전송하는 미세 집게를 사용하여 다음 파편을 제거하기 위해 3 분 동안 800 rpm으로 샘플을 원심 분리기. </li><li> DMEM/F12 포함된 bFGF와 EGF를 추가하고 1 ML의 피펫으로 씹다. </li><li> 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. </li><li> 2-5에서 flasks로 플레이트 전지 X 10 4 세포 / ML, 그때 전체 매체가 3 일 통과 세포에게 매 6 일 모든 변경 수행합니다. </li><li> 적어도 5 구절 후에 다이제스트 neurospheres 단일 세포에 트립신과 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 사용하고 poly-D-lysine/laminin-coated electrotactic의 챔버 (2 아래에 설명된대로 준비)에서 성장. , N2 - 보충을 포함하는 성장 매체를 사용하여bFGF와 EGF는 항상 NPCs의 속성을 유지합니다. </li></ol> 2. electrotactic 챔버의 준비 <ol><li> 다이아몬드 펜을 사용하여 반 22 X 22mm 1 호 두께 coverslips을 autoclaved 나누어 유리의 22 X 11mm 스트립을 준비합니다. </li><li> gluing하여 내무부 크기 22 × 10 mm의 자유 서 유리를 만들기 함께 네 세로로 높은 진공 실리콘 기름 22 X 11mm 스트립 서. 완전히 마르도록 우물과 강화가 하룻밤 허용합니다. </li><li> 다음 날, 실리콘 그리스를 사용하는 100mm 문화 요리의 기본에, 10 mm의 간격을두고 서로 평행하게 두 개의 22 X 11mm 유리 스트립을 첨부합니다. 중심에 가장 가까운 것이 22 X 22mm 커버 삼면이 기름과 함께 접시의 바닥에 부착된 각 끝에 슬립,지만을 배치하여 이러한 스트립 사이의 지역을 봉쇄하라. </li><li> 잘 커버로 올라서 2.2에서 준비 유리 장소는 실내 벽이 퍼뜨리고을위한 제한된 공간을 만들 수 있도록 실수할접시의 바닥쪽으로 세포. 실리콘 기름과 방수 모두 관절. 코트 폴리-D-리신 후 laminin과 순차적이 협소한 지역 : 챔버로 한 ML는 폴리-D-라이신을 추가하고 폴리-D-라이신 판의 하단에 바인딩 수 있도록 5 분 동안 떠나, 챔버를 씻어 멸균 PBS로 두 번, 그리고 20 μg / ML을 양보하고 접시의 바닥을 충당하기 위해 사용하는 멸균 PBS에서 laminin을 희석. 하룻밤 동안 실온에 둡니다. </li><li> 다음 날, 추수 세포 및 1 X 104 세포를 포함하는 정지 1 ML을 준비합니다. 완전히 건조 공기와 세포 현탁액 1 ML로 대체할 수 있도록 잘 유리에서 laminin을 제거합니다. 첨부를 허용하기 위해 4 시간 최소 37 ° C에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li><li> 세포가 충분히 합류가되면 챔버에서 모든 매체를 제거합니다. 조심스럽게 잘 유리를 제거합니다. 실리콘 그리스, autoclaved 22 X 22mm 유리 coverslip으로 신중하게 부착하여 세포를 통해 지붕을 형성두 22 X 11mm 스트립 사이에 브리지가. 밖으로 건조하지 않도록 매체의 몇 방울과 세포를 커버. </li><li> 챔버 지붕 위에 접시 한 ​​가장자리에서 다른 실행이 방수 실리콘 그리스 장벽을 만들어 챔버의 각 끝부분에 절연 매체 저수지를 형성하고 있습니다. 흐름을 관통 중간 저수지에서 서로에 대한 확보, 신선한 매체와 챔버를 채우십시오. 세포 회복을 할 수 있도록 12 시간 동안 인큐베이터에 요리를 반환합니다. </li></ol> 3. electrotactic 챔버에 대한 전기장의 응용 <ol><li> 구멍, 마이 그 레이션 챔버의 각 저수지 위에 위치 하나를 뚫는하여 요리를 충당하기 위해 뚜껑을 준비합니다. </li><li> 25 MM HEPES 버퍼를 포함하는 배지와 챔버에있는 모든 매체를 교체하고 온도 제어 영상 시스템으로 요리를 전송합니다. 시간이 경과 및 멀티 포지션 레코딩을위한 실험 매개 변수를 설정합니다. 음극과 양극이되도록 챔버 정렬오른쪽 각각 왼쪽에서 EF 벡터가 실행되도록 수평으로 현미경을 조회 및 이미징 시스템에 기록. </li><li> 스테인 버그의 솔루션 (58 MM NaCl, 0.67 MM KCl, 0.44 MM 칼슘 (NO 3) 2 0.4 H 2 0, 1.3 MM MgSO 4 0.7 H 2 0 및 4.6 밀리미터 Trizma 기지, 산도 7.4)으로 두 비커를 채웁니다. 2퍼센트 (W / 가득 미리 준비된 유리 다리를 (~ 13cm 길이 ~ 3mm 직경 및 분젠 화염에 가열하여 U 자형으로 구부 러 유리 튜브)를 사용하여 각 매체 저수지로 별도의 비커를 연결 뚜껑에있는 구멍을 통과 V) Steinberg's-한천 솔루션. 스테인 버그의 솔루션의 각 비커에 DC 전원 공급 장치에 연결된 자세 / AgCl 전극을 배치하여 전기 회로를 완료합니다. </li><li> 0과에서 전환 전원 공급 장치의 전압을 다이얼을 설정합니다. 전압 측정기를 사용하여 전압을 다이얼을 돌리면서 electrotactic 챔버를 통해 전압을 측정하고, 실험 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다. </li><li> 촬영된 녹화를 시작합니다. 매체 변경을 수행하고 매 시간마다 필요에 따라, 전압을 정리하다. 필요에 따라 신선한 매체, 약물 또는 화학 약품은 저수지에 추가할 수 있습니다. 매체 변경을 수행하면 두 가지 옵션은 다음과 같이 생각할 수 : <ol><li> 옵션 1 호 - 일시적으로 정지 시간 저속도 녹음을 위하여는, 신중하게 커버 뚜껑을 perturbing 피하기 위해 챔버에서 유리 다리를 제거, 신선한 매체와 모든 매체를 대체할 부드럽게 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 유리 다리를 다시 넣어 다음 녹음을 재개하십시오. </li><li> 옵션 2 호는 - 또는, 사용자는 또한 매체 변경 목적으로 사용할 수있는 4 홀 (두 마이 그 레이션 챔버의 각 저수지 위에 위치)로 커버 뚜껑을했다. 유리 교량 연결을위한 두, 다른 두 매체를 변경하기위한. 옵션 2는 매체 변화하는 동안 간섭없이 연속 녹화 가능합니다. </li></ol></li></ol> 4. organotypic 척수 슬라이스의 작성 <ol><li> lumb 해부이주 오래된 C57 BL / 6 생쥐의 AR 척수가 나란히있어. </li><li> McIlwain 조직 헬기와 500 μm의 두께 부분으로 척수 코드를 썰어. </li><li> 별도의 해부 현미경으로 조각하고 그대로 축 / 화살 척수의 구조와 조각을 선택합니다. </li><li> Matrigel 단백질 생산 자체 조립까지 30 μl Matrigel 그리고 그것을 배치를 포함하는 35mm 배양 접시에있는 플레이트 조각 가능한 한 중심가에 가까이하고 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 그들을 유지 척수의 단면의 표면을 커버 박막. 그것은 완전히 다른 30 ​​분 필요한 경우에 대해 37 ° C에서 페트리 접시를 품어 Matrigel이 조립되어 있는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. </li><li> 슬라이스에 직접 매체 흐름을 피하기 위해 25 밀리미터 HEPES 버퍼와 매우 부드럽게하므로 같은 15-20% 소태아 혈청을 포함하는 4-6 ML DMEM/F-12 매체를 추가하십시오. 슬라이스가 완전히 잘 노출 explants의 표면을두고, 중간에 빠져들되지 않았음을 확인공기. 주 2 회 매체를 변경합니다. </li></ol> 5. organotypic 척수의 슬라이스에 Hoechst 33342로 분류 NPCs의 분사 <ol><li> 하나의 NPC 서스펜션 × 10 6 세포 / μl를 준비합니다. </li><li> 30 분 5 μm의 Hoechst 33342와 함께 중간에 세포 현탁액을 사전 품어. </li><li> 현미경으로 천천히 척수의 슬라이스로 정지 2 μl를 microinject하는 모세관 유리관을 사용합니다. 모세 유리관이 matrigel (현미경 빨간 부분)을 통과하고 척수의 단면 (현미경 회색 조직)의 내부에 도달했는지 확인, 달려든 세포 현탁액을 피하기 위해 최소 30 초 동안 척수 슬라이스 안에 남아 있습니다. 인큐베이터로 척수의 슬라이스를 포함하는 배양 접시 (37 ° C에서 5 % CO 2)를 넣고 하룻밤 동안 그것을 두십시오. </li><li> 다음날, (에 설명된 방법을 사용 electrotactic 챔버에 33,342-라벨 NPCs Hoechst를 포함한 척수 슬라이스 500 MV / mm의 EF를 적용3). </li></ol> 6. 대표 결과 NPCs들은 음극쪽으로 높은 감독 셀 마이 그 레이션 (그림 1)을 보였다 생리 EFS의 범위에 노출되었을 때. 동일한 관측도 organotypic 척수의 슬라이스 전직의 생체내 모델, 생체내 조건에서 3D 환경 흉내낸 (그림 2)에서 단일 세포 수준에서 만들어졌습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 1 그림. NPCs은 EFS의 감독이 마이 그 레이션을 보여줍니다. EFS에 노출되면 PC는 음극쪽으로 높은 감독이 마이 그 레이션을 보여줬, 빨간색 라인과 파란색 화살표는 세포 운동의 궤도와 방향 (A) 나타냅니다. B는 NPCs의 마이 그 레이션 경로를 보여줍니다. 바 : 50 μm의. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 이식 NPCs는 organotypic 척수의 단면에서 음극쪽으로 이동 마이 그 레이션을 보여

<ol><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+with+electric+potential%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Wound healing with electric potential.</a> N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).</li>
<li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+behavior+electrically%3A+current+views+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling cell behavior electrically: current views and future potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).</li>
<li>Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+and+persistent+electrical+currents+enter+the+transected+lamprey+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord.</a> PNAS. 77, 1209-1209 (1980).</li>
<li>Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+field+stimulation+for+complete+spinal+cord+injury+in+humans%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg.+Spine%22%5BJournal%5D)">Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial.</a> J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).</li>
<li>Zhao, M., Song, B., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-gamma+and+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN.</a> Nature. 442, 457-457 (2006).</li>
<li>Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+applied+electric+fields+guide+migration+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons.</a> J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).</li>
<li>Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-current+electrical+field+guides+neuronal+stem%2Fprogenitor+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).</li>
<li>Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).</li>
<li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Song, B., Gu, Y., Pu, j <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

우리가 사용하는 프로토콜은 이전 연구 5,11에 바탕을두고 있습니다. 표준화와 정확한 차원 맞춤 디자인 electrotactic의 실에서 배양해 세포 또는 조각으로 한천 교량, 스테인 버그의 솔루션 및 자세 / AgCl 전극를 통해 EF을 적용하는 동안 이러한 방법을 사용하여 안정적인 문화와 전류 조건이 유지됩니다. 챔버의 깊이는 다른 예제는 11 두께에 대한 수용하도록 조정될 수 있으며, 세포의 경우, 챔버 크기는하지만 많은 세포 (예 : 서양 얼룩 분석은 많은 세포가 필요합니다) 필요한 수용하도록 수정할 수 있습니다. 우리는 단일 세포 수준에서 촬영된 기록을 사용하여 생체내에서 세포를 추적할 기술적으로 가능하지 않습니다 절차를 허용하도록 이러한 방법을 수정하고 개발했습니다. EFS에 대한 세포 반응에 관한 이전 연구의 대부분은, 2D 환경에서 실시되었습니다. 단일 세포 수준에서 NPCs의 electrotactic 응답의 생체내 연구어떤 생리적 관련성을 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> FGF-기본적인 재조합 인간 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td><td> 20 NG / ML </td></tr><tr><td> EGF 재조합 인간 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0311 </td><td> 20 NG / ML </td></tr><tr><td> N2 - 보충 (100X) 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 02,048 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 매체 (높은 혈당) </td><td> Invitrogen </td><td> 31330-095 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리-D-라이신 </td><td> Millipore </td><td> -003-E </td><td></td></tr><tr><td> 자연 마우스 Laminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> 성장 요인은 지하 분리막 매트릭스 (Matrigel)을 감소 </td><td> BD Biosciences </TD&gt; <td> 354,230 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 버퍼 </td><td> Gibco </td><td> 15,630 </td><td></td></tr><tr><td> McIlwain 조직 헬기 </td><td> Mickle 연구소 엔지니어링 주식 회사 </td><td> TC752-PD </td><td></td></tr><tr><td> 다우 코닝 높은 진공 실리콘 그리스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> Z273554 </td><td></td></tr></tbody></table>

2d 및 3d 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

내생 전기 분야 (EFS)는 생체내 자연적으로 발생하며 중추 신경계의 1,2의 것을 포함한 조직 / 기관이 개발하고 재생하는 동안 중요한 역할을 재생합니다. 이러한 내생 EFS는 세포와 조직의 전기 저항과 결합 이온 수송의 셀룰러 규정에 의해 생성됩니다. 이것은 적용된 EF 치료는 동물과 인간 3,4의 척수 부상의 기능 복구를 홍보할 수 있다고보고되었습니다. 특히, EF의 감독의 세포 이주는 신경 전구 세포 (NPCs) 7,8 포함한 세포 유형 5,6의 다양한에서 입증되었습니다. 직류 (DC) EFS의 응용은 대부분의 실험실에서 일반적으로 사용 가능한 기법이 아닙니다. 우리는 세포와 조직 문화를 이전 5,11에 직류 EFS의 응용 프로그램에 대한 자세한 절차를 설명했습니다. 여기 2D를 설정하는 계산 필드 강도를 기반 표준 방식의 비디오 데모를 소개합니다NPCs에 대한 D 3D 환경, 그리고 2D에서 단일 세포 성장 조건에서 EF의 자극, 그리고 3D에서 organotypic 척수의 슬라이스에 세포 반응을 조사합니다. 척추 cordslice는 cytoarchitectonic 조직 조직도 이러한 문화 9,10 내에 보존되기 때문에 전직 NPC의 생체내 행동, 사후 이식을 공부하는 데 이상적인받는 조직이다. 또한이 전 생체내 모델은 또한 단일 세포 수준에서 촬영된 기록을 사용하여 생체내에서 세포를 추적할 기술적으로 가능하지 않습니다 수속을하실 수 있습니다. 그것은 비판적으로 2 차원 환경뿐만 아니라에서 셀 행동을 평가하는 것이 필수적뿐만 아니라 생체내 환경에서 mimicks 3D organotypic 상태입니다. 이 시스템은 수 체외 및 생체내 전직의 단세포 이주의 3D 추적과 조직 또는 장기의 문화에 커버 유리 기반 요리를 사용하고 월이면쪽으로 이동하기 전에 중간 단계가 될 수 고해상도 이미징조종의 패러다임.

이 프로토콜은 세포를 추적할 수 있습니다 맞춤 디자인 electrotactic의 실에서 2D 및 3D 환경을 설정하는 데 사용 방법을 보여줍니다<em&gt; 생체내 / 전직 생체내에</em&gt; 전류 (DC) 전기 분야 (EFS)를 지시하는 galvanotaxis / electrotaxis 및 기타 세포 반응을 조사하기 위해, 단일 세포 수준에서 촬영된 녹화를 사용합니다.

2D 및 3D 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션

내인성 전기장(EFs)은 생체 내에서 자연적으로 발생하며, ...를 포함한 조직 및 기관의 발달과 재생 과정에서 중요한 역할을 합니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 2D 배양 및 3D ex vivo 모델에서 인가된 전기장이 신경 전구 세포의 이동에 미치는 영향을 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 in vitro에서 신경 전구 세포를 분리하고 증식시킵니다. 두 번째 단계는 신경 전구 세포의 단일 세포 현탁액을 준비하는 것입니다.다음으로, 2D 배양 준비를 위해 신경 전구 세포를 맞춤 설계된 전기 촉진 챔버에 도말합니다. 또는 3D ex vivo 모델 준비를 위해 신경 전구 세포를 hooks 3, 3, 3, 4, 2로 표지하고 척수 절편 기관 유사 모델에 주입합니다. 최종적으로, 전기 챔버에 전기장을 가하고 타임랩스 기록을 수행하여 2D 및 3D 환경 모두에서 전구 세포가 전기장의 음극 방향으로 이동함을 보여줍니다.이 기술의 주요 장점은 자연 환경과 매우 유사한 3D 장기모사 모델에 이식된 개별 세포의 전기장 유도 이동을 실시간으로 추적할 수 있는 새로운 방법을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 척수 슬라이스에 이식된 신경교 세포의 이동과 같은 전기적 기술에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 소형 뇌 슬라이스 모델과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 22 by 22 millimeter 크기의 오토클레이브 유리판을 나누어 22 by 11 millimeter 크기의 유리 스트립을 준비하십시오.다이아몬드 펜을 사용하여 1번 두께의 커버 슬립을 절반으로 자릅니다. 다음으로, 22 x 11 mm 크기의 스트립 4개를 고진공 실리콘 그리스로 수직으로 접착하여 내부 치수가 22 x 10 mm인 독립형 유리 웰을 제작하고, 웰이 하룻밤 동안 완전히 건조 및 경화되도록 둡니다. 다음 날, 실리콘 그리스를 사용하여 22 x 11 mm 유리 스트립 2개를 10 mm 간격을 두고 서로 평행하게 100 mm 배양 접시 바닥에 부착합니다.그런 다음 실리콘 그리스를 사용하여 22 by 22 millimeter 커버슬립을 부착함으로써 이 스트립들 사이의 영역을 밀봉합니다. 유리 웰을 커버슬립 위에 배치하여 내부 벽이 세포 파종을 위한 밀폐된 공간을 형성하도록 합니다. 모든 접합부를 실리콘 그리스로 방수 처리합니다.동반된 원고에 기술된 대로, 이 제한된 영역을 poly-D-lysine으로 순차적으로 코팅한 후 laminin을 코팅합니다. 이 절차에서는 E 14에서 E 16 마우스의 뇌를 적출하여 차가운 D-M-E-M-F 12 기본 배지에 넣습니다. 다음으로, 해부 현미경 하에서 뇌막을 제거합니다.그 후, 뇌 조직을 35mm 페트리 접시에 옮깁니다. 미세 핀셋을 사용하여 뇌 조직을 조직 조각으로 분리합니다. 그런 다음, 분리된 조직을 15mL 원심분리관으로 옮깁니다.D 잔해를 제거하기 위해 샘플을 800 RPM에서 3분 동안 원심 분리합니다. 다음으로, BFDF와 DGF가 포함된 A-D-M-E-M-F 12를 샘플에 첨가합니다. 1mL 피펫을 사용하여 이를 트라이툴레이션(tritration)합니다.그 다음 셀 스트레이너를 사용하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 플라스크에 ml당 20,000~50,000개의 세포가 되도록 분주합니다. 이후 3일마다 전체 배지 교체를 수행하며, 이때 세포를 1,300 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고, 신선한 배지에 PT를 현탁한 후, 최소 5회 이상 매 6일마다 세포를 플라스크로 되돌려줍니다. NEUROSPHERES를 15 mL 튜브로 옮겨 1,500 RPM에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거합니다.펠릿을 trips in EDTA에 재현탁하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 세포 수를 측정하기 전, 10,000개의 세포를 포함하는 1mL의 현탁액을 준비합니다. 그 다음, 유리 웰에서 라미닌을 제거하고 완전히 건조시킵니다.이를 1 mL의 세포 현탁액으로 교체합니다. 그 후, 세포가 부착될 수 있도록 배양 접시를 37 °C 인큐베이터에 최소 4시간 동안 둡니다. 세포가 충분히 합쳐지면(confluent), 챔버에서 배지를 제거합니다.유리를 조심스럽게 제거합니다. 그다음, 실리콘 그리스를 사용하여 22 by 11 millimeter 스트립 2개 사이에 오토클레이브 처리된 22 by 22 millimeter 유리 커버슬립을 조심스럽게 부착하여 세포 위에 지붕을 형성합니다. 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해 배지를 몇 방울 떨어뜨려 세포를 덮어주어야 함을 기억하십시오.그 다음, 배양 접시의 한쪽 끝에서 반대쪽 끝까지 두 개의 수밀성 실리콘 그리스 차단벽을 만들어 챔버의 양 끝에 독립된 배지 저장소를 형성합니다. 챔버를 신선한 배지로 채워 한쪽 배지 저장소에서 다른 쪽 저장소로 흐름이 이어지도록 합니다. 이후, 세포 회복을 위해 배양 접시를 인큐베이터에 넣고 12시간 동안 배양합니다.다음 단계로, 마이그레이션 챔버의 각 리저버(reservoir) 위에 구멍이 오도록 두 개의 구멍을 뚫어 디쉬를 덮을 뚜껑을 준비합니다. 그 다음, 챔버 내의 배지를 25 mM HEPES 버퍼가 포함된 배양 배지로 교체합니다. 이후, 디쉬를 온도 제어 이미징 시스템으로 옮깁니다.타임랩스 및 다중 위치 기록을 위한 실험 파라미터를 설정합니다. 현미경으로 관찰하고 이미징 시스템으로 기록할 때 전기장 벡터가 수평으로 형성되도록, 음극과 양극이 각각 왼쪽과 오른쪽에 오도록 챔버를 정렬합니다. 다음으로, 비커 두 개를 채웁니다.Steinberg 용액을 준비합니다. 미리 준비한 2% Steinberg 한천 용액이 채워진 유리 브리지를 사용하여 각 배지 저장조에 별도의 비커를 연결합니다. 그런 다음 DC 전원 공급 장치에 연결된 은 전극을 Steinberg 용액에 넣습니다.각 비커에서 전원 공급 장치의 전압 다이얼을 0으로 맞춘 후 전원을 켭니다. 전압 다이얼을 올리면서 전압계로 전기 촉진 챔버 양단의 전압을 측정합니다. 그런 다음 실험 요구 사항에 맞게 전압을 조정합니다.그 후, 타임랩스 녹화를 시작하십시오. 배지를 교체하고 필요에 따라 전압을 다시 조정하십시오. 매시간 필요에 따라 신선한 배지, 약물 또는 화학제를 저장조에 추가할 수 있습니다.배양 접시 뚜껑에 각 배지 저장소 위에 위치하도록 추가로 뚫은 구멍들을 사용합니다. 이 단계에서는 2주 된 생쥐의 요추 척수를 적출합니다. 그 후 해부 현미경 하에서 machel wane 조직 절단기를 사용하여 척수를 500 micron 두께의 절편으로 자릅니다.절편들을 분리하고 시상-축상 척수 구조가 온전한 것을 선택합니다. 그다음 30 µL의 MA gel이 담긴 100 millimeter 페트리 접시에 절편들을 배치합니다. 가능한 한 중심에 가깝게 배치하십시오.이들을 37°C의 5% 이산화 탄소 배양기에서 최소 30분 동안 배양합니다. Matrigel 단백질이 자기 조립되어 척수 절편의 표면을 덮는 얇은 막을 형성하려면, Matrigel이 완전히 조립되는 것이 매우 중요합니다. 필요한 경우 페트리 접시를 37°C에서 30분 더 배양한 후, 25 mM HEPES 완충액과 15~20% 태아 송아지 혈청이 함유된 4~6 mL의 DMEM/F-12 배지를 첨가합니다.배지가 슬라이스 위로 직접 흐르지 않도록 매우 조심스럽게 처리하며, 슬라이스가 배지에 완전히 잠기지 않아 가지 표면이 공기에 충분히 노출되도록 합니다. 배지는 일주일에 두 번 교체합니다. 이제 신경 전구세포 현탁액을 5 µM hooks가 포함된 배지에서 배양합니다.3, 3, 3, 4, 2로 30분 동안 처리합니다. 현미경 하에서 모세관 유리 튜브를 사용하여 2 µL의 현탁액을 척수 절편에 미세 주입합니다. 모세관 유리 튜브가 매트리젤을 통과하여 척수 절편 내부까지 도달하도록 천천히 주입하십시오.세포 현탁액이 생기는 것을 방지하기 위해 유리관을 척수 절편 내부에 최소 30초 동안 유지하십시오. 이후 척수 절편이 담긴 페트리 접시를 37 °C, 5% CO2 조건의 배양기에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 500 mV/mm의 전기장을 가하기 전, 3 3 3 4 2로 표지된 신경 발생 세포가 포함된 척수 절편 주변에 전기 유도 챔버를 구축하십시오.여기서 신경 전구 세포는 전기장에 노출되었을 때 음극을 향해 매우 지향적인 이동을 보이며, 빨간색 선과 파란색 화살표는 각각 세포 이동의 궤적과 방향을 나타냅니다. 그리고 여기 이동 경로를 나타낸 도표가 있습니다. 여기에는 hooks 3 3, 3, 4 2로 라벨링된 신경 전구 세포들이 있습니다.이들은 전기장 처리 시작 시점에 기관형 척수 절편으로 이식되었습니다. 신경 전구 세포가 음극 방향으로 2.5시간 동안 방향성 이동을 한 후, 전기장의 극성을 반전시켰습니다. 전기장 극성의 변경은 새로운 음극을 향한 축삭의 급격한 방향 전환을 유도하였습니다.여기 척수 절편 내에 이식된 신경 전구세포의 이미지입니다. 타임랩스 기록 종료 후, 척수 절편 내에 이식된 신경 전구세포의 3D 재구성 모습이 여기에 나타나 있습니다. 질량 숙달 완료.이 기술은 적절하게 개발된 이후, 올바르게 수행한다면 2주 안에 완료될 수 있습니다. 이 기술은 이제 세포 생물학 분야의 연구자들이 전기장에 반응하는 신경 전구 세포의 이동을 2D 및 3D 배양 시스템에서 탐구하고 적용할 수 있는 길을 열어줍니다.

electric-field-controlled-directed-migration-neural-progenitor-cells

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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