2D 및 3D 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션

이 절차의 전반적인 목표는 2D 배양 및 3D 생체 외 모델에서 신경 전구 세포 이동에 대한 적용된 전기장의 영향을 기록하는 것입니다. 이는 먼저 체외에서 뉴런 신경전구세포를 분리하고 확장함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 신경전구세포의 단세포 현탁액을 준비하는 것입니다.

다음으로, 2D 배양 준비를 위해 신경 전구 세포는 맞춤형으로 설계된 전기 전술 챔버에 도금됩니다. 또는 3D 체외 모델 준비를 위해 신경전구세포를 후크 3, 3, 3, 4, 2로 표지하고 척수 절편 유기형 모델에 주입합니다. 궁극적으로 전기장이 전기 챔버에 적용되고 저속 촬영이 수행되어 전구 세포가 2D 및 3D 환경 모두에서 전기장의 음극을 향해 이동하는 것을 보여줍니다.

이 기술의 주요 장점은 자연 환경과 매우 유사한 3D 유기형 모델로 이식 후 개별 세포의 전기장 유도 이동을 실시간으로 추적하는 새로운 방법을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 전기 기술에 삽입, 척수 슬라이스에 이식 된 신경 엔탈 세포의 이동을 제공 할뿐만 아니라 뇌 슬라이스 모델로 작은 다른 시스템에도 적용 할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 오토 클레이브 22 x 22 밀리미터를 나누어 22 x 11 밀리미터 유리 스트립을 준비하십시오.

두께 1위의 커버는 다이아몬드 펜을 사용하여 반으로 미끄러집니다. 다음으로, 4 개의 수직으로 접착하여 22 x 10 밀리미터의 독립형 유리 우물을 만들고 고진공 실리콘 그리스와 함께 22 x 11 밀리미터 스트립을 세우고 우물이 밤새 완전히 건조되고 굳어지도록합니다. 다음날, 22 x 11mm 유리 스트립 2개를 서로 평행하게 부착하고 실리콘 그리스를 사용하여 100mm 배양 접시 바닥에 10mm의 간격을 둡니다.

그런 다음 실리콘 그리스로 22 x 22mm 커버 슬립을 부착하여 이 스트립 사이의 영역을 밀봉합니다. 유리 덮개를 덮개 슬립에 잘 놓아 내부 벽이 세포를 파종하기 위한 제한된 공간을 만들도록 합니다. 모든 조인트를 실리콘 그리스로 방수하십시오.

이 제한된 부위를 poly de lycine으로 순차적으로 코팅한 다음 첨부된 원고에 설명된 대로 laminin을 코팅합니다. 이 절차에서 E 14에서 E 16 마우스의 뇌를 얻어 차가운 D-M-E-M-F 12 기저 배지에 놓습니다. 다음으로, 해부학적 현미경으로 수막을 제거합니다.

그런 다음 뇌를 35mm 페트리 접시에 옮긴다. 가는 집게를 사용하여 뇌를 조직 조각으로 분리하십시오. 그런 다음 15ml 튜브 원심분리기로 옮깁니다.

D 파편을 제거하기 위해 3분 동안 800RPM에서 샘플. 다음으로, BFDF 및 DGF를 포함하는 A-D-M-E-M-F 12를 샘플에 넣는다. Tritrate는 1 밀리리터 피펫으로 그들을 먹었습니다.

그런 다음 세포 스트레이너로 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 세포를 20, 000에서 50, 밀리리터 당 000 세포로 플라스크에 저장하십시오. 그런 다음 3일마다 5분 동안 1, 300RPM으로 세포를 원심분리하는 전체 매체 변경을 수행합니다.

supinate Resus를 버리고, 새로운 배지에 PT를 현탁시키고, 적어도 5일 후에 6일마다 세포를 플라스크에 되돌려 놓는다. NEUROSPHERES를 15, 1rpm에서 500분 동안 500밀리리터 튜브 원심분리기로 옮깁니다. supinate를 버리십시오.

단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 EDTA의 트립에서 펠릿을 다시 현탁합니다. 세포 조사를 실행하기 전에, 10, 000의 세포를 포함하는 현탁액의 1 밀리리터를 준비하십시오. 그런 다음 유리 웰에서 라미닌을 제거하고 완전히 건조시킵니다.

1ml의 세포 현탁액으로 교체하십시오. 그런 다음 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 최소 4시간 동안 넣어 부착할 수 있도록 합니다. 세포가 충분히 cofluent가 되면 챔버에서 배지를 제거합니다.

유리를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 실리콘 그리스로 2, 22 x 11mm 스트립 사이에 22 x 22mm 유리 커버 슬립을 조심스럽게 부착하여 셀 위에 지붕을 형성합니다. 건조를 방지하기 위해 배지 몇 방울로 세포를 덮는 것을 잊지 마십시오.

그런 다음 접시의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 이어지는 두 개의 방수 실리콘 그리스 장벽을 만들어 챔버의 양쪽 끝에 격리된 매체 저장소를 형성합니다. 챔버를 새로운 매체로 채우고 한 매체 저장소에서 다른 매체 저장소로 흐름이 흐르도록 합니다. 그런 다음 세포가 회복될 수 있도록 접시를 12시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.

다음 단계에서는 마이그레이션 챔버의 각 저장소 위에 하나씩 두 개의 구멍을 뚫어 접시를 덮을 뚜껑을 준비합니다. 그런 다음 챔버의 배지를 25mm 히피 버퍼를 함유한 배양 배지로 교체합니다. 그런 다음 접시를 온도 제어 이미징 시스템으로 옮깁니다.

타임랩스 및 다중 위치 기록에 대한 실험 매개변수를 설정합니다. 음극과 양극이 각각 왼쪽과 오른쪽에 있도록 챔버를 정렬하여 전기장 벡터가 현미경으로 보고 이미징 시스템에 기록된 것처럼 수평으로 실행되도록 합니다. 다음으로 두 개의 비커를 채웁니다.

Steinberg의 솔루션으로. 2% Steinberg의 한천 용액으로 채워진 사전 준비된 유리 브리지를 사용하여 각 매체 저장소에 별도의 비커를 연결합니다. 그런 다음 DC 전원 공급 장치에 연결된 은색 전극을 Steinberg 솔루션에 배치합니다.

각 비커에서 전압 다이얼을 전원 공급 장치의 0으로 설정하고 켭니다. 전압 다이얼을 올리면서 전압 미터로 전기 전술 챔버의 전압을 측정합니다. 그런 다음 실험 요구 사항에 맞게 전압을 조정하십시오.

그런 다음 타임랩스 녹화를 시작합니다. 매체 변경을 수행하고 필요에 따라 전압을 다시 조정합니다. 매시간 필요에 따라 신선, 중간 약물 또는 화학 작용제를 저장소에 추가할 수 있습니다.

배양 접시 뚜껑에 뚫린 추가 구멍을 사용하여 각 매체 저장소에 하나씩 위치합니다. 이 단계에서는 2주 된 생쥐의 요추 척수를 해부합니다. 그런 다음 해부학 현미경으로 마첼 웨인 조직 절단기를 사용하여 척수를 500미크론 두께의 부분으로 자릅니다.

슬라이스를 분리하고 손상되지 않은 시상 축 척수 구조가 있는 슬라이스를 선택합니다. 다음으로 30마이크로리터 MA 젤이 들어 있는 100mm 페트리 접시에 슬라이스를 담습니다. 가능한 한 중앙에 가깝게 배치하십시오.

섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 최소 30분 동안 유지하십시오. 마트리 겔 단백질이 스스로 조립되어 척수 절편의 표면을 덮는 얇은 필름을 만들기 위해서는 마트리 겔이 완전히 조립되는 것이 매우 중요합니다. 필요한 경우 페트리 접시를 섭씨 37도에서 30분 더 배양한 다음 25밀리몰 heis 완충액과 15-20%의 태아 송아지 혈청을 포함하는 D-M-E-M-F 12 배지 4-6ml를 추가합니다.

중간 흐름이 조각에 직접 전달되지 않도록 매우 부드럽게 조각이 매체에 완전히 잠기지 않도록 하여 가지 표면이 공기에 잘 노출되지 않도록 하십시오. 매체를 일주일에 두 번 바꾸세요. 이제 5개의 마이크로몰 후크로 배지에서 신경전구세포 현탁액을 배양합니다.

3, 3, 3, 4, 2 30분 동안. 현미경으로 모세관 유리관을 사용하여 2마이크로리터의 현탁액을 척수 절편에 마이크로 주입합니다. 모세관 유리관이 모트리겔을 통과하여 척수 절편 내부에 도달하는지 천천히 확인합니다.

세포 현탁을 방지하기 위해 최소 30초 동안 척수 슬라이스 내부에 유리관을 유지하십시오. 달려가서 척수 조각이 들어있는 페트리 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 밤새 5센트의 이산화탄소를 넣습니다. 다음 날, 척수 슬라이스 주위에 고리 3 3 3 4 2 표지된 신경 발생 세포가 포함된 전기 전술 챔버를 구축한 후 밀리미터당 500밀리볼트의 전기장을 가합니다.

여기서 신경전구세포는 전기장에 노출될 때 음극을 향한 고도의 이동을 보여주며, 빨간색 선과 파란색 화살표는 각각 세포의 이동 궤적과 방향을 나타냅니다. 다음은 표시된 마이그레이션 경로의 플롯입니다. 다음은 후크 3, 3, 3, 4, 2로 표시된 신경 전구 세포입니다.

그들은 전기장 치료의 시작점에서 유기형 척수 절편에 이식되었습니다. 신경전구세포가 2.5시간 동안 음극을 향해 방향으로 이동한 후, 전기장의 극성이 역전되었습니다. 전기장 극성의 변화는 새로운 음극을 향한 axxis의 급격한 반전을 촉발했습니다.

다음은 척수 절편 내에 이식된 신경전구세포의 이미지입니다. 타임 랩스 기록의 끝부분과 척수 슬라이스 내에 이식된 신경전구세포의 3D 재구성이 여기에 표시됩니다. 대량 마스터.

이 기술은 개발 후 적절하게 수행되면 2 주 안에 완료 할 수 있습니다. 이 기술은 이제 세포 생물학 분야의 연구자들이 2D 및 3D 배양 시스템에서 신경 전구 세포의 이동을 탐구하고 전기장에 적용할 수 있는 길을 열었습니다.