손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

이 절차의 전반적인 목표는 특정 세포 유형에서만 형광 마커를 발현하는 마우스 라인을 사용하여, 온전한 망막 내 단일 뉴런의 빛 반응과 형태를 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 안구를 해부하여 망막을 분리합니다. 그 다음 단계로, 망막을 레이저 스캐닝 현미경 아래에 두고 이광자 적외선 여기를 통해 세포를 시각화합니다.

그 다음 마이크로 피펫을 사용하여 기록 및 염료 충전을 위한 whole cell patch clamp 구성을 수행합니다. 최종적으로, 이 준비 과정을 통해 광자극에 대한 세포 반응을 기록할 수 있으며, 공초점 현미경을 통해 기록된 세포의 형태를 확인할 수 있습니다. 망막에서의 무유도(unguided) patch clamp 기록과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 여기광으로 망막을 자극하지 않고도 형광 표지된 세포를 시각적으로 지향하여 기록할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 특정 세포군이 시각 정보 처리에 기여하는 바는 무엇인가와 같이 망막 연구의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이는 해당 세포군의 밀도가 낮고 식별을 용이하게 하는 뚜렷한 형태학적 특징이 없는 경우에도 가능합니다. 실험 전, 마우스를 최소 3시간 동안 암적응시켜 실험을 시작하십시오.

그동안 동봉된 원고에 설명된 대로 세포외 용액을 준비하고, 실온에서 카보젠(carbogen)으로 버블링합니다. 다음으로, 마우스를 희생시키고 곡선형 홍채 가위를 사용하여 안구를 적출합니다. 적출한 안구를 세포외 용액이 담긴 디쉬로 옮깁니다.

그런 다음 이를 실체 현미경 아래에 두고 스프링 가위를 사용합니다. 오라 세라타(ora serrata)를 따라 안구를 절개하여 각막과 모양체를 제거합니다. 수정체를 꺼내고 망막을 색소 상피로부터 조심스럽게 분리합니다.

그 후, 망막과 색소 상피 사이의 시신경을 절단합니다. 안구 컵에서 망막을 제거합니다. 말려 있는 망막의 안쪽이 신경절 세포 측임을 유의하십시오.

바깥쪽이 광수용체 쪽입니다. 이어서, 나무 이쑤시개를 사용하여 안쪽 망막 표면의 유리체를 조심스럽게 당겨 제거합니다. 그런 다음, 조직을 평평하게 펴기 위해 망막 주변부를 따라 짧게 절개합니다.

다음으로, 광수용체 쪽이 아래로 향하게 하여 망막을 기록 챔버로 옮깁니다. 미세 붓을 사용하여 망막을 유리 바닥에 펼치고, 스테인리스 스틸로 된 나일론 끈 프레임으로 고정합니다. 기록 챔버를 정립형 레이저 주사 현미경 아래의 암실에 배치합니다.

망막 표본에 5 mL/min 이상의 속도로 지속적으로 슈퍼 퓨즈(super fuse)하십시오. 35 °C로 가열된 산소 공급 extracellular solution을 사용하며, 현미경은 패러데이 케이지 내의 충격 흡수 에어 테이블 위에 배치합니다. 전자 차폐를 위해 케이지를 불투명한 커튼으로 덮어 표본을 암실 상태로 유지하십시오.

또한 적색 투명 필름을 사용하여 컴퓨터 모니터에서 나오는 빛을 차단합니다. 적외선 레이저를 850에서 870 nm 또는 그 이상의 긴 파장으로 조정하십시오. 모드 잠금 상태로 전환하고 이광자 여기를 사용하여 GFP 발현 세포를 시각화합니다.

패치 클램프 기록을 위해, 함께 제공된 원고에 설명된 대로 형광 프로브가 포함된 세포 내 용액을 붕규산 유리 마이크로 피펫에 채웁니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 홀더에 삽입합니다. 기준 전극이 기록 챔버 내의 세포 외 용액과 접촉하고 있는지 확인하십시오.

다음으로, 40배 수침 대물렌즈를 사용하여 마이크로 피펫으로 A GFP 발현 세포에 압력을 가합니다. Omicron 세포체는 신경절 세포층뿐만 아니라 내핵층 근위부에 위치하므로, 마이크로 피펫이 표적 세포와 접촉하기 전에 망막 표면의 내경계막을 관통해야 합니다. 성공적인 관통 여부는 마이크로 피펫 팁에서 세포 내 용액이 밀려 나오고, 내경계막이 하부 망막 조직으로부터 분리되는 것으로 확인할 수 있습니다. 세포 내 용액에 포함된 형광 염료를 통해 원하는 세포에 접근하는 동안 이광자 이미지에서 마이크로 피펫의 위치를 확인할 수 있습니다.

그런 다음 마이크로 피펫의 압력을 해제하여 whole cell patch clamp 구성을 형성합니다. current clamp 모드에서 유효한 기록은 -50에서 -55 mV의 막전위를 나타내어야 하며, 최소 20분 동안 유지되어야 합니다. 그 후, 컴퓨터 모니터로 제작된 시각 자극을 제시합니다.

빔 경로에 중성 밀도 필터를 삽입하여 자극 강도를 조정하고, 자극의 공간적 위치를 기록 중인 세포의 중심으로 맞춥니다. 그다음, 자극 프로토콜을 시작하고 빛 응답을 기록합니다. 자극 발생기를 사용하여 기록 소프트웨어를 트리거하십시오.

자극 타이밍을 기록하기 위해 빔 경로 내에 포토다이오드를 포함시키십시오. 마이크로 피펫을 회수할 때 세포체가 함께 끌려 나오지 않도록 주의하십시오. 염색약 충전이 완료되면, 형광 제제가 기록된 세포 내로 30분에서 45분 동안 확산되도록 둡니다.

다음은 프로모터 하에서 GFP를 발현하는 망막 평면 표본의 세포 예시입니다. 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase)의 경우, GFP 신호의 밝기에 따라 두 가지 세포군으로 구분할 수 있습니다. 그림 A의 화살표 촉으로 표시된 바와 같이, 내과립층(inner nuclear layer)에 위치한 1형 도파민성 세포는 약한 형광을 나타냅니다. 2형 세포는 강하게 표지되었으며, 세포체가 그림 A의 화살표와 같이 내과립층에 있거나 그림 B와 같이 신경절 세포층(ganglion cell layer)으로 치우쳐 있습니다. 그림 C는 내망상층(inner plexiform layer)의 제3층에서 나타나는 2형 세포의 수지상 층판 구조를 보여주며, 여기에는 추적자인 뉴로바이오틴(neurobiotin)을 주입한 2형 세포의 형태학적 예시가 제시되어 있습니다.

추적자는 이후 형광 표지된 streptavidin(여기서는 마젠타색으로 표시됨)과 결합시켜 시각화하였습니다. 여기서는 신경절 세포층에 위치한 2형 세포의 백색광에 대한 서로 다른 반응 패턴을 보여줍니다. 이 절차 이후, 자극의 시작과 종료 시점의 반응 성분을 더 명확하게 구분하기 위해 3초 동안의 장기 자극을 사용하였습니다.

망막 회로에서 특정 세포 유형의 기능적 역할과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 약리학적 실험, 칼슘 이미징 또는 면역화학법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.