손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

이 절차의 전반적인 목표는 특정 세포 유형에서만 형광 마커를 발현하는 마우스 라인을 사용하여 손상되지 않은 망막에서 단일 뉴런의 광 반응과 형태를 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 눈을 해부하여 고립된 망막을 얻음으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 망막을 레이저 스캐닝 현미경 아래에 놓고 두 개의 광자 적외선 여기로 세포를 시각화하는 것입니다.

그런 다음 마이크로 피펫을 사용하여 기록 및 염료 충전을 위한 전체 셀 패치 클램프 구성을 얻습니다. 궁극적으로 이 제제는 광 자극에 대한 세포 반응을 기록할 수 있게 하고 컨포칼 현미경으로 기록된 세포의 형태를 밝힙니다. 망막에서 비유도 패치 클램프 기록과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 여기광으로 망막을 자극하지 않고 형광 표지된 세포를 향해 시각적으로 기록할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 망막 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다음과 같은 경우 주어진 세포 집단이 시각적 정보 처리에 기여하는 바는 무엇입니까? 세포 집단의 밀도가 낮고 식별을 용이하게 할 수 있는 뚜렷한 형태학적 특징을 가지고 있지 않더라도 가능합니다. 실험 전 최소 3시간 동안 쥐를 어둠 속에 적응시키는 것으로 이 실험을 시작합니다.

그 동안, 동봉된 원고에 기술된 대로 세포외 용액을 준비하고 실온에서 탄수화물로 거품을 냅니다. 다음으로, 마우스를 희생하고 구부러진 홍채 가위로 눈을 핵 형성합니다. 세포외 용액 접시에 옮깁니다.

그런 다음 한 쌍의 스프링 가위로 해부 현미경 아래에 놓습니다. 전조 세라타를 따라 안구를 열어 각막과 섬모체를 제거합니다. 수정체를 꺼내 색소 상피에서 망막을 조심스럽게 분리합니다.

그 후, 망막과 색소 상피 사이의 시신경을 절단합니다. 아이컵에서 망막을 제거합니다. 말려 올라간 망막의 내부는 신경절 세포 쪽입니다.

바깥쪽은 광수용체 쪽입니다. 그런 다음 나무 이쑤시개를 사용하여 부드럽게 잡아당겨 내부 망막 표면에서 유리체를 제거합니다. 그런 다음 조직을 쉽게 평평하게 만들기 위해 망막 둘레를 따라 짧게 절개합니다.

다음으로, 광수용체 면이 아래로 향하게 하여 망막을 기록실로 옮깁니다. 미세한 브러시로 유리 바닥에 펴고 스테인리스 스틸의 나일론 끈 프레임으로 고정합니다. 기록실을 암흑 속에 세워 놓고 정립 레이저 스캐닝 현미경 아래에 놓습니다.

슈퍼 퓨즈는 분당 5 밀리리터 이상으로 지속적으로 망막 준비를 수행합니다. 섭씨 35도까지 가열된 자동차 산소가 공급된 세포 외 용액을 사용하여 현미경은 패러데이 케이지 내부의 충격 흡수 공기 테이블에 위치합니다. 전자 차폐의 경우 케이지를 불투명 커튼으로 덮어 준비와 어둡게 유지하십시오.

또한 컴퓨터 모니터의 빛을 빨간색 투명 필름으로 차단합니다. 적외선 레이저를 850-870나노미터 또는 더 긴 파장으로 조정합니다. 모드 잠금 상태로 전환하고 두 개의 광자 여기를 사용하여 GFP 발현 세포를 시각화합니다.

패치 클램프 기록을 위해 동봉된 원고에 설명된 대로 보로 실리케이트 유리 마이크로 피펫에 형광 프로브가 포함된 세포 내 용액을 채웁니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 홀더에 삽입합니다. 기준 전극이 기록 챔버의 세포외 용액과 접촉하고 있는지 확인하십시오.

다음으로, 40배 침지 대물렌즈를 사용하여 GFP 발현 세포인 마이크로 피펫 표적에 압력을 가하면 오미크론 세포체는 표적 세포와의 마이크로 피펫 접촉이 망막 표면의 내부 제한막을 관통하기 전에 신경절 세포층과 인터클리어층의 근위부에 위치합니다. 성공적인 침투는 마이크로 피펫 팁에서 배출되는 세포 내 용액과 기저 망막 조직에서 내부 제한 막의 분리에 의해 인식됩니다. 세포 내 용액의 형광 염료는 원하는 세포에 접근하는 동안 두 광자 이미지에서 마이크로피펫 위치를 나타낼 수 있습니다.

그런 다음 마이크로 피펫의 압력을 해제하고 전체 셀 패치 클램프 구성을 얻습니다. 전류 클램프 모드에서 사용 가능한 기록은 영하 50에서 영하 55밀리볼트의 멤브레인 전위를 제공해야 하며 최소 20분 동안 지속되어야 합니다. 그 후, 만들어진 시각적 자극을 컴퓨터 모니터에 제시합니다.

빔 경로에 중성 밀도 필터를 삽입하여 자극 강도를 조정하고 자극의 공간적 위치를 기록된 세포의 중심까지 조정합니다. 다음으로, 자극 프로토콜을 시작하고 광 반응을 기록합니다. 자극 생성기를 사용하여 녹음 소프트웨어를 트리거합니다.

빔 경로 내에 포토 다이오드를 포함하여 자극 타이밍을 기록합니다. 마이크로 피펫을 집어넣을 때 세포체를 잡아당기지 않도록 주의하십시오. 염료 충전이 완료되면 형광제가 30-45분 동안 기록된 세포로 확산되도록 합니다.

다음은 프로모터 아래의 망막 편평한 산에서 세포를 발현하는 GFP의 예입니다.티로신 하이드록실라제의 경우, GFP 신호의 밝기로 두 집단을 구별할 수 있습니다. interclear 층에 위치한 type one 도파민 세포는 화살촉으로 표시된 것처럼 약한 형광을 발현합니다. 그림 A.에서 유형 2 세포는 강렬하게 표지되었으며 그림 A의 화살표로 표시된 것과 같이 층에 있거나 그림 B와 같이 신경절 세포층에서 변위된 세포체를 가지고 있으며, 그림 C는 여기에 표시된 내부 망상층의 3층에서 유형 2 세포의 수지상 층화를 보여주며, 여기에 표시된 것은 추적자 neuro biotin을 주입한 유형 2 세포의 형태학의 예입니다.

추적자는 나중에 형광 표지된 스트렙타비딘(streptavidin)에 결합하여 시각화되었으며, 이는 여기에 자홍색으로 표시되어 있습니다. 다음은 신경절 세포층에 위치한 2형 세포가 백색광에 대해 반응하는 다양한 패턴입니다. 이 절차에 따라 자극, 시작 및 오프셋에서 반응 구성 요소를 더 잘 구별하기 위해 3초의 연장된 자극이 사용되었습니다.

약리학 실험, 칼슘 이미징 또는 면역 화학과 같은 다른 방법을 수행하여 망막 회로에서 주어진 세포 유형의 기능적 역할과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.