전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

이 절차의 전반적인 목표는 쥐의 정자를 동결 보존하는 것입니다. 이는 먼저 극저온 보존 빨대를 사용하여 마우스 EPI에서 정자를 수집하여 수행됩니다. 그런 다음 빨대는 액체 질소로 얼려 따뜻한 물에서 해동하여 회수될 때까지 보관됩니다.

회수된 쥐의 정자는 최종적으로 체외 수정에 사용됩니다. 기존 방법에 비해 이 키트의 주요 장점은 키트에 쥐의 정자를 냉동 보존하고 회수하는 데 필요한 모든 재료가 포함되어 있다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 빨대를 다루고 적재하는 데 목이 졸릴 수 있습니다. 동결 보존할 마우스 라인당 15개의 정자 동결 보존 빨대를 조립하는 것으로 시작합니다.

먼저 0.25ml 빨대를 주사기에 가장 가까운 면 마개를 사용하여 1ml 주사기에 연결합니다. 두 번째는 각 빨대에 8cm의 IVF 배지를 넣은 다음 1cm의 공기를 넣습니다. 셋째, 15개의 빨대 각각에 냉동 보존할 각 라인에 대해 보존할 라인의 이름을 표시합니다.

4개의 웰 접시의 웰에 240마이크로리터의 극저온 보호제를 채웁니다. 냉동 캐니스터의 손잡이에 1밀리리터 피펫을 부착하여 손잡이를 확장합니다. 마지막으로 키트와 함께 제공된 폼 절연 상자에 15cm의 액체 질소를 채우고 뚜껑을 닫고 안락사시킵니다.

2 마리의 비옥 한 성인 수컷 마우스. 각 라인을 동결 보존하고 수술로 하려면 코달 EPI를 제거합니다. 마우스를 등쪽 recu에 놓고 복부 몸체 벽을 엽니다.

광대 한 존경심을 부드럽게 당기고 과도한 지방을 제거하십시오. 다음으로, 부고환을 찾아 빠른 경의를 표하는 작은 조각으로 그대로 제거합니다. 해부 범위에서 CPA가 적재된 준비된 4개의 우물 접시의 우물에 EPI를 놓습니다.

각 부고환에 5-7개의 세로로 절단합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 각각의 빠른 차이를 부드럽게 짜십시오. 정자를 밀어내려면 CPA와 부고환 혼합물을 실온에서 3-5분 동안 배양합니다.

부화하는 동안 손으로 접시를 두세 번 부드럽게 저어줍니다. 이렇게 하면 정자가 흡인에 의해 헤엄쳐 나갈 수 있습니다. 준비된 각 빨대에 5mm의 정자 현탁액을 넣은 다음 1cm의 공기를 넣습니다.

냉동 과정에서는 모든 빨대가 동일하게 적재되는 것이 중요합니다. 15개의 빨대를 모두 넣은 후 각 빨대의 양쪽 끝을 조심스럽게 열 밀봉합니다. 정자의 생존을 보장하려면 10분 이내에 15개의 빨대 모두에 대한 과정을 완료하십시오.

모든 빨대가 준비되면 냉동 캐니스터 정자 기둥에 넣습니다. 먼저 캐니스터를 폼 상자에 넣고 액체 질소에 수직으로 떠 있게 합니다. 10분 동안 캐니스터가 수직으로 떠 있어야 하며 그렇지 않으면 정자 동결률에 영향을 미칩니다.

그런 다음 캐니스터를 액체 질소에 담그십시오. 따라서 정자는 동결 보존되고 장기간 액체 질소를 저장할 준비가 됩니다. 계획된 정자 회수 약 60시간 전.

IVF 전에 여성을 과배란시키기 위해 서면 프로토콜을 따르십시오. 각 빨대를 해동하려면 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 최소 1시간 동안 모든 매체를 준비하고 평형을 이룹니다. 이러한 재료에는 오일로 덮인 90마이크로리터의 정자 처리 매체가 있는 35mm 페트리 접시가 포함됩니다.

35mm 페트리 접시와 3밀리리터의 IVF 배지를 절단 접시로 사용하고 5명의 초배란 암컷마다 500마이크로리터의 IVF 배지가 들어 있는 4개의 웰 접시 중 한 웰인 IVF 접시를 준비합니다. 각 IVF 접시에 대해 35밀리리터의 KSOM이 들어있는 35mm 페트리 접시인 세척 접시와 기름으로 덮인 50마이크로리터의 KSOM 배지 방울이 있는 35mm 페트리 접시인 배아 배양 접시를 준비합니다. 필요한 모든 재료가 준비되면 신속하게 창고에서 빨대를 꺼내 섭씨 37도의 수조에 2-3분 동안 넣습니다.

빨대를 말리십시오. 그런 다음 면 플러그 아래의 공기 기둥을 비스듬히 자릅니다. 빨대의 다른 쪽 끝에서 다른 공기 기둥 위에 또 다른 각도로 자릅니다.

정자 기둥을 절단하지 마십시오. 이제 200 마이크로 리터 피펫을 사용하여 빨대 끝에서 정자 현탁액을 흡인하고 정자 치료 배지의 중앙에 입금합니다. 방울. 그런 다음 접시를 45-60분 동안 배양합니다.

정자를 부화하는 동안, 과배란된 암컷의 ucs를 분리하고 절단 접시로 옮깁니다. 30게이지 바늘 또는 집게를 사용하여 각 난관을 찢어 적운 세포 복합체를 방출합니다. 5명의 여성으로부터 C-C를 각 IVF로 이식합니다.

글쎄, 최소한의 미디어로. 더러운 매체는 수정 효율을 저해하므로 지방과 혈액을 옮기지 마십시오. 배양 후, STM 방울 주변에서 10-15마이크로리터의 정자 현탁액을 채취하여 현탁액을 하나의 IVF에 증착합니다.

이제 수정을 위해 4-6시간 동안 세포를 공동 배양합니다. 수정 후 배아를 세척 접시에서 최소 2K SOM 세척을 통과시킵니다. 그 다음은 문화입니다.

원하는 발달 단계에 도달할 때까지 KSOM의 배아. 찰스 리버 근친 쥐 균주 5종의 정자가 냉동되었습니다. 정자 운동성과 빠른 진행성 운동성의 보호 비율은 정자에서 추출한 5가지 균주에 걸쳐 81%에서 47% 사이였습니다.

동결된 해동 정자의 IVF 비율은 1년 반 동안 26%에서 88%까지 균주에 따라 다양했습니다. 총 49개의 GM 마우스 계통이 정자 동결 보존에 의해 보관되었으며 나중에 4개의 다른 여성 균주에서 IVF에 의해 복구되었습니다. C 57 블랙 식스 BC DBA 1 및 1 29 SV 정자 동결 보존 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 30 분 안에 완료 할 수 있습니다.

이 절차에서는 캐니스터와 액체 질소로 수직으로 흐르는 것이 중요합니다.