Monocytes과 인간 혈액의 작은 샘플에서 돌기 세포의 리니지 특정 수신자 같은 수용체 - 매개 시그널링의 정량 이미징

다음 실험의 전반적인 목표는 이미지 스트림 기술를 사용하여 명확하게 정의된 환자 코호트의 일차 면역 세포 내 세포 메커니즘을 정량화하는 방법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 환자 또는 건강한 자원봉사자로부터 얻은 혈액 샘플에서 말초혈액 단핵구 또는 pbmc를 분리합니다. 분리 후, 세포를 활성화하고 형광 표지합니다.

다음으로, 세포를 유체역학적으로 집중시키고 레이저 광으로 들뜨게 한 후, 시간 지연 통합(time delay integration) CCD 카메라로 이미지를 획득합니다. 마지막으로, 이미지 스트림 사이토미터를 사용하여 이미지를 획득하고 NF kappa b를 정량화합니다.

각 세포 이미지의 전위(translocation) 분석은 ideas 소프트웨어를 사용하여 수행합니다. 최종적으로, 도트 플롯, 히스토그램 및 세포 이미지 분석을 통해 각 피험자 그룹 간의 차이를 결정할 수 있습니다. 이미지 스트림의 장점은 정량적 사실과 면역형광법을 결합한다는 점입니다.

우리는 단일 세포 또는 집단 수준에서 혈액의 소량 샘플만으로도 세포 신호 전달 경로를 계통 특이적 방식으로 관찰할 수 있습니다. 이 방법은 신호 전달 중간체를 국소화하고 정량화함으로써 지식의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 전사 인자의 핵 내 이동을 매개하는 작용을 조사하거나 세포 생물학에 미치는 노화의 영향을 살펴보는 데 사용할 수 있습니다.

저희 실험실의 팀장이 인간 자원봉사자로부터 얻은 말초혈액단핵세포(PBMC)를 분리한 후 해당 기술을 시연할 것입니다. 회수된 PBMC를 배지 0.6 mL당 3 × 10⁶ cells의 농도로 재부유시킨 후, 세포 현탁액을 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 일부 세포를 여기 보이는 TLR8 작용제인 R848과 같은 활성화제로 자극하고, 모든 세포를 5% CO₂ 인큐베이터에서 37 °C로 10~60분 동안 배양합니다.

배양 기간이 끝난 후, 상온에서 500 ×g로 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다. 단핵구 또는 DC 계통에 특이적인 표면 항체 칵테일로 4°C에서 20분 동안 세포를 염색하며, 이때 보정 대조군으로 사용할 단일 색상 컨쥬게이트 처리 세포 튜브를 포함합니다. 그 후 4% PFA-PBS에서 상온으로 10분 동안 세포를 고정합니다. 상온에서 500 ×g로 10분 동안 세포를 원심분리한 후, PBMC를 동결 버퍼에 재부유시켜 분석 당일까지 -80°C에서 보관합니다.

세포를 37 °C 항온수조에서 빠르게 해동한 다음, 원심분리를 통해 동결 보존액을 제거하고 100 µL의 BD perm wash buffer로 투과화합니다. 그 후, 여기에 제시된 anti NF kappa BP 65 항체와 같은 세포 내 신호 전달 성분 항체로 실온에서 20분 동안 라벨링합니다. 세포를 펠렛화한 후, goat anti rabbit IgG가 포함된 100 µL의 BD perm wash buffer에 다시 현탁합니다.

Alexa 647를 처리하고 PBMC를 상온에서 20분 동안 더 배양합니다. 이미징 직전에 핵 염색약으로 세포를 대조 염색합니다. ImageStream의 전원을 켜고 Inspire 소프트웨어를 실행하여 시작하십시오. 다음으로, load default template을 클릭한 후 initialize fluidics를 선택하십시오.

그런 다음 이미지 갤러리 메뉴를 클릭하고 전체 선택을 합니다. 이제 실행 설정을 눌러 비드의 이미징을 시작하고 명시야 채널을 선택하십시오. Speed bead가 작동하면 assist 탭의 start all을 클릭하여 기기를 교정하고 테스트합니다.

ImageStream 시스템의 보정이 완료되면, flush, lock and load를 눌러 가장 밝은 샘플을 기기에 로드하십시오. 그런 다음 도트 플롯(dot plot)에서 측정된 각 flora chrome의 최대 픽셀 값이 104,000 counts 사이가 되도록 레이저 출력을 설정하십시오. 이후 세포 분류 기준을 설정하십시오.

이제 run을 클릭하고 acquire를 선택하여 실험 데이터 파일을 수집하고 저장합니다. 데이터 파일을 분석하려면 먼저 Ideas 분석 소프트웨어를 엽니다. 보정된 이미지 파일을 생성한 다음, 정상적인 핵 염색약 강도와 높은 핵 염색약 종횡비를 가진 이벤트를 게이팅합니다. R1 게이트 내의 단일 세포를 파편이나 다세포 이벤트와 구별하기 위해, CD14 양성 세포 게이트 내에서 단핵구를 찾으며, CD11c는 높고 CD4 및 lin1 마커는 낮은 골수성 수지상 세포는 R3 게이트에 위치합니다.

마지막으로, ideas 소프트웨어를 사용하여 세포질 전사 인자인 NF kappa B와 핵 염색약의 공국소화(colocalization)를 결정합니다. NF kappa B와 핵 염색약의 높은 상관관계는 두 마커의 공국소화를 나타내며, 이는 높은 유사도 점수로 반영되어 세포의 활성화 정도를 나타냅니다. 서로 다른 처리군 또는 환자 집단 간의 높은 유사도 이벤트 백분율을 비교하여 세포의 상대적인 기능적 효율성을 평가할 수 있습니다.

그 후 소프트웨어를 사용하여 모집단 히스토그램의 주요 세그먼트에서 세포 이미지를 표시할 수 있습니다. ImageStream을 이용하면 pbmc에서 세포 서브셋을 직접 게이팅하고, 게이팅되었으나 분리되지 않은 세포 모집단으로부터 세포 반응을 이미징할 수 있습니다. 본 실험에서는 baseline에서 lin one, negative CD four, dim CD 11 C positive myeloid dcs의 NF kappa BP 65 핵 국소화에 미치는 TLR 신호 전달의 효과를 정량화하였습니다.

자극 전에는 전사 인자 NF kappa BP 65가 세포질에 존재하는 비자극 세포의 비율이 높게 관찰되었습니다. 자극 후, 처리된 세포에서 NF Kappa BP 65와 핵 염색약 PI의 유사성 점수가 유의하게 더 높게 측정되었으며, 이는 자극 후 NF Kappa BP 65가 핵 내로 전이되었음을 나타냅니다. 처리하지 않은 세포군과 R 8 48로 자극한 세포군에서 동시에 수집한 디지털 이미지는 대표 세포들과 세포 핵 내로 전이된 NF kappa B의 강도를 보여줍니다. 처리하지 않은 세포와 비교하여 R 8 48 자극군에서 NF Kappa B와 PI 염색의 강도가 더 밝게 나타남에 유의하십시오.

우리는 이 기술을 다양한 연령대의 기증자 세포에 적용하여 TLR 매개 NF kappa B 활성화 경로의 차이를 입증했습니다. 이 기술을 숙달하면 이미지 분석에 소요되는 추가 시간을 제외하고 하루 만에 완료할 수 있으며, 여러 개의 국소화 이미지와 집단 통계치를 모두 얻을 수 있습니다. 또한, 물리적 분리 없이 여러 세포 집단으로부터 반응을 직접 이미지화할 수 있습니다. 이미지 스트림은 다양한 세포 기전에 광범위하게 적용될 수 있으며 중개 연구에서 매우 가치 있게 활용될 것입니다.