Monocytes과 인간 혈액의 작은 샘플에서 돌기 세포의 리니지 특정 수신자 같은 수용체 - 매개 시그널링의 정량 이미징

다음 실험의 전반적인 목표는 잘 정의된 환자 코호트에서 1차 면역 세포의 세포 메커니즘을 정량화하기 위해 이미지 스트림 기술을 사용하는 것을 입증하는 것입니다. 이는 먼저 환자 또는 건강한 지원자로부터 얻은 혈액 샘플에서 말초 혈액 단핵 세포 또는 pbmc를 분리함으로써 달성됩니다. 분리 후, 세포는 활성화된 다음 형광 표지됩니다.

다음으로, 세포는 유체역학적으로 초점을 맞추고, 레이저 광으로 여기하고, 시간 지연 통합에서 이미지화됩니다. CCD 카메라. 마지막으로, 이미지 스트림 세포분석기를 사용하고 NF kappa b를 정량화하는 이미지가 필요합니다.

각 세포 이미지의 전좌는 아이디어 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 궁극적으로 각 피험자 그룹 간의 차이는 점도표, 히스토그램 및 세포 이미지 분석을 통해 결정될 수 있습니다. 이미지 스트림의 장점은 사실과 면역형광을 결합한다는 것입니다.

우리는 단일 세포 또는 집단의 계통 특이적 방식으로 세포 신호 경로를 볼 수 있으며, 소량의 혈액 샘플만으로 시작할 수 있습니다. 이 방법은 신호 중간체를 지역화하고 정량화하여 지식의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 투명 인자의 작용 매개 핵 전좌를 조사하거나 세포 생물학에 대한 노화의 영향을 살펴보는 데 사용할 수 있습니다.

제 연구실의 리더 1은 인간 지원자로부터 얻은 말초 혈액 단핵 세포를 분리한 후 기술을 시연할 것입니다. Resus는 회수된 p BMC를 배지 0.6ml당 6번째 세포까지 10배의 3배로 재현탁한 다음 세포 현탁액을 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 여기에 표시된 TLR 8 LA R 8 4 8과 같은 활성화제로 일부 세포를 자극한 다음 모든 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 10-60분 동안 배양합니다.

배양 기간이 끝난 후, 실온에서 500배 G로 5분 동안 세포를 펠렛화하고, 상층액을 버리고, 보상 대조군으로 사용할 단색 접합체로 표지된 세포 튜브를 포함하여 섭씨 4도에서 20분 동안 단핵구 또는 DC 계통에 특이적인 표면 항체 칵테일로 세포에 라벨을 붙입니다. 그런 다음 실온에서 10분 동안 4%P-F-A-P-B-S에 셀을 고정합니다. 실온에서 500배 G로 10분 동안 세포를 원심분리한 후, pbmC를 동결 완충액에 재현탁시키고 분석 당일 분석될 때까지 세포를 섭씨 음의 80도에서 보관합니다.

섭씨 37도의 수조에서 세포를 빠르게 해동한 다음 원심분리하여 동결 완충액을 제거한 후 100마이크로리터의 BD 파마 세척 완충액을 주입합니다. 그런 다음 여기에 표시된 항 NF 카파 BP 65 항체와 같은 항세포 내 신호 전달 성분 항체를 실온에서 20분 동안 표시합니다. 펠릿화 후, Resus 세포는 염소 항 토끼 IgG를 함유 한 100 마이크로 리터의 BD 파마 세척 완충액에 현탁시킵니다.

Alexa 6 47을 사용하고 실온에서 pbmc를 20분 더 배양합니다. 이미징 직전, 핵 염료로 세포를 카운터 염색하기 전에 먼저 이미지 스트림의 전원을 켠 다음 inspire 소프트웨어를 실행합니다. 그런 다음 load default 템플릿을 클릭한 다음 initialize fluidics를 선택합니다.

그런 다음 이미지 갤러리 메뉴를 클릭하고 모두 선택합니다. 이제 run setup을 눌러 비드 이미징을 시작한 다음 명시야 채널을 선택합니다. 스피드 비드가 실행되면 어시스트 탭 아래에서 모두 시작을 클릭하여 기기를 교정하고 테스트합니다.

ImageStream 시스템을 보정한 후 flush, lock 및 load를 눌러 가장 밝은 샘플을 기계에 로드합니다. 그런 다음 각 식물 크롬이 점도표에서 측정된 대로 104, 000 카운트 사이의 최대 픽셀 값을 갖도록 레이저 출력을 설정합니다. 그런 다음 셀 분류 기준을 설정합니다.

이제 실행, 획득을 클릭하여 실험 데이터 파일을 수집하고 저장하여 데이터 파일을 먼저 분석하고 아이디어를 엽니다. 분석 소프트웨어는 보정된 이미지 파일을 생성한 다음 정상적인 핵 염료 강도와 높은 핵 염료 종횡비로 이벤트를 게이트합니다. R one gate의 단일 세포를 파편 또는 다세포 이벤트와 구별하기 위해 CD 14 양성 세포, 골수성 수지상 세포에 대한 게이트 내에서 단핵구가 발견되며, CD 11 C에 대해 높고 CD four에 대해 낮고 lin one 마커는 R three gate에 있습니다.

마지막으로, 아이디어 소프트웨어를 사용하여 핵 염료와 세포질 전사 인자 NF kappa B의 공동 국소화를 결정합니다. 두 마커의 공동 국소화를 나타내는 NF kappa B 핵 염료의 높은 상관관계는 높은 유사성 점수에 반영되며 세포의 활성화 정도를 나타냅니다. 서로 다른 치료 그룹 또는 환자 집단 간의 높은 유사성 이벤트의 비율을 비교하여 세포 아이디어의 상대적 기능적 효율성을 평가할 수 있습니다.

그런 다음 소프트웨어를 사용하여 집단 히스토그램의 주요 세그먼트에서 세포 이미지를 표시할 수 있습니다. ImageStream을 사용하면 pbmc에서 직접 세포 subset을 게이팅하고 게이트되었지만 정렬되지 않은 세포 집단에서 세포 반응을 이미징할 수 있습니다. 여기서 lin 1, negative CD four, dim CD 11 C positive myeloid dcs에서 NF kappa BP 65의 핵 국소화에 대한 TLR 신호의 효과를 기준선에서 정량화했습니다.

세포질에서 전사 인자 NF kappa BP 65를 가진 자극되지 않은 세포의 높은 비율이 관찰되었다.자극 후, 처리된 세포는 NF Kappa BP 65가 자극 후 핵 내로 trans 위치함을 나타내는 핵 염색 PI와 NF Kappa BP 65의 상당히 높은 유사성 점수를 갖는 것으로 결정되었다. 치료되지 않은 세포 집단 또는 R8 48 자극된 세포 집단의 동시 수집된 디지털 이미지는 대표 세포와 세포핵 내에 위치한 NF kappa B trans의 강도를 보여줍니다. 치료되지 않은 세포에 비해 R 8 48 자극 그룹에서 NF, Kappa B 및 PI 염색의 강도가 더 밝다는 점에 주목하십시오.

우리는 다양한 연령의 기증자의 세포에 이 기술을 사용했으며 TLR 매개 NF 카파 B 활성화 경로에서 차이를 보여주었습니다.이 기술을 마스터하면 이미지 분석을 위한 추가 시간 내에 하루 이내에 완료할 수 있으므로 여러 국소화 이미지 및 개체군 통계가 모두 가능합니다. 또한 물리적 분리 없이 여러 세포 집단에서 직접 반응을 이미지화할 수 있습니다. 이미지 스트림은 여러 세포 메커니즘에 광범위하게 적용될 수 있으며 중개 연구에서 매우 중요할 것입니다.