Name: Monocyte 환생 및 개인 만성 염증 성 조건에서 거품 세포 형성의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 학습하세요 단핵구의 혈관내피 이동 및 거품 세포 형성 정량화 방법을. 인간 임상 샘플을 사용하여 심혈관 질환 위험 평가에 활용할 수 있는 이 기법은 현미경 및 유세포 분석으로 세포 변화를 측정합니다.

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저자는 기꺼이이 모델의 이전 반복의 개발에 그들의 중요 한 역할에 대 한 교수 윌리엄 뮬러 박사 클레어 Westhorpe의 작품을 인정합니다. 저자 또한 monocyte의 정렬에 대 한 AMREP Flow Cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다 하위 집합 및 알프레드 병원 감염 질병 단위 임상 연구 일부 연구에 대 한 HIV + 개인의 채용에 대 한 간호사. 저자는 기꺼이 버넷 연구소를 받은 빅토리아 운영 인프라 지원 프로그램의이 작품에 기여를 인정 합니다. TAA는 RMIT 대학 담당-장관의 박사 장학금에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 NHMRC 프로젝트 그랜트가 아에 게 수 여 하는 1108792에 의해 지원 되었다. TK에 의해 지원 됩니다 NIH 부여 NIH K08AI08272, NIH/NCATS 그랜트 # UL1TR000124.

참고: 인간의 생물 학적 샘플을 사용 하 여 모든 실험 윤리 승인 알프레드 병원 인간의 윤리 위원회, 멜버른에서에서 수행 되었습니다. 지정 하지 않으면 모든 실험은 클래스 II Biosafety 캐비닛에 수행 했다. " Prewarmed "는 waterbath에서 37 ° C로 예 열 하는 약을 말합니다.
 1. 준비의 유형 I 섬유 콜라겐 젤: 1 일 <ol><li>준비 순차적으로 추가 하 고 혼합 35.7 m m NaOH에 의해 콜라겐 젤 생산, 0.71 x M199, 4.58 m m 초 산 및 1.71 mg/mL 유형 I 섬유 콜라겐 5 mL 폴리스 티 렌으로 표 1에 의하여 관. 
	참고: 콜라겐은 콜라겐의 형성을 중지 하기 위해서는 5 번 위아래로 부드럽게 pipetting으로 잘 혼합 되도록 ' 주머니 ' 젤 혼합물에서. 현미경 검사 법에 대 한 테스트 조건 당 4-6 젤 또는 cytometry에 대 한 테스트 조건 당 15 젤 준비.</li>
	<li>한번 메 마른 플랫 96-잘 조직 배양 플레이트의 각 음에 콜라겐 젤 혼합물의 혼합, aliquot 50 µ L을 잘. 외부 행 및 열, 사용 하지 않지만 이러한 200 µ L 1의 채우기 x Dubecco ' s 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 건조에서는 젤을 보호 하기 위해. 유해를 콜라겐 수 있도록 2 h 37 °C/5% CO 2 접시를 품 어. 
	참고: 위 판 직접도 열 분포를 보장 하기 위해 인큐베이터에서 깨끗 한 금속 선반.</li>
	<li>인큐베이션, 다음 오버레이 보충된 M199 x 1의 150 µ L로 젤 (재료의 표 참조) 사용까지 5 일 동안 품 어와.</li>
</ol> 2. 확장 저장 HUVEC: 하루 1 <ol><li>라벨 코트 10 cm 직경 50 µ g/mL fibronectin의 1 mL를 페 트리 접시 1 x PBS에 희석 하 고 10 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
	<li>해 동 aliquots cryopreserved 주 인간의 탯 줄의 정 맥 내 피 세포 (HUVEC, 1.0 x 10 6 셀) 10 ml M20. 
	참고: 이전 21을 설명 하 고 낮은 통로에 사용 준비 되어야 한다 HUVEC (&lt; 4 구절). HUVEC 여기 인간의 관상 동맥 내 피 세포로 대체 될 수 있습니다.</li>
	<li>10 ml M20 HUVEC resuspend 및 fibronectin 코팅 접시, 3 일에 미디어 대체 셀, 그리고 문화에 합류 (약 5 일)의 추가 전에 초과 fibronectin 발음 추가.</li>
</ol> 3. 콜라겐 젤에 HUVEC 단층 배양: 하루 5 <ol><li>날 5, HUVEC 문화는 배양 접시에서 표면에 뜨는 발음 하 분리 혈 청 무료 M199의 10 mL와 함께 혈 청에 포함 된 미디어를 멀리 세척.</li>
	<li>M199에 HUVEC 5 mL 0.05 %trypsin / 0.53 EDTA를 추가 하 고 셀 분리 될 때까지 부드럽게 흔들어, 실내 온도에 1-2 분 동안 품 어.</li>
	<li>분리, 일단 신속 하 게 5 mL M20 페 트리 접시를 헹 구 고 10 mL 튜브에 세포를 포함 하는 미디어 전송.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기 샘플 상쾌한 발음, M20의 200 µ L 셀 resuspend 및는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>는 M20에서 10 5 셀/mL x 2.0 셀 resuspend, 96 잘 접시 (1.3 단계)에서 젤에 M199 발음 하 고 추가의 resuspended HUVEC (2.0 x 10 4 셀) 100 µ L 각 콜라겐 젤 (1.2 단계) 위의 준비. 추가 3 일 37 °C/5% CO 2 격판덮개 문화. 
	참고: HUVEC 단층의 무결성 수 수 3 일 후에 의해 확인 실버 질산염이이 단계에서 22 또는 꽉 접합 단백질 23 immunohistochemistry 얼룩. 이 목적에 대 한 추가 젤을 준비 해야 합니다.</li>
</ol> 4. HUVEC 단층와 환생에 대 한 Monocytes의 절연/정품 인증: 하루 8 <ol><li>하루 8에는 M20 발음 monocytes의 추가 하기 전에 각 HUVEC 단층 활성화 미디어는 젤을 오버레이 및 100 µ L 10 ng/mL의 추가 M20 젤 당에 인간 TNFα입니다. 37 °C/5%에서 품 어 공동 2 4 h. 
	참고: 비-활성화 HUVEC 조건 또한 포함 될 수 있습니다 컨트롤으로 필요한 경우.</li>
	<li>동안 4 h HUVEC 활성화 단계, 격리 monocytes PBMCs 자석 사용 하 여에서 구슬 제조 업체 마다 셀에 대 한 부정적인 선택 기법 ' s 지시. 10 6 PBMCs x 6.5의 최소 monocytes는 일반적으로 PBMCs의 대략 10-15%에 대 한 계정으로 한 조건에 필요한 10 5 monocytes x 3.0을 안정적으로 복구 하려면이 단계에서 사용 해야 합니다. 
	참고: monocyte 환생 및 거품 세포 형성 이전 monocyte 활성화의 효과 평가 하려면 monocytes는이 단계에서 활성화할 수 있습니다. Monocytes는 해 동된 PBMCs (즉, 저장 된 환자 샘플) 필요한 경우 격리 될 수 있습니다. FACS 정렬 하 여 격리 하는 monocyte 하위 집합 추가 젤 (그림 1)를 위해 준비 될 수 있다.</li>
</ol> 5. 기본 인간 Monocytes의 환생: 하루 8 <ol><li>monocyte 환생을 측정, TNFα 포함 된 미디어를 제거 하 고 세척 젤 100 µ L로 두 번을 추가 하 고 미디어를 제거 하 여 M199. 2.0 x 10을 추가 다음 세척, 5 갓 절연 또는 재개 되 고 씻어 cryopreserved PBMCs 또는 10 4 갓 절연 monocytes x 5.0 또는 정화를 100 µ L에서 HUVEC monolayers 하위 집합 monocyte M20. 젤으로 monocytes의 앞으로 환생 있도록 37 ° C, 5% CO 2에서 1 시간에 품 어. 그것은 모든 실험 조건 검사에 대 한 6 우물 수 있도록 최고의. 
	참고: 환생 및 거품 세포 형성에 헌 혈 청의 효과 평가 하려면 품 어 셀 M20 열 비활성화 기증자 혈 청의 원하는 농도 포함 하 고 조건에 풀링된 인간의 혈 청 제어 됩니다. Monocytes 이외의 백혈구는이 단계에서 추가할 수 있습니다. 특정 지질/지질 종 (예를 들어, HDL, oxHDL)의 영향을 조사 하는 경우 20-50 µ g/mL 지질을 포함 하는 혈 청 자유로운 미디어와 모든 다음 단계를 수행.</li>
	<li>앞으로 환생의 h 1 후 젤 prewarmed 1mm 1 x PBS에 EGTA 100 µ L로 두 번 그리고 한 번 100 µ L를 세척 하 여 비 transmigrated 세포를 수집 M199 (같은 원심 조건), 같은 각 우물에서 supernatants 풀링 얼음에 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 실험 상태 (일반적으로 6 우물). 4 ° C, 5 분에 대 한 300 x g에서 비 transmigrated 세포를 원심과 30 µ L 1 x PBS에서 resuspend.</li>
	<li>셀에서 앞으로 transmigrated 셀의 수를 확인 하는 상쾌한 수집.</li>
	<li>앞으로 transmigrated 셀의 백분율은 다음과 같이 결정 됩니다: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq3.jpg"></li> <li>는 씻어 커버 transmigrated 셀 100 µ L 포함 하는 젤 M20 및 추가 48 헤에 대 한 품 어</li>
	<li>후 48 h는 상쾌한 수집과 100 µ L로 두 번 세척 비 transmigrated 셀 prewarmed 1mm EGTA/PBS, 수집 및 풀링 단계 5.2와 같이 각 조건에서 상쾌한. 
	참고: 이러한 셀 f에 테스트 수 있습니다 역방향 transmigrated 세포의 표현 형ollowing 표준 cytometry 프로토콜을 얼룩이 지.</li>
	<li>4 ° c, 5 분에 대 한 300 x g 세포를 원심 및 셀 30 µ L 1 x PBS에 resuspend. 셀 하 고 trypan 푸른 얼룩 통해 생존 능력 결정.</li>
	<li>다음과 같은 방정식을 사용 하 여 역방향 transmigrated 세포의 비율 결정: 
	<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq4.jpg"> 참고: 될 것입니다 가능성 앞으로 환생은 앞으로 transmigrated 세포의 총 수 역 환생의 더 정확한 표시를 제공에 대 한 회계 100%.</li>
	<li>분석 현미경, 각 잘을 100 µ L 2% 포름알데히드 (최종 농도)를 추가 하 여는 젤을 수정에 대 한 알루미늄에서 플레이트 커버 호 일 및 분석까지 4 ° C에서 저장. Cytometry에 대 한이 단계에서 셀을 해결 하지 않습니다. 현미경 검사 법 (단원 6) 또는 교류 cytometry (섹션 7) 분석에 대 한 아래 프로토콜 참조. 
	주의: 포름알데히드는 유독 하 고 부식성; 개인 보호 장비 (PPE)를 사용 합니다. 그러나 주의 해야 포름알데히드를 추가할 때,,이 단계 사용 하는 낮은 농도 때문에 증기 두건에서 필요 하지 않습니다.</li>
</ol> 6. 거품 세포와 대 식 세포 (기름 빨간 O 얼룩) 현미경 검사 법에 의해 정량 <ol><li>는 포름알데히드를 제거 하 고 5 분 동안 50% (v/v) 메탄올과 15 분에 대 한 다음 100 µ L 78% (v/v) 메탄올의 100 µ L로 젤을 씻어 
	참고: 실험실 벤치에와 클래스 II 생물 캐비닛 안에 수행 될 수 있습니다 얼룩 단계.</li>
	<li>지질 방울 갓 0.2%의 추가 100 µ L에 의해 (w/v) 기름 빨간 O (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료를 참조) 실 온에서 1 시간을 위한 얼룩.</li>
	<li>4 젤을 세척 하 여 제거 초과 얼룩 100 µ L의 78% (v/v) 메탄올, 발음 및 각 워시 후 상쾌한 삭제 된 시간</li>
	<li>Giemsa, 100 µ L로 실 온에서 15 분 증류수에 1시 10분 희석에 대 한 counterstain.</li>
	<li>Giemsa 얼룩을 발음 하 고 젤 물으로 한번 씻어.</li>
	<li>접시에서 젤을 분리, rim 21 G 바늘을 사용 하 여 바깥쪽, 젤의 가장자리 주위에 직면 하는 경사와 우물.</li>
	<li>현미경 슬라이드에는 젤을 탑재 펀치 양면 테이프의 2.54 cm x 1.5 cm 스트립에 두 구멍 (6.35 m m 직경). 표준 현미경 쪽으로 테이프를 수정 하 고 위에서 보호 코팅 제거.
	<ol><li>추가 전송 피 펫을 사용 하 여 테이프에 구멍에 물 한 방울. 핀셋을 사용 하 여, 부드럽게 전송 젤 크기 1.5 유리 coverslip 커버 테이프에 구멍을. 테이프에 그것을 준수 하는 coverslip을 살짝 누릅니다.</li>
	</ol></li> <li>40 X 목표는 거꾸로 한 현미경에 사용 하는 미분 간섭 명암 밝은 분야 현미경 검사 법으로 검사.
	<ol><li>가져와 40 X에 초점으로 HUVEC 단층 확대 및 스크롤 '으로 ' 젤, 젤의 전체 깊이 걸쳐 세포/거품 세포를 계산. 세 가지 필드 보기 가능한 가장자리 효과 최소화 하기 위해 젤의 가장자리에서 비슷한 거리에 있는 반복 합니다. 이렇게 하면 젤 깊이 세 지역 사이 일관. 
		참고: 점수 젤 셀으로 어느 거품 세포 (포함 된 셀으로 정의 된 &gt; 1/3의 기름 빨간 O로 그들의 세포질 지질 방울 스테인드) 또는 슬라이드 ( 그림 2)에 장착의 2 시간 내 대 식 세포. 거품 세포 형성 마이그레이션된 셀의 총 수를 기준으로 거품 세포의 백분율로 표시 하 고 보기의 3 분야에서 중간 계산 조건, 당 6 젤에 대 한 검사 조건 당 18 측정의 중간값 따라서 표현 된다. 전형적인 실험에서 원시 세포의 예는 표 2에 표시 됩니다. 
		참고: 셀 폼 셀 vs macrophage 현미경 검사 법에 의해 분류 주관적 이며 따라서 탐정 종속 될 수 있습니다. 임상 연구에서 어디 실험 시간의 연장된 기간 동안 수행 됩니다, 단일 수 사관에 의해 멀게 수행 될 모든 계산에 대 한 중요 하다. 거품 세포와 젤에서 세포의 예는 그림 2에 제공 됩니다.</li>
	</ol></li></ol> 7. Flow Cytometry 셀 Transmigrated 분석 <ol><li>phenotypically 거품 세포와 대 식 세포 transendothelial 마이그레이션 다음 특성, prewarmed는 37 ° C 1 mg/mL 콜라에 M199에 희석 D의 100 µ L을 추가 하 여에서 젤 소화 고 37 °C/5% CO 2에서 20 분 동안 품 어 각. 
	참고:도 열 분포를 보장 하기 위해 인큐베이터에서 깨끗 한 금속 선반에 직접 96 잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>인큐베이션, macerate 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 젤 하 고 37 °C/5% CO 2에 추가 20 분 동안 품 어.</li>
	<li>한번 완벽 하 게 소화, 35 µ m 나일론을 통해 소화 복제 젤 얼음에 뒤덮인된 FACS 튜브 메쉬 필터 및 수영장 세척 한 번 FACS와 세척 (재료의 표 참조) 4 ° C에서, 300 x g. Resuspend FACS의 100 µ L 셀 워시</li>
	<li>CD45, 라이브/죽은 세포 마커 및 표준 흐름 cytometry 프로토콜을 사용 하 여 관심사의 표면/세포내 phenotypic 또는 기능 마커 fluorophore 활용 된 항 체 특정 결과 셀을 품 어. 
	참고: 컨트롤 준비 적절 한 fluorophores Ig 보상 비즈를 사용 하 여 보상에 대 한 관. 또한 cytospinning에 의해 추출 된 세포 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 유리 슬라이드에 수집 수 있습니다. 또는, 우리는 성공적으로이 프로토콜을 사용 하 여 이미징 cytometry 통해 평가 대 한 셀을 수집.</li>
	<li>교류 cytometer를 사용 하 여 셀을 습득 하 고 수행 하는 필요에 따라 보상. 
	참고: 거품 세포/세포 가벼운 살포 속성을 사용 하 여 개별 인구를 형성 하지 않을 수 있습니다 하 고 크기와 모양에 상당히 다를 수 있습니다, 설정 자유 앞으로 분산형 (FSC)와 측면 살포 (SSC) 빌 게이츠와 같이 모든 마이그레이션된 셀을 캡처 &lt; 강력한 클래스 "xfig" = &gt; 그림 3A.</li>
	<li>수집, 다음 흐름 cytometry 소프트웨어를 사용 하 여 데이터 분석을 수행. 마이그레이션된 셀을 확인 하려면 먼저 그림 3B와 같이 라이브/죽은 표식에 대 한 부정으로 셀을 선택 합니다. 그런 다음 단일 셀 차별 SSC-지역 대 SSC 높이에 표시 된 셀 주위에 꽉 게이트를 만들어서 수행.</li>
	<li>CD45 선택 + 세포와 세포/거품 세포 이들은 FSC/SSC 플롯에 마이그레이션된 셀의 주요 인구 문.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 프로토콜 monocyte 환생 및 거품 세포 형성을 결합 하 여 인간의 임상 동료에서 monocytes의 atherogenicity를 평가 하기 위한 다양 하 고 생리 적으로 관련 된 방법을 제공 합니다. 이 모델은 거품 세포 형성에 monocyte 환생의 효과 고려 하 고 이외에 고유의 역 환생6 의 측정을 허용 한다 거품 세포 형성의 다른 방법을 통해 장점을 제공합니다 버 외 인 요인의 존재 여부에 거품 세포로 성숙 하 릇 monocytes의 또한, 내 피 활성화의 역할은 또한 고려 거품 세포 형성14와 관련 된 지질 종의 그 내 피 활성화 upregulates 산화를 같이 우리. 마지막으로, 출구 (패 회귀와 연결 된 속성)을 받아야 하는 monocytes의 표현 형 계량 하 고 현미경 및 흐름 cytometry 특징 될 수 있습니다.
젤으로 환생의 3 차원 특성 식별 및 ...

Monocyte 환생은 혈전 증, 뇌졸중과 심근 경색으로 이어질 수 있는 동맥 경 화성 플 라크의 개발에 중요 한 단계 이다. 동맥 경 화성 플 라크 지방 줄무늬, 일반적으로 현재의 낮은 진동 혈액 흐름의 사이트에서 중간에 큰 동맥, 예금 된 지질 내 피 활성화에 기여 하 고 염증1지역화에에서 개발. Monocytes는 monocyte 혈 단백질 (CCL2) 등을 통해 지방 줄무늬에 내 피 세포를 보충 하 고 intima2로 transmigrate. 환생, 다음 monocytes 지질 통풍 관, 지질 합성, 콜레스테롤 경과의 다운 레 귤 레이 션 또는 위 요인의 조합 결과로 거품 세포 라고 하는 atherogenic, 지질-라덴 세포 형성 수 있습니다. Monocytes 또한 순환에 있는 지질 축적 하 고 아마도 predisposing 세포 거품 세포 형성3,4에 대 한 '거품' 표현 형을가지고 수 있습니다. 거품 세포는 지방 줄무늬와 초기 단계의 동맥 경 화성 플 라크의 정의 기능 그리고 그들의 대형은 지질과 염증 성 중재자5에 의해 영향을. 또는, monocytes는 반대로 수 동맥에서 혈 류6, intima 동맥의 건강을 유지 하는 행동에서 지질 제거로 transmigrate.
하는 monocytes의 성향을 결정 동맥 내 피에 걸쳐 transmigrate 및 양식 폼 셀은 intima에 또는 반대로 transmigrate 그리고 플 라크에서 지질, 증가에 monocyte 활성화의 역할을 이해 하기 위한 주요 요구 사항 동맥 경 화성 위험입니다. 동맥 경화 증 마우스 모델 CADs의 지방 조 흔/동맥 경 화성 플 라크 개발에 대 한 정보 실시간 vivo에서 elucidating에 중요 하다. 그러나, 이러한 모델 (ApoE-/-서 부 타입 다이어트 모델) 등 다이어트7,8, 과감 한 변경와 일반적으로 결합 하는, 이러한 동물의 능력을 처리 하는 자연 콜레스테롤의 유전 변경 필요 어떤 드라이브 패 개발을 레벨 지질 순환의 비 생리 적 축적을 유도 합니다. 이러한 모델 만성 염증 성 인간의 조건 HIV 감염 등 콜레스테롤 저밀도 지단백 (LDL) 수치를 순환 증가와 연결 되지 않은 관련을 제한 수 있습니다. 또한, 차이 monocyte 생물학 인간과 쥐 monocytes의 부분 모집단의 관련성에 대 한 면역 질문 테스트 확인 (등 중간 monocytes (CD14+CD16 ++))9 어려운. 이 때 중요 한 심혈 관 질환으로 중간 monocyte 건의 심장 혈관 사건의10,11를 독립적으로 예측 운전 메커니즘을 공부. 분석 실험 순차적으로 격리에서 하거나 monocyte 환생 또는 거품 세포 형성을 측정 하기 위해 존재, 임상 동료에서 동일한 셀을 사용 하 여 초기 atherogenesis의 두 측면을 측정을 위한 생체 외에서 시험 검증 않았습니다. Transwell 모델에 의하여 셀 상단 챔버로 로드 되 고 다공성 플라스틱 방 벽 또는 셀 단층으로 일반적으로 chemoattractant12 미디어를 포함 하는 낮은 챔버 transmigrate 수정된 Boyden 2 챔버 시스템을 활용 , 13. 백혈구 환생의 분석을 위해 널리 이용 된다, 하는 동안 이러한 일반적으로 intima, 솔루션으로 마이그레이션 transmigrated 셀에 결과 나타내는 레이어를 포함 하지 않는 모델과 거품 세포의 측정에 대 한 허용 하지 않습니다 형성 또는 동일한 셀의 반전 환생입니다. 반대로, 거품 세포 형성의 모델 monocytes 또는 거품 세포 형성14을 알려져 있다 내 피 활성화의 효과를 유도 transmigratory 변경에 대 한 계정을 하지 않습니다. 또한, 이러한 시스템 유도 거품 세포 형성 세포에서 세포 배양 배지 exogenous 산화 저밀도 지 단백질 (oxLDL)15,16, 키 유도의 농도 포화의 추가 의해 준수 거품 세포 형성. LDL이이 모델에 사용 되는 종종 산화 CuSO4 치료17, 같은 비-순수-관련 프로세스에 따라서, 이러한 모델을 사용 하 여 연구의 생리 적인 중요성을 심문.
여기 우리가 따라서 거품 세포 형성에 monocytes의 역할을 잘 모델링 monocyte 환생과 외 인 oxLDL의 추가 요구 하지 않는 동일한 세포의 거품 세포 형성을 단정 하는 분석 결과 설명 합니다. 이 교수 윌리엄 뮬러 (노스웨스턴 대학교, 시카고)18에 의해 원래 개발 되었다 모델과 비보 전 비 활성화에서 격리 하는 monocytes의 atherogenicity 평가 하기 위해 우리의 실험실에 더 세련 된 개인 기본 염증 성 조건20노화 뿐만 아니라 HIV 감염19 질병을 동반, 그 조건은 동맥 경화 증의 위험 증가와 관련. 이 모델 또한 폼 거품 세포20, 거품 세포 형성14에 TNF 같은 cytokines에 의해 내 피 활성화의 영향을 다른 monocyte 하위 집합의 성향에 관한 기본적인 생물학 질문에 응답 하기 위한 플랫폼을 제공 합니다. , 깊이 등 monocytes의 철새 속성과 젤19에 환생의 속도 및. 또한, monocyte 환생 및 거품 세포 형성 표준 현미경을 사용 하 여 측정할 수 있습니다, 그리고 라이브 셀 이미징, flow cytometry 및 이미징 cytometry, 따라서, atherogenesis에 monocytes의 역할을 평가 하는 다양 한 방법을 제공.

<table><tbody><tr><td>Gel 준비 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-500G</td><td>0.1 M NaOH 희석 H20</td></tr><tr><td>10x M199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td></td></tr><tr><td>AcCOOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092-100ML</td><td>H20 Cultrex 소 콜라겐에 희석된 20mM 아세트산</td></tr><tr><td> 나는</td><td>R& D 시스템</td><td>3442-050-01</td><td>유형 I 섬유질 콜라겐</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>Earle's salts, L-glutamine, 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. 100 &micro를 함유한 M199 배지; g/mL L-글루타민&nbsp; 및 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신&nbsp;</td></tr><tr><td>M20</td><td></td><td></td><td>보충: 20% 열 비활성화 풀 또는 공여체 혈청을 함유하는 M199. LDL과 같은 개별 지질 종을 M199에 추가할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td></td><td></td><td>일차 인간 탯줄 내피 세포(HUVEC)는 사전 동의 및 윤리 승인을 받아 기증된 탯줄에서 분리할 수 있습니다. 절연 HUVEC은 상업적으로 구매할 수도 있습니다.</td></tr><tr><td>인간 관상동맥 내피 세포</td>(primary human coronary artery endothelial cells<td></td><td></td><td>)는 정보에 입각한 동의와 윤리 승인이 있는 상태에서 기증된 동맥에서 분리할 수 있습니다. 분리된 세포는 또한 상업적으로 구매될 수 있다.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BDH Merck</td><td>10093.5V</td><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) - 0.5M, pH 8.0</td></tr><tr><td>EGTA</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>E3889-500G</td><td>에틸렌 글리콜-비스(&베타;-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA) - 1mM, pH 8.0</td></tr><tr><td>0.05% 트립신 EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0.05% 트립신/0.53 EDTA (1X)</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>L-글루타민 (200 mM)</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>페니실린/스트렙토마이신(10,000 units/mL 페니실린 및 10,000 &마이크로; g/mL 스트렙토마이신)</td></tr><tr><td>신생아 송아지 혈청</td><td>Gibco</td><td>16010-142</td><td>신생 송아지 혈청: 뉴질랜드 원산지</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056-1MG</td><td>Fibronectin - 50 &micro; g/mL 분취액 준비 및 저장</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): 멸균 H20</td></tr><tr><td>0.1% TNF</td><td></td>로 1x로 희석<td>PHC3015</td><td>재조합 인간 TNF - H20에서 재구성하고 10 &micro에 저장; g/mL 분취량</td></tr><tr><td>저밀도 지단백</td><td>Merck Millipore</td><td>LP2-2MG</td><td>저밀도 지단백(LDL)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>카탈로그 번호</td><td>Comments<</td></tr><tr><td>strong>현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 또는 2% 포름알데히드</td><td>Polysciences</td><td>4018</td><td>멸균 H20 50% 및 78% 메탄올로 희석된 1 또는 2% 포름알데히드</td></tr><tr><td></td><td>Ajax Finechem</td><td>318-2.5L GL</td><td>50% 또는 78% v/v 메탄올, H20 오일로 희석</td></tr><tr><td>Red O stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625-25G</td><td>22% 1M NaOH 및 78%(v/v) 메탄올에서 2mg/mL로 희석</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Mikro-Glass</td><td>S41104AMK</td><td>트윈 젖빛 45도 접지 가장자리 현미경 슬라이드(25 X 76mm)</td></tr> <tr><td>커버 슬립</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>MENCS224015GP</td><td>22 x 40 mm #1.5 크기 유리 커버 슬립</td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>3M Scotch</td><td>4011</td><td>초강력 외부 마운팅 테이프 (25.4 mm x 1.51 m)</td></tr><tr><td>Giemsa stain</td><td>Merck Millipore</td><td>1.09204.0500</td><td>Giemsa의 azur eosin 메틸렌 블루 용액 (묽은 원료 1:10 in H20)</td></tr><tr><td>홀 펀치</td><td></td><td></td><td>핸드 헬드 단일 홀 펀치 (6.35 mm 펀치)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Flow cytometry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088858001</td><td>Collagenase D를 M199 배지에서 1 mg/mL로 희석&nbsp;</td></tr><tr><td>35 &마이크로; m 나일론 메쉬 캡 폴리스티렌 FACS 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>35 &micro; m 나일론 메쉬 캡이 있는 폴리스티렌 FACS 튜브</td></tr><tr><td>Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain</td><td>Life Technologies</td><td>L34959</td><td>Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell</td></tr><tr><td>stain FACS wash</td><td></td><td></td><td>1 X PBS-, 2mM EDTA 및 1% New born calf serum</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호를 혼합하여 준비합니다 </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>Nunclon</td><td>167008</td><td>Delta 표면 평평한 바닥 96웰 플레이트</td></tr><tr><td>10cm 페트리 접시</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>멸균 10cm 페트리 접시</td></tr><tr><td>1.5mL Eppendorf 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>Eppendorf 튜브</td></tr><tr><td>전송 피펫</td><td>Samco Scientific</td><td>222-20S</td><td>멸균 이송 피펫 (1 mL, 대형 전구)</td></tr></tbody></table>

monocyte 환생 및 개인 만성 염증 성 조건에서 거품 세포 형성의 정량화

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

관상 동맥 질환 (CAD)는 병 적 상태와 사망률 전세계의 주요 원인입니다. 동맥 경화, 선도적인 CAD의 원인, 예금 된 지질 이라는 큰 동맥에 동맥 벽의 중간에 있는 지방 줄무늬의 염증 성 사이트에 타고 난 면역 monocytes의 환생에 의해 시작 됩니다. 병 변은 동맥 경화 증의 초기 단계에서의 주요 병원 성 특징은 거품 세포 또는 세포 지질 라덴 형태로 동맥으로 마이그레이션하는 monocytes의 성숙 이다. 상당한 증거 지원 일반적인 노화 뿐 아니라 류 마티스 관절염 및 HIV, 질병을 동반 하는 만성 염증 성 조건에 의해 동맥 경화 증의 위험이 증가 하 고이 위험 monocyte에 의해 예측 가설 활성화입니다. 마우스 모델 vivo에서atherogenesis에 monocytes의 역할을 조사 하는 좋은 플랫폼을 제공, 그들은 자연 콜레스테롤 물질 대사의 유전 변경 및 일반 마우스 다이어트의 과감 한 변경 요구 및 적합성에 대 한 제한 인간의 comorbid 질병의 atherogenic 영향 연구. 이 모델을 인간의 생체 외에서 정의 된 질병 국가와 개인 으로부터 격리 하는 monocytes의 atherogenic 잠재력 측정을 개발 동기. 현재, 인간의 생체 외에서 모델은 격리에 monocyte 환생 및 거품 세포 형성 평가을 제한 하 고 있다. 여기 우리는 프로토콜 설명 monocytes 환자의 혈액에서 분리 된 1 형 콜라겐 매트릭스로 인간의 내 피 세포에서 transmigrate 그리고 그들의 성향 외 인 지질의 유무에 거품 세포로 성숙 하는 측정. 프로토콜에서 HIV 감염을 가진 개인 및 노인 HIV 감염 되지 않은 개인 정화 인간 monocytes의 사용에 대 한 확인 되었습니다. 이 모델은 다목적 monocyte 환생과 거품 세포 형성 중 현미경을 사용 하 여 계산 될 수 있습니다 또는 atherogenic 요인의 평가 허용 뿐만 아니라 cytometry 혈 청 또는 혈장에 존재.

Monocyte 환생을 측정
Monocytes는 그림 1에 설명 된 대로 모델에 추가 되 고 6 젤 각 조건에 대 한 준비가. Monocytes 기증자 당 6 젤에 대 한 (즉, 젤 6 젤 당 104 monocytes x 5.0 = 기부자 당 105 monocytes x 3.0) 포함 하는 필요한 혈 청/절연 지질 M199 미디어의 600 µ L의 최종 볼륨을 resuspended. 셀 (즉, 젤 당 100 µ L = 5.0 x 104 monocytes) 젤에 aliquoted 및 monocyte 환생을 촉진 하기 위하여 1 h 대 위의 incubated 있습니다. 환생, 다음 비 trans...

우리 인간의 내 피 monolayers에 걸쳐 monocytes에 의해 환생 및 거품 세포로 그들의 후속 성숙 측정 프로토콜을 설명 합니다. 이 혈액이 경향이 향상 시킬 수 있는 요인을 평가 하 고 다른 질병 조건 가진 사람에서 격리 하는 monocytes의 atherogenic 속성을 평가 하기 위해 다양 한 메서드를 제공 합니다.

Monocyte 환생 및 개인 만성 염증 성 조건에서 거품 세포 형성의 정량화

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

이 분석의 전반적인 목표는 인간 임상 샘플의 단핵구가 경내피 이동 및 발포 세포 형성을 겪을 수 있는 능력을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 급성 관상 동맥 질환의 위험이 있는 개인의 세포의 동맥 생성 잠재력과 같은 심혈관 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 신선한 전혈 또는 저장된 환자 코호트 모두에서 임상 샘플을 측정할 수 있다는 것입니다.또한 폼 셀 형성은 현미경 검사와 유세포 분석으로 정량화할 수 있습니다. 먼저, 신선한 콜라겐 현탁액에서 중합된 콜라겐 젤을 준비합니다. 5밀리리터 폴리스티렌 튜브에 수산화나트륨을 넣은 다음 M199를 10배, 산성산, 마지막으로 섬유질 콜라겐을 추가합니다.피펫팅으로 잘 섞습니다. 다음으로, 50마이크로리터를 바닥이 평평한 멸균 평평한 96웰 조직 배양 플레이트의 내부 웰로 분취합니다. 우물의 바깥쪽 가장자리에 Dulbecco PBS의 1배인 200마이크로리터를 적재하여 건조를 방지합니다.섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하면 콜라겐이 중합됩니다. 그런 다음 1회 보충된 M199 150마이크로리터를 젤에 오버레이하고 5일 후에 사용할 때까지 필요할 때까지 배양합니다. 저장된 인간 제대 정맥 내피 세포를 확장하기 위해 25제곱센티미터 배양 플라스크에 피브로넥틴 용액 1ml를 준비하고 실온에서 10분 동안 접시를 배양합니다.한편, 저장된 세포를 수조에서 해동하여 M20에 다시 현탁시킵니다. 세포가 해동되면 접시에 남아 있는 피브로넥틴 용액을 흡인하고 세포를 플레이트합니다. 그런 다음 2-3일 후에 미디어를 교체하여 문화를 융합합니다.HUVEC은 배양 5일차에 합류해야 합니다. 플라스크에서 배양액의 상등액을 흡인하여 분리한 다음 1배 PBS의 2-3밀리리터를 사용하여 혈청 함유 매체를 씻어냅니다. 그런 다음 희석된 트립신 5ml를 넣고 실온에서 세포를 잠시 배양하여 세포가 분리될 때까지 부드럽게 흔듭니다.그런 다음 5ml의 M20으로 빠르게 수집하고 현탁액을 10ml 튜브와 원심분리된 셀로 옮깁니다. 이제 M20의 세포를 밀리리터당 200, 000개의 세포로 재현탁합니다. 그런 다음 준비된 콜라겐 플레이트에서 M199를 흡인하고 각 젤에 100마이크로리터의 HUVEC을 추가합니다.3일 동안 문화를 계속하십시오. HUVEC 배양 8일째에 단핵구를 추가하기 전에 단핵구를 활성화합니다. 오버레이 매체를 흡입한 후 각 웰에 100마이크로리터의 인간 TNF-알파 용액을 추가합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 4시간 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 매체를 제거하고 세척 당 100 마이크로 리터의 M199를 사용하여 젤을 두 번 세척하십시오. 이제 100 마이크로리터의 M20에 50, 000개의 새로 분리된 단핵구 또는 정제된 단핵구 subset을 HUVEC 단층에 추가합니다.단핵구를 추가한 후 세포의 순방향 전이가 가능하도록 플레이트를 한 시간 동안 배양합니다. 한 시간 후, 수용액에 형질전환되지 않은 세포를 수집합니다. 웰당 100마이크로리터를 사용하여 두 개의 EGTA 세척제를 풀링하는 것으로 시작합니다.그런 다음 복합 세척 용액을 300G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 회전시킵니다. 상층액을 버리고 30마이크로리터의 PBS에 세포를 재현탁시키고 세포를 계수하여 전방향 전이된 세포의 비율을 결정합니다. 이제 M199로 플레이트 웰을 한 번 세척하고 플레이트 웰에 100마이크로리터의 새 M20을 추가하고 플레이트를 이틀 동안 배양합니다.2일 후, 역형질전환된 세포를 수집하고 세포의 표현형 분석을 진행하기 위해 EGTA 세척 용액에서 비형질전환된 세포를 수집하는 절차를 반복합니다. FACS 분석을 통해 겔 결합 세포를 표현형으로 특성화하려면 섭씨 37도의 콜라겐 D 100마이크로리터를 첨가하고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하여 세포를 소화합니다. 배양 후 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 겔을 침식하고 겔을 완전히 소화할 때까지 20분 더 배양합니다.완전히 소화되면 소화된 복제 겔을 35미크론 나일론 메쉬를 통해 얼음 위의 FACS 튜브에 여과하고 풀링합니다. 이제 여과된 세포를 차가운 FACS 세척 용액으로 한 번 세척합니다. 세포를 원심 분리하고 100마이크로리터의 차가운 세척 용액에 재현탁합니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 FACS 염색 및 분석을 수행합니다. 현미경 검사로 세포를 분석하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 염색합니다. 염색된 세포를 분리하려면 베벨이 바깥쪽을 향하도록 21게이지 바늘을 사용하여 웰에 테두리를 만듭니다.다음으로 젤을 장착하기 위한 슬라이드를 준비합니다. 양면 테이프 스트립에 두 개의 작은 구멍을 뚫은 다음 테이프를 슬라이드에 고정하고 보호 코팅을 제거합니다. 그런 다음 테이프의 각 구멍에 물 한 방울을 추가합니다.그런 다음 핀셋을 사용하여 두 개의 젤을 두 개의 구멍에 부드럽게 옮기고 테이프를 덮습니다. 마지막으로 커버슬립을 테이프에 조심스럽게 부착하고 셀의 시각화를 진행합니다. 형질전환(transmigration) 후, 형질전환되지 않은 세포는 기재된 바와 같이 계수하였다.총 15, 000의 비 전이된 세포는 재기되고, 앞으로 전이의 백분율은 95%이기 위하여 결정되었다더 배양의 48 시간 후에, 12.6%에 도달한 36의 000의 역 전이된 세포는 복구되었다. 겔을 기름 빨간색 O로 염색하면 흰색 화살표로 표시된 거품 세포와 검은색 화살표로 표시된 대식 세포가 드러났습니다. 이러한 단핵구는 기존의 발포세포 유도 모델에서 발포세포 형성을 유도하는 데 사용되는 물질인 형질전환 중에 산화된 LDL로 처리되었습니다.12명의 공여자로부터 얻은 집계 세포 수 데이터를 통해 산화된 LDL을 가진 단핵구의 배양이 단핵구를 네이티브 LDL 또는 M199 배지만 사용하여 배양할 때보다 더 많은 거품 세포 형성을 유도하는 것으로 확인되었습니다. 형질전환 세포는 또한 유세포 분석에 의해 분석되었습니다. dead cells, doublets 및 CD45 negative HUVECs를 배제한 후, 마이그레이션된 세포의 주요 집단을 선택하고 관심 수용체의 평균 형광 강도를 형광 마이너스 1 또는 isotype 대조군 데이터와 비교했습니다.이 동영상을 시청한 후에는 이 분석을 사용하여 인간 임상 샘플에서 단핵구 경내피 이동 및 거품 세포 형성을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간 임상 샘플로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 항상 우수한 실험실 기술을 사용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

석판술으로 새겨져와 PDMS에서 가공 Microfluidic 흐름 여왕님 EC 장애와 염증과 관련된 기능적 결과를 알아내기 위해 적용됩니다. 대표 실험에서는 차등 전단 응력의 능력 시토킨 활성화 EC monolayers에 monocytic 세포 접착을 조절하기 위해이 입증되었습니다.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포입니다. 여기, 우리는 사용하기 쉬운...

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

우리는 내피 세포 단층 내에서 접착 세포의 실제 수를 정량화할 수 있는 시험관 내 방법을 보고합니다.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포의 세포 배양을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 대식세포로의 벌크 분화와 결합된 단핵구의 동결 보존을 활용합니다. 그런 다음 수확된 대식세포를 실험 수행에 필요한 세포 밀도의 배양 웰에 파종할 수 있습니다.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

특정 대상 프로브 질병 (예를 들어, 염증, 감염, 및 tumorigenesis)의 다양 한 종류의 단백질 표정 등의 분자 메커니즘을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 연구에서 우리는 murine 모델 f 4/80 전용 형광 중재 단층 촬영을 사용 하 여 대 장 염의 장 대 식 세포 침투의 양적 차원 단층 평가 설명 합니다.

검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

여기 선물이 monocyte 하위 집합 전체 혈액 cytometry에 의해 특성화에 대 한 프로토콜. 이 하위 게이트 그들의 표현의 표면 마커를 평가 하는 방법을 설명 하 고 (염증 성) M1 및 M2 마커 (염증)의 식 평가의 예를 포함 됩니다.

전체 혈액에 의해 인간 Monocyte 하위 집합의 Flow Cytometry 분석

여기, 우리가 특정 표면 마커 및 공초점 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 흐름 체 외에서 매매 하는 monocyte 부분 모집단을 측정 하는 통합된 프로토콜 제시. 이 프로토콜은 다른 특정 표면 마커를 사용 하 여 다른 백혈구 하위 프로로 뿐만 아니라 순차 모집 단계를 탐험 하 사용할 수 있습니다.

생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

여기에서 우리는 마우스 모형에 있는 혈액 단핵구의 화학전술 활동을 정량화하고, 혈액 단핵구에 영양, 약리학 및 유전 내정간섭의 효력을 평가하고 혈액 단핵구 파생된 대식세포특성화하기 위하여 프로토콜을 제시합니다 단핵구 화학 유도제 단백질-1 (MCP-1)을 사용하여 마우스 모델 - 로드 지하 막 유래 젤 플러그.

생체 내에서 단핵구 화학 적 활동의 정량화 및 혈액 단핵구 유래 대식세포의 특성화

여기에서, 우리는 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 교압 조직 내의 엑스트라 세포 염색 분석체를 모두 사용하여 단세포/대식세포 및 T 세포 하위 세트를 식별하기 위해 상세하고 재현 가능한 유동 세포 측정 프로토콜을 설명하며, 골관절염의 확립된 수술 모델을 활용합니다.

골관절염 모델에서 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 치압 조직 내의 면역 세포 하위 집합의 흐름 세포 분석

학습하세요 단핵구의 혈관내피 이동 및 거품 세포 형성 정량화 방법을. 인간 임상 샘플을 사용하여 심혈관 질환 위험 평가에 활용할 수 있는 이 기법은 현미경 및 유세포 분석으로 세포 변화를 측정합니다.

Monocyte 환생 및 개인 만성 염증 성 조건에서 거품 세포 형성의 정량화

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