Monocyte 환생 및 개인 만성 염증 성 조건에서 거품 세포 형성의 정량화

이 분석의 전반적인 목표는 인간 임상 샘플의 단핵구가 경내피 이동 및 발포 세포 형성을 겪을 수 있는 능력을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 급성 관상 동맥 질환의 위험이 있는 개인의 세포의 동맥 생성 잠재력과 같은 심혈관 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 신선한 전혈 또는 저장된 환자 코호트 모두에서 임상 샘플을 측정할 수 있다는 것입니다.

또한 폼 셀 형성은 현미경 검사와 유세포 분석으로 정량화할 수 있습니다. 먼저, 신선한 콜라겐 현탁액에서 중합된 콜라겐 젤을 준비합니다. 5밀리리터 폴리스티렌 튜브에 수산화나트륨을 넣은 다음 M199를 10배, 산성산, 마지막으로 섬유질 콜라겐을 추가합니다.

피펫팅으로 잘 섞습니다. 다음으로, 50마이크로리터를 바닥이 평평한 멸균 평평한 96웰 조직 배양 플레이트의 내부 웰로 분취합니다. 우물의 바깥쪽 가장자리에 Dulbecco PBS의 1배인 200마이크로리터를 적재하여 건조를 방지합니다.

섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하면 콜라겐이 중합됩니다. 그런 다음 1회 보충된 M199 150마이크로리터를 젤에 오버레이하고 5일 후에 사용할 때까지 필요할 때까지 배양합니다. 저장된 인간 제대 정맥 내피 세포를 확장하기 위해 25제곱센티미터 배양 플라스크에 피브로넥틴 용액 1ml를 준비하고 실온에서 10분 동안 접시를 배양합니다.

한편, 저장된 세포를 수조에서 해동하여 M20에 다시 현탁시킵니다. 세포가 해동되면 접시에 남아 있는 피브로넥틴 용액을 흡인하고 세포를 플레이트합니다. 그런 다음 2-3일 후에 미디어를 교체하여 문화를 융합합니다.

HUVEC은 배양 5일차에 합류해야 합니다. 플라스크에서 배양액의 상등액을 흡인하여 분리한 다음 1배 PBS의 2-3밀리리터를 사용하여 혈청 함유 매체를 씻어냅니다. 그런 다음 희석된 트립신 5ml를 넣고 실온에서 세포를 잠시 배양하여 세포가 분리될 때까지 부드럽게 흔듭니다.

그런 다음 5ml의 M20으로 빠르게 수집하고 현탁액을 10ml 튜브와 원심분리된 셀로 옮깁니다. 이제 M20의 세포를 밀리리터당 200, 000개의 세포로 재현탁합니다. 그런 다음 준비된 콜라겐 플레이트에서 M199를 흡인하고 각 젤에 100마이크로리터의 HUVEC을 추가합니다.

3일 동안 문화를 계속하십시오. HUVEC 배양 8일째에 단핵구를 추가하기 전에 단핵구를 활성화합니다. 오버레이 매체를 흡입한 후 각 웰에 100마이크로리터의 인간 TNF-알파 용액을 추가합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 4시간 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 매체를 제거하고 세척 당 100 마이크로 리터의 M199를 사용하여 젤을 두 번 세척하십시오. 이제 100 마이크로리터의 M20에 50, 000개의 새로 분리된 단핵구 또는 정제된 단핵구 subset을 HUVEC 단층에 추가합니다.

단핵구를 추가한 후 세포의 순방향 전이가 가능하도록 플레이트를 한 시간 동안 배양합니다. 한 시간 후, 수용액에 형질전환되지 않은 세포를 수집합니다. 웰당 100마이크로리터를 사용하여 두 개의 EGTA 세척제를 풀링하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 복합 세척 용액을 300G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 회전시킵니다. 상층액을 버리고 30마이크로리터의 PBS에 세포를 재현탁시키고 세포를 계수하여 전방향 전이된 세포의 비율을 결정합니다. 이제 M199로 플레이트 웰을 한 번 세척하고 플레이트 웰에 100마이크로리터의 새 M20을 추가하고 플레이트를 이틀 동안 배양합니다.

2일 후, 역형질전환된 세포를 수집하고 세포의 표현형 분석을 진행하기 위해 EGTA 세척 용액에서 비형질전환된 세포를 수집하는 절차를 반복합니다. FACS 분석을 통해 겔 결합 세포를 표현형으로 특성화하려면 섭씨 37도의 콜라겐 D 100마이크로리터를 첨가하고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하여 세포를 소화합니다. 배양 후 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 겔을 침식하고 겔을 완전히 소화할 때까지 20분 더 배양합니다.

완전히 소화되면 소화된 복제 겔을 35미크론 나일론 메쉬를 통해 얼음 위의 FACS 튜브에 여과하고 풀링합니다. 이제 여과된 세포를 차가운 FACS 세척 용액으로 한 번 세척합니다. 세포를 원심 분리하고 100마이크로리터의 차가운 세척 용액에 재현탁합니다.

그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 FACS 염색 및 분석을 수행합니다. 현미경 검사로 세포를 분석하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 염색합니다. 염색된 세포를 분리하려면 베벨이 바깥쪽을 향하도록 21게이지 바늘을 사용하여 웰에 테두리를 만듭니다.

다음으로 젤을 장착하기 위한 슬라이드를 준비합니다. 양면 테이프 스트립에 두 개의 작은 구멍을 뚫은 다음 테이프를 슬라이드에 고정하고 보호 코팅을 제거합니다. 그런 다음 테이프의 각 구멍에 물 한 방울을 추가합니다.

그런 다음 핀셋을 사용하여 두 개의 젤을 두 개의 구멍에 부드럽게 옮기고 테이프를 덮습니다. 마지막으로 커버슬립을 테이프에 조심스럽게 부착하고 셀의 시각화를 진행합니다. 형질전환(transmigration) 후, 형질전환되지 않은 세포는 기재된 바와 같이 계수하였다.

총 15, 000의 비 전이된 세포는 재기되고, 앞으로 전이의 백분율은 95%이기 위하여 결정되었다더 배양의 48 시간 후에, 12.6%에 도달한 36의 000의 역 전이된 세포는 복구되었다. 겔을 기름 빨간색 O로 염색하면 흰색 화살표로 표시된 거품 세포와 검은색 화살표로 표시된 대식 세포가 드러났습니다. 이러한 단핵구는 기존의 발포세포 유도 모델에서 발포세포 형성을 유도하는 데 사용되는 물질인 형질전환 중에 산화된 LDL로 처리되었습니다.

12명의 공여자로부터 얻은 집계 세포 수 데이터를 통해 산화된 LDL을 가진 단핵구의 배양이 단핵구를 네이티브 LDL 또는 M199 배지만 사용하여 배양할 때보다 더 많은 거품 세포 형성을 유도하는 것으로 확인되었습니다. 형질전환 세포는 또한 유세포 분석에 의해 분석되었습니다. dead cells, doublets 및 CD45 negative HUVECs를 배제한 후, 마이그레이션된 세포의 주요 집단을 선택하고 관심 수용체의 평균 형광 강도를 형광 마이너스 1 또는 isotype 대조군 데이터와 비교했습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 이 분석을 사용하여 인간 임상 샘플에서 단핵구 경내피 이동 및 거품 세포 형성을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간 임상 샘플로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 항상 우수한 실험실 기술을 사용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.