Name: 단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 학습하세요 고처리량 자동 플랫폼을 활용한 단백질 치료제 생산용 제조 세포주 개발 방법입니다. 유세포 분석과 이미징 기술로 고생산성 클론을 분리 선별하여 안정적이고 재현성 높은 세포주를 확보할 수 있습니다.

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1. 숙주 세포에 transfection <ol><li> 종자 2 X 10 15 ML 성장 매체 (세포핵과 nucleosides와 MEMa (Gibco, 카탈로그 번호 12571) 10 % γ - 반구 특징 태아 소 혈청 (cFBS) (HyClone와 보충 T75 코닝 세포 배양 플라스크 6 CHO - DXB11 전지 카탈로그 번호 SH30071.03) 10 ML / 45 % 포도당 용액 (시그마, 카탈로그 번호 G8769)) transfection 전에 하루 L. </li><li> transfection 당시, 다음과 같이 transfection의 단지를 준비 : <ol class="lalpha"><li> 멸균 microcentrifuge 관에서 혈청없이 성장 매체 800 μl 8 μg DNA를 희석. 부드럽게 섞는다. </li><li> 폴리스티렌 튜브에서 혈청없이 성장 매체 800 μl 40 μl Lipofectamine ™ (Invitrogen 18,324,012)을 희석. </li><li> 희석 Lipofectamine ™의로 희석 DNA를 추가합니다. 부드럽게 섞어 실온에서 30 분 알을 품다. </li></ol></li><li> T75에서 세포의 성장 매체를 제거하고 혈청없이 성장 매체의 6.4 ML로 바꿉니다. 술병에 transfection의 단지의 1.6 ML를 추가합니다. 플레이트 락을하여 부드럽게 섞는다. </li><li> 6 시간 동안 CO 2 배양기에서 37 ° C 세포를 품어. </li><li> 37 술병과 부화 ° 하룻밤 CO 2 배양기에서 C로 성장 매체의 8 ML을 추가합니다. </li><li> 열망으로 매체를 제거하고 플라스크에 신선한 성장 매체를 추가합니다. 하룻밤 CO 2 배양기에서 37 세포 ° C를 품어. </li><li> (MEMa 매체 세포핵 또는 nucleosides없이 (Gibco, 카탈로그 번호 12561) 10 % γ - 반구 dialyzed 태아 소 혈청 (dFBS) (HyClone, 카탈로그 번호 SH30079.03) 10 ML / L 45과 보충 선택 매체와 성장 매체를 교체 % 포도당 용액 (시그마, 카탈로그 번호 G8769)). </li><li> 2-3주에 대한 CO 2 배양기에서 37 세포 ° C를 품어. </li></ol> 2. 유동세포계측법 활성 셀 정렬에 의해 복제 <ol><li> 4 5 분 동안 800 rpm으로 술병과 원심에서 세포를 이동시키다 ° C. </li><li> 1시 20분 희석에 2% 소 혈청 알부민과 찬란 분류 안티 인간 IgG 항체와 보충 선택 배지에서 세포를 Resuspend. </li><li> 15-30분 위해 얼음에 부화 후 차가운 PBS로 두 번 씻는다. 폴리 프로필렌 튜브에 1X PBS로 세포를 Resuspend. </li><li> BD FACSAria ™에서 무균 정렬 준비. 각 물론 200 μl 선택 매체를 포함 96 - 웰 세포 배양 플레이트를 준비합니다. </li><li> 무균 세포와 튜브를로드하고 BD FACSAria ™에 대한 분석, 각각 스테인드와 흠없는 세포에 대한 결과를 기록합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트 (S)에 원하는 형광 염색법 프로필의 단일 세포를 정렬하기 위해 성문과 설정을 설정합니다. <ol class="lalpha"><li> Transfected 세포가 처음 기대 산란 대 측면 뿌리를 기반으로 분석됩니다. 라이브 세포 게이트는 세포의 복잡하거나 세분을 측정 셀의 크기, 측면 산란을 측정 앞으로 산란을 기반으로 이루어집니다. </li><li> 이 게이트 내의 가을 세포는 다음 체육 얼룩에 대해 검사됩니다. PE 부정 게이트는 흠없는 transfected 세포 또는 스테인드 호스트 세포에 대해 설정됩니다. 스테인드 transfected 세포는 FACS에 의한 검사이므로 "높은 PE"게이트는 다음 체육 얼룩에 대한 긍정적인 모든 세포의 상위 5 %를 포괄하는 delineated있다. </li></ol></li><li> 두 주 동안 37 ° C 배양기에서 번호판을 품어. </li></ol> 3. CloneSelect ™ 영상기에 의해 식민지 형성의 문서 일 0, 3 일, 정렬 후 FACS 일 7 일 13 CloneSelect 영상기 ™에서 96 - 웰 플레이트 문서의 식민지 형성. 이미지 문서는 단일 세포에서 유래 클론의 선택을 보장합니다. 그 시점에서 각 우물에 하나의 세포가 있기 때문에이 문서에서 중요한 단계는, 당일 공 측정 올바르게 조정 초점 비행기를 받고있다. 그것은 그 하나의 세포의 이미지가 초점에 그들의 초점을 조정하려고 시도하는 것이 최상의 오해를 할 수있는 것이 매우 중요합니다. 초점 비행기는 접시의 브랜드간에 크게 다를 수 있으며 어쩌면 많은에서 같은 브랜드의 많은 수도 있습니다. 따라서 미리 정해진 초점 비행기 사용해야합니다. 이것은 테스트 마이크로 비즈 또는 사용되는 동일한 많은의 접시에 입금 고밀도 세포에 초점을하여 수행할 수 있습니다. 또는 같은 많은에서 자란 플레이트는 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다. FACS는 정렬 후, 그들은 접시에 위치에 '고정'될 수 있도록, 세포가 이전 이미지 2 시간의 최소 정착하게하는 것도 중요하다. 4. 심사 및 높은 생산성 클론 선정 <ol><li> 수신 96 - 웰 플레이트 분석 문서의 샘플 위치. </li><li> TECAN 자유 에보 (Evo)에 의해 96 - 웰 플레이트 분석에 20 μl 뜨는 (필요시 희석) ® 액체 처리 시스템의 전송 aliquots. 이것은 유연하고 가능한 로봇IC 플랫폼이 다른 자동 세포 배양 작업에 맞게되었습니다. 특별 프로그램은 최상의 활용 및 세포주 개발을위한 자유 에보 (Evo) 로봇 기능을 향상시키기 위해 작성되었습니다. 이 예제는 하나의 식민지로 우물을 샘플링에 대한 CloneSelect ™ 영상기 데이터를 해석하는 TECAN 설정입니다. 다른 프로그램이 필요한 경우 높은 생산 클론을 확장하기 위해 적절한 해석하는 찍은 샘플 dilutions, 카탈로그 및 샘플 수동으로 표시된 접시를 만들기 위해 같은 추가적인 세포 배양 작업을 수행하는 데 필요한 있었다 이러한 프로그램 등 대부분 쉽게 수 384 잘 접시뿐만 아니라, 원래 96 자 형식으로 적용. </li><li> 샘플의 항체 생산은 TECAN 자유 에보 (Evo)에서 엘리사를 (피어스, 록퍼드, IL) 검출 샌드위치 인간 IgG ® 액체 처리 시스템에 의해 분석됩니다. <ol><li> 샘플 및 표준 (인간 골수종 IgG1, 카파가) (시그마, 세인트 루이스, MO) 사전에 바이오 코팅 코트 안티 인간 IgG 분석 플레이트 (BD Biosciences, 산호세, CA)에로드되었습니다. </li><li> 접시 세 PBS에 세척 다음 두 시간 동안 실온에서 incubated했다. </li><li> ImmunoPure의 염소 안티 - 인간 IgG (FC - 감마) - HRP는 (피어스, 록퍼드, IL) 1:2000 희석에서 판에 추가 및 실내 온도에 한 시간 동안 incubated되었습니다. </li><li> 접시는 ABTS 기판을 (피어스, 록퍼드, IL) 추가하기 전에 PBS로 세 번 씻어되었으며 검출을위한 405 nm의 흡광도에서를 사용하여 접시 리더에서 읽을 수 있었다. </li></ol></li><li> 높은 생산성 클론을 선택하고 서스펜션 문화 생산성을 평가합니다. 먹이 - 배치 문화, 전지가 65578이 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) 5 G / L 간장 hydrolyzate (DMV 국제 카탈로그 번호 SE50MAF - University of Florida의, 많은 보충 단백질 무료로 중간 JRH 즉각적인 기회만에 0.3X106 세포 / ML에 주사를했다 수)와 37 incubated ° C 7.5 % CO 2. 문화 계속해서 2g / L의 포도당 (시그마, 카탈로그 번호 G8769, 많은 번호 098K2329) 문화에 포도당 플러스 젖산 농도가 2g / L 이하에 도달하고, 싫증이 MM 글루타민 (Gibco, 카탈로그 번호 25030와 보충했다 글루타민 수준 200 이하에 도달 많은 번호 568177) MG / L (어떡하지 Bioanalyzer로 측정 metabolites). 연방 - 일괄 문화가 14 일 항체 생산에 대한 해고하는 것은 반대 위상 HPLC로 측정되었다. </li><li> 원위치 하이브리드화 (물고기) 5 형광에 의해 후보 클론의 유전 특성. </li></ol> 5. 대표 결과 : 높은 처리량 방법과 클론 항체를 생산 개발의 예제는 그림 1과 그림 2에 표시됩니다. Transfected 세포 수영장은 찬란 레이블 안티 인간 IgG 항체 (그림 1A)와 스테인드 분석 BD FACSAria ™ (그림 1B)에 정렬되었습니다. 96 - 웰 플레이트에 콜로니 형성이 CloneSelect 영상기 ™ (그림 1C)에 몇 군데되었습니다. 세포 배양 뜨는은 단일 군락을 포함 우물에서 샘플과 TECAN 자유 에보 (Evo) ® 액체 처리 시스템 (그림 1D)에 엘리사에 의해 assayed했다. 높은 생산성 클론은 형광 레이블 안티 인간 IgG와 얼룩으로 반영 높은 표면 항체 수준을 전시 세포에서 발견되었습니다. 초기 transfected 세포 수영장의 두 인구, 문화 (그림 2) 관찰되었습니다 먹이 - 배치의 생산성에 막대한 차이에서 발생하는 클론을 비교하면. 높은 표면 항체 표현 (PE 높은)와 세포 인구에서 생성된 상위 2 클론 들어, 특정 생산성 50-70에서 원거리 PG / 휴대폰 / 일. 항체 생산성했습니다 반면 ~ 20 PG / 낮은 표면 항체 표현 (PE 낮은)로 세포 인구에서 생성된 상위 2 클론에 대한 셀 / 일. 또한, FACS 정렬 개발한 셀 라인 수동 liming 희석 (그림 3A)를 통해 복제된 것을 그 이상의 항체 생산과 관련하여보다 안정하고 있습니다. 상단 복제의 구체적인 생산성, 수동 liming 희석에 의해 생성된 "복제 1"~ 30에서 80 세포 doublings에 대한 culturing 후 PCD ~ 10 PCD 하락했다. 반면에, "복제 2"정렬 FACS에 의해 생성되는 상단 subclone은 최소 100 세포 doublings 20 PCD 주변 구체적인 생산성을 유지할 수있었습니다. 원위치 하이브리드화 (물고기)에 형광등에 의해, 우리는 코로 1 표현형의 혼합 인구로 나타났다 (85 ​​%)과 표현형 B (15 %).을 증명 대조적으로, FACS는 (복제 인간 2) 클론을 정렬하는 것은 세포의 99.5 %로,보다 균일한 인구로 보여주 표현형 것으로 판명 (그림 3B). <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. CHO 세포에서 단클론 항체의 생산을위한 제조 셀 라인의 개발. 찬란 분류 안티 인간 IgG 항체로 초기 transfected 세포 수영장) 표면 얼룩. B) 96 - 웰 플레이트에 높은 형광 강도 (PE 높은)와 낮은 형광 강도 (PE 낮은)과 세포 인구의 정렬. C) 식민지를 문서화CloneSelect 영상기 ™에 날로부터 형성이 0 일 13 게시물 시딩. 엘리사에 의해 D) 상영 클론. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 표면 관련된 항체 수준은 세포의 항체 생산과 연결합니다. 높은 낮은 형광 염색법과 클론은 셀 라인으로 개발 및 공급 - 배치 문화에 평가했다 둘 다. 용적 titer하고 구체적인 생산성은 각 인구의 상위 2 클론 사이에 비교했다. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 높은 유전 균질성 및 복제 안정성을 전시 정렬 FACS에서 생성된 클론. 문화 경과 시간 ~ 80 셀 doublings에 대한 배치 문화에 A) 항체 생산 안정성. Δ는 복제는 세포 / 세포에서 잘 2,000 1,000 세포 / 음 500 세포 / 잘 씨앗을 품고 있었다 제한 희석을 통해 생성되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="블랙 트라이앵글" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="검정색 삼각형"> , 클론는 1 셀 / 마저 FACS를 통해 생성되었습니다. B) CHO 세포 염색체에 Transgene 통합 사이트는 현장 하이브리드화에 형광등에 의해 식별됩니다.

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</ol>

이 문서의 저자는 포유 동물 세포 라인에서 단백질 치료제의 대규모 생산이 방법을 사용 머크 &amp; 유한 주식 회사의 직원입니다.

우리는 clonality와 클론의 안정성을 보장하면서 높은 생산성 클론의 고립을 가능하게하고, 의미의 자동화된 생산 세포주 개발 플랫폼을 발표. FACSAria ™ 셀 정렬 뒤에 표면 항체 얼룩의 참여가 높은 항체 생산성과 단일 클론을 취득하는 열쇠입니다. 우리의 결과 및 기타 보고서 2-4 transiently 세포 표면에 표시되는 항체 수준이 세포의 생산성과 잘 상관 것이 좋습니다. 따라서, 플루오레신 - 복합 항체는 멤브레인 관련 제품을 인식하고 높은 생산자의 절연을 지원하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 기자의 유전자와 겔 microdrop 기술의 coexpression은 FACS 6-8으로 높은 생산 클론의 선택을 촉진하는 데 사용되었습니다. FACS를 통해 높은 생산 클론을 분리하는 것 외에도 다른 기술은 동일한 목표를 달성하기 위해 진화합니다. 이들은 높은 생산성 클론을 파악하고 원치 않는 세포, 형광 항체 탐지 시스템을 사용하여 생산 세포 라인의 높은 처리량 검사를 수행 Genetix ClonePix FL 및 StemCell 기술 ClonaCell EasyPick 플랫폼을 제거 microspere 항체 검출 시스템 및 레이저 심사 기술을 사용하여 격자 Bioscience CellSpot 기술을 포함 . 우리는 작업의 용이성, 생산성 및 clonality에 대한 선택도를 결합하기 때문에 표면 관련된 항체 수준에 따라 FACS 복제 방법을 구현하기로 결정했습니다. TECAN 자유 에보 (Evo) ® 액체 처리 시스템의 고용은 크게 훨씬 더 큰 셀 수영장에서 높은 항복 클론에 대한 선택 기회를 제공 심사 처리량을 증가했다. 이러한 HTRF, BioForte 진수, HPLC 등 같은 분석을위한 다른 장비가 높은 제작자를 선택하고 낮은 생산을 심사의 가능한 모든 수단입니다. CloneSelect 영상기 ™와 클론 형성을 추적함으로써, 우리는 디지털 셀 라인 역사를 자랑하는 clonality을 증명하는 데 필요한 문서를 생성. Clonality는 더욱 유전자 염색체에 하나의 transgene 통합 사이트를 특징으로 확인됩니다. 보통 clonality을 보장하기 위해 가져옵니다 subcloning 단계는, 따라서 제거 수 있습니다. 이것은 세포주 개발을위한 시간 4~8주을 저장합니다. 요약에서, 높은 처리량 자동화 플랫폼에 의해 생성된 품질 셀 라인은 높은 생산성, 생산 안정성과 대규모 생산과 현재의 규제 요건에 대한 수요를 충족해야합니다 문서화 세포주 기록을 보여주었다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td></tr><tr><td> BD FACS 아리아 ™ 세포 분류기 </td><td> Bioscience BD </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ 영상기 </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> TECAN 자유 에보 (Evo) ® 액체 처리 시스템 </td><td> Tecan 그룹 </td></tr></tbody></table>

단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

급성장 biopharmaceutical 산업은 마약 공급에 대한 증가하는 요구 사항을 충족하기 위해 매우 효율적이고 안정적​​인 생산 시스템의 신속한 개발을 요구하고 있습니다. 생산 세포 라인의 생성은 전통적으로 노동 집약, 낮은 처리량 및 인적 오류에 취약 수동 작업을 참여하고 있습니다. 우리는 여기서 단백질 치료제의 생산을위한 제조 셀 라인의 개발을위한 통합된 높은 처리량 및 자동화 플랫폼을보고. BD FACS 아리아의 결합 ™ 세포 분류기, CloneSelect ™ 영상기 및 TECAN 자유 에보 (Evo)는 ® 액체 처리 시스템은 높은 처리량 및보다 효율적인 세포 라인 개발 프로세스를 사용할 수 있습니다. 이 작업에서는, 생산 호스트 세포가 먼저 선택 요원과 함께 치료에 이어 관심 1의 유전자를 운반 발현 벡터와 함께 transfected 있습니다. 안정 - transfected 세포는 다음 형광 라벨이 표시된 안티 인간 IgG 항체 물들일 및 유동세포계측법 분석 2-4로 이후 대상입니다. 높은 생산 세포는 형광 강도에 따라 선택되고 BD FACSAria ™에 대한 단일 셀 정렬에 의해 격리됩니다. 단일 셀 단계에서 콜로니 형성이 미세하게 감지되었으며 시간 바퀴 디지털 이미지의 일련 세포주 역사의 설명서 CloneSelect ™ 영상기으로 촬영하고 있습니다. 단일 클론이 형성되면,이 클론은 TECAN 자유 에보 (Evo)에서 수행 엘리사에 의해 생산성 ® 액체 처리 시스템에 상영되었습니다. 약 2,000 - 10,000 클론은 현재 시스템 설정과 함께 작동주기에 따라 검사를하실 수 있습니다. 이 통합 방식은 치료 단클론 항체 (mAb)뿐만 아니라 융합 단백질의 생산에 대한 높은 생산 중국어 햄스터 난소 (CHO) 세포 라인을 생성하는 데 사용되었습니다. 검출 프로브의 종류의 도움으로, 방법은 다른 단백질 치료제를 개발하고 사용할 수있는 다른 생산 호스트 시스템에 적용됩니다. 전통적인 수동 절차 비교, 이런 자동화된 플랫폼은 크게 증가 용량, 보장 clonality, 전자 문서로 셀 라인의 역사에 추적성 및 연산자 오류 훨씬 감소 기회의 장점을 보여주었다.

단백질 치료제 생산을위한 생산 세포주 개발의 높은 처리량, 자동화된 플랫폼은 설명합니다. BD FACS 아리아 세포 분류기의 구현, CloneSelect 영상기 및 TECAN 자유 에보 (Evo) 액체 처리 시스템이 향상 세포주의 품질과 높은 재현성과 세포주 개발에 크게 증가 처리 능력을 보여주었다.

급성장하는 바이오 제약 산업은 증가하는 수요를 충족시키기 위해 고효율의 신뢰할 수 있는 생산 시스템의 신속한 개발을 요구하고 있습니다.

이 프로시저의 전반적인 목표는 클론성과 높은 생산성을 갖춘 바이오 의약품용 제조 세포주를 개발하는 것입니다. 이는 먼저 목적 유전자를 인코딩하는 DNA로 숙주 세포를 형질전환함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 FACS를 통해 고생산성 클론을 분리하고, 이어서 클론 셀렉트 이미저(clone select imager)를 통해 콜로니 형성을 기록하는 것입니다.마지막 단계는 생산성이 높은 클론을 스크리닝하고 선택하는 것입니다. 최종적으로, 역상 HPLC를 통해 연속 배양 및 유가 배양(fed-batch culture)에서의 항체 생산 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법의 시연 영상은 매우 중요한데, 그 이유는 팩트 소팅(fact sorting)과 pcan 80 dgl 단계가 복잡한 설정 과정을 포함하고 있어 학습하기 어렵기 때문입니다. 이에 따라 실험실의 과학자들이 숙주 세포 전이 효과를 위한 형질전환, 콜로니 형성 기록을 위한 Jason Sanders의 소팅, 그리고 Tecan 샘플링을 위한 Russell Kan의 시연을 진행하겠습니다.이 절차를 시작하기 위해, transfection 하루 전 호스트 세포를 15 mL의 성장 배지가 담긴 세포 배양 플라스크에 접종합니다. 세포를 37 °C, 7.5% CO2 배양기에서 배양합니다. 다음 날, transfection complex를 준비합니다. 먼저, 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 8 µg의 DNA를 무혈청 성장 배지 800 µL에 희석하고 부드럽게 혼합합니다. 그다음, 폴리스티렌 튜브에 40 µL의 lipofectamine을 무혈청 성장 배지 800 µL에 희석합니다.희석된 DNA를 희석된 Lipofectamine에 추가합니다. 가볍게 섞어준 후 실온에서 30분 동안 배양하여 형질전환을 위한 숙주 세포를 준비합니다. 세포에서 성장 배지를 제거하고 혈청이 포함되지 않은 성장 배지 6.4 milliliters로 교체합니다.트랜스펙션 복합체 1.6 milliliters를 플라스크에 첨가합니다. 플라스크를 흔들어 부드럽게 혼합합니다. 세포를 이산화탄소 배양기 내 37 °C에서 6시간 동안 배양합니다.6시간 후, 플라스크에 8 mL의 성장 배지를 추가하고 이산화탄소 배양기에서 37 °C로 다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다. 흡입법으로 배지를 제거하고 플라스크에 신선한 성장 배지를 추가합니다. 하룻밤 배양 후, 세포를 다시 하룻밤 동안 배양합니다.성장 배지를 선택 배지로 교체합니다. 이산화탄소 배양기에서 37°C로 2~3주 동안 세포를 배양합니다. 형질전환 후 2~3주가 지나면 유세포 분석 활성 세포 분류법(FACS)을 통한 클로닝이 가능합니다. 플라스크에서 세포를 떼어낸 후 4°C에서 800 RPM으로 5분 동안 원심분리합니다.2% bovine serum albumin이 첨가된 선택 배지에 세포를 재현탁합니다. 그다음 형광 표지된 anti-human IgG 항체를 첨가합니다. 1:20 희석액을 첨가하여 얼음 위에서 15분에서 30분 동안 배양한 후, 차가운 PBS로 두 번 세척하고 폴리프로필렌 튜브 내의 1X PBS에 세포를 재현탁합니다.BD FACS Aria를 이용한 무균 분류를 위해 염색된 세포의 예시가 이 사진에 나와 있습니다. 각 웰에 200 µL의 선택 배지가 담긴 96-웰 세포 배양 플레이트를 준비하십시오. 세포가 든 튜브를 무균적으로 로딩하고 BD FACS Aria로 분석하여, 염색된 세포와 염색되지 않은 세포의 결과를 각각 기록하십시오.원하는 형광 염색 프로필을 가진 단일 세포를 96-웰 플레이트에 분류하도록 게이트와 설정을 지정합니다. 분류 후 0일, 3일, 7일 및 13일째에 플레이트를 37 °C 인큐베이터에서 2주 동안 배양합니다. 고생산성 클론을 스크리닝하고 선택하기 위해, 클론 선택 이미저를 사용하여 96-웰 플레이트 내의 콜로니 형성을 기록함으로써 단일 세포 유래 클론이 선택되었는지 확인합니다. 먼저 수신 96-웰 분석 플레이트의 샘플 위치를 기록합니다. 그런 다음 로봇 액체 핸들링 시스템을 사용하여 20 µL의 상청액 분취액을 96-웰 분석 플레이트의 각 웰로 전송합니다. 샘플 내의 항체 생산량은 샌드위치법으로 분석합니다.액체 핸들링 시스템을 사용하여 다음과 같은 방식으로 Human IgG 검출 ELI SA를 수행합니다. 먼저, 샘플과 표준물을 사전 코딩된 bio coat anti-human IgG 분석 플레이트에 로딩합니다. 플레이트를 상온에서 2시간 동안 배양한 후, PBS로 3회 세척합니다.다음으로 immuno pure goat anti-human IgG HRP를 1:2000 비율로 희석하여 플레이트에 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, 플레이트를 PBS로 3회 세척한 다음 ABTS 기질을 첨가합니다.마지막으로, 플레이트 리더기를 사용하여 405 nanometers의 흡광도로 플레이트를 측정합니다. 이 자동화 플랫폼을 통해, 형광 표지된 anti-human IgG 염색으로 나타나는 세포 표면 항체 수준이 세포의 항체 생산성과 상관관계가 있음을 확인하였습니다. 표면 항체 발현이 높은 세포 집단에서 생성된 상위 2개 클론의 결과에서 볼 수 있듯이, 비생산성은 하루에 세포당 50 내지 70 picograms 범위였습니다.이와 대조적으로, 표면 항체 발현이 낮은 세포 집단으로부터 생성된 상위 2개 클론의 항체 생산성은 하루당 세포당 약 20 picograms였습니다. 또한, FACS sorting을 통해 개발된 세포주는 수동 한계 희석법으로 클로닝된 세포주보다 항체 생산 측면에서 더 안정적이었습니다. 수동 한계 희석법으로 생성된 상위 클론인 clone one의 비생산성은 80회의 세포 분열 배양 후 약 30 PCD에서 약 10 PCD로 감소하였습니다.반면, FACS sorting을 통해 생성된 clone two의 최상위 sub clone은 최소 100회의 세포 분열 동안 약 20 PCD의 비생산성을 유지할 수 있었습니다. 형광 인 시튜 하이브리다이제이션(FISH)을 이용한 세포 염색체 내 외래유전자 삽입 부위 확인 결과, clone one은 phenotype A와 phenotype B가 혼합된 집단임이 밝혀졌습니다. 이와 대조적으로, FACS sorting된 clone은 세포의 99.5%가 phenotype A인 더 균일한 집단으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 치료용 단백질 생산을 위한 제조 세포주 개발 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 단백질 배열의 표현을위한 마이크로 유체 접근 방식을 제시한다. 이 장치는 마이크로 기계 밸브에 의해 제어 반응 챔버의 수천으로 구성되어 있습니다. 마이크로 유체 장치는 microarray 인쇄 유전자 도서관에 결합되어 있습니다. 이러한 유전자 그런 다음 베꼈 및 실험 사용할 준비가 단백질 배열의 결과로, 칩에 번역되어 있습니다.

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우​​ 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

우리는 마이크로 스케일 세포 자극 실험에 자동 세포 배양 및 심문 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 양성 세포의 작은 인구를 자극 분자 분석을위한 해물을 복구하는 간단한 다목적 및 정밀한 컨트롤을 제공합니다. 플랫폼은 물론 귀중한 세포 및 / 또는 시약을 사용하는 연구에 적합합니다.

마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 다목적 자동화 플랫폼

설명된 프로토콜을 통해 실험실은 프로그래밍 가능한 액체 처리 로봇과 96웰 플레이트를 사용하여 최소한의 노동력, 경험 및 장비 투자 비용으로 높은 처리량으로 확장 가능하고 접착력이 있는 줄기 세포 배양을 수행할 수 있습니다.  이 시스템에서 20회 이상 통과한 iPSC는 다능성, 정상 핵형을 유지했으며 심근세포로 분화되었습니다.

로봇 액체 처리 시스템을 사용하여 확장 가능한 96 웰 IPSC 문화 기반 플레이트 및 생산

Microbioreactor 시스템에 다양 한 조건에서 48 병렬 세포 배양의 동시 작업에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 셀 문화 과정, 수확 및 후속 항 체 titer 분석을 설명 합니다.

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자동화는 셀 제조에서 업스케일링 및 비용 관리의 핵심입니다. 이 원고는 소규모 바이오 프로세싱을 위한 완충교환 및 세포 농도 단계를 자동화하기 위한 카운터플로우 원심 세포 처리 장치의 사용을 설명합니다.

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여기에서는 GMP 등급의 용해성 마이크로캐리어를 기반으로 하는 완전 폐쇄형 시스템을 통해 부착 세포의 대규모 제조를 달성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 인간 중간엽 줄기 세포, HEK293T 세포 및 Vero 세포의 배양은 검증되었으며 세포 및 유전자 치료 산업의 수량 요구와 품질 기준을 모두 충족했습니다.

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학습하세요 고처리량 자동 플랫폼을 활용한 단백질 치료제 생산용 제조 세포주 개발 방법입니다. 유세포 분석과 이미징 기술로 고생산성 클론을 분리 선별하여 안정적이고 재현성 높은 세포주를 확보할 수 있습니다.

단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

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