단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

이 절차의 전반적인 목표는 클론성과 높은 생산성을 갖춘 바이오 의약품 제조용 세포주를 개발하는 것입니다. 이는 먼저 숙주 세포에 목적 유전자를 인코딩하는 DNA를 형질전환시킴으로써 수행됩니다. 절차의 다음 단계는 FACS를 통해 고생산성 클론을 분리하는 것이며, 이후 clone select imager를 사용하여 콜로니 형성을 기록합니다.

마지막 단계는 생산성이 높은 클론을 스크리닝하고 선택하는 것입니다. 최종적으로 역상 HPLC를 통해 연속 배양 및 유가식 배양(fed-batch culture)에서의 항체 생산 결과를 확인할 수 있습니다. 이 방법의 시연은 매우 중요한데, 정렬(sorting)과 pcan 80 dgl 단계는 절차가 복잡하여 습득하기 어렵기 때문입니다. 이에 실험실의 다음 연구원들이 숙주 세포 형질전환을 위한 transfection, 콜로니 형성 기록을 위한 Jason Sanders의 정렬 과정, 그리고 tecan 샘플링을 위한 Russell Kan의 시연을 진행하겠습니다.

이 절차를 시작하기 위해, 형질전환 하루 전 호스트 세포를 15 mL의 성장 배지가 담긴 세포 배양 플라스크에 분주합니다. 세포를 37 °C, 7.5% CO2 인큐베이터에서 배양하십시오. 다음 날, 형질전환 복합체를 준비합니다. 먼저 멸균된 마이크로 원심분리 튜브에 8 µg의 DNA를 혈청이 없는 성장 배지 800 µL에 희석하고 부드럽게 혼합합니다. 그다음, 폴리스티렌 튜브에 40 µL의 lip을 혈청이 없는 성장 배지 800 µL에 희석합니다.

희석된 DNA를 희석된 Lipofectamine에 추가합니다. 부드럽게 혼합하고 실온에서 30분 동안 배양하여 형질전환을 위한 숙주 세포를 준비합니다. 세포에서 성장 배지를 제거하고 혈청이 포함되지 않은 성장 배지 6.4 milliliters로 교체합니다.

트랜스펙션 복합체 1.6 milliliters를 플라스크에 추가합니다. 플라스크를 흔들어 부드럽게 혼합합니다. 세포를 이산화탄소 배양기 내 37 degrees Celsius에서 6시간 동안 배양합니다.

6시간 후, 플라스크에 배양액 8 mL를 추가하고 이산화탄소 배양기에서 37 °C로 다음 날까지 밤새 배양합니다. 흡입법으로 배양액을 제거하고 플라스크에 신선한 배양액을 추가합니다. 밤샘 배양 후 세포를 다시 한 번 밤새 배양합니다.

성장 배지를 선택 배지로 교체합니다. 세포를 이산화탄소 배양기 내 37 °C에서 2~3주 동안 배양합니다. 형질전환 후 2~3주가 지나면 유세포 분석 활성 세포 분류법(flow cytometry activated cell sorting)을 통한 클로닝이 가능합니다. 플라스크에서 세포를 떼어낸 후 4 °C에서 800 RPM으로 5분간 원심분리합니다.

2% bovine serum albumin가 첨가된 선택 배지에 세포를 재부유시킵니다. 그런 다음 형광 표지된 anti-human IgG 항체를 첨가합니다. 1:20으로 희석하여 첨가하고 얼음 위에서 15~30분 동안 배양한 후, 차가운 PBS로 두 번 세척하고 폴리프로필렌 튜브에서 1 XPBS로 세포를 재부유시킵니다.

염색된 세포의 예가 이 사진에 나와 있습니다. BD FACS Aria를 이용한 무균 분리(aseptic sort)를 위해, 각 웰에 200 µL의 선택 배지가 담긴 96-웰 세포 배양 플레이트를 준비하십시오. 세포가 들어있는 튜브를 무균적으로 로딩하고 BD FACS Aria로 분석하여, 염색된 세포와 염색되지 않은 세포의 결과를 각각 기록하십시오.

원하는 형광 염색 프로필을 가진 단일 세포를 96웰 플레이트에 분리하도록 게이트와 설정을 설정하고, 해당 플레이트를 37 °C 인큐베이터에서 2주 동안 배양합니다. 세포 분리 후 0일, 3일, 7일, 13일 차에 클론 선택 이미저(clone select imager)를 사용하여 96웰 플레이트 내의 콜로니 형성을 기록함으로써, 스크리닝 및 고생산성 클론 선택을 위해 단일 세포 유래 클론이 선택되었는지 확인합니다. 먼저 수신용 96웰 분석 플레이트의 샘플 위치를 기록합니다. 그런 다음 로봇 액체 핸들링 시스템을 사용하여 20 µL의 상층액 분주액을 96웰 분석 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 샘플 내 항체 생산량은 샌드위치 방식으로 분석합니다.

액체 핸들링 시스템을 사용하여 다음과 같은 방식으로 Human IgG 검출 ELI SA를 수행합니다. 먼저, 샘플과 표준 물질을 미리 코딩된 bio coat anti-human IgG 분석 플레이트에 로딩합니다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, PBS로 3회 세척합니다.

다음으로 immuno pure goat anti-human IgG HRP를 1:2000으로 희석하여 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, 플레이트를 PBS로 3회 세척한 다음 ABTS 기질을 첨가합니다.

마지막으로, 플레이트 리더를 사용하여 405 nanometers의 흡광도에서 플레이트를 측정합니다. 이 자동화 플랫폼을 통해, 형광 표지된 anti-human IgG 염색으로 나타나는 표면 항체 수준이 세포의 항체 생산성과 상관관계가 있음을 확인하였습니다. 표면 항체 발현이 높은 세포 집단에서 생성된 상위 2개 클론에 대해 여기에 나타낸 바와 같이, 비생산성(specific productivity)은 세포당 하루 50 to 70 picograms 범위였습니다.

이와 대조적으로, 표면 항체 발현이 낮은 세포 집단으로부터 생성된 상위 2개 클론의 항체 생산성은 하루당 세포 하나당 약 20 picograms였습니다. 또한, FACS sorting으로 개발된 세포주가 수동 한계 희석법으로 클로닝된 세포주보다 항체 생산 측면에서 더 안정적이었습니다. 수동 한계 희석법으로 생성된 상위 클론인 clone one의 비생산성은 80회 세포 분열 배양 후 약 30 PCD에서 약 10 PCD로 감소했습니다.

반면에, FACS sorting으로 생성된 clone two의 최상위 서브 클론은 최소 100회의 세포 분열 동안 약 20 PCD의 비생산성을 유지할 수 있었습니다. 형광 인시튜 하이브리다이제이션(FISH)을 통해 세포 염색체 내의 트랜스진 통합 부위를 확인한 결과, clone one은 표현형 A와 표현형 B가 섞인 혼합 집단임이 밝혀졌습니다. 이와 대조적으로, FACS sorting된 클론은 세포의 99.5%가 표현형 A인 더 균질한 집단으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 치료용 단백질 생산을 위한 제조용 세포주를 개발하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.