단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

이 절차의 전반적인 목표는 클론성과 높은 생산성을 갖춘 생물학적 제제용 제조 세포주를 개발하는 것입니다. 이는 먼저 숙주 세포에 DNA를 전달하여 관심 유전자를 암호화함으로써 이루어집니다. 절차의 다음 단계는 사실에 의해 고생산 클론을 분리한 다음 클론 선택 이미저에 의한 콜로니 형성을 문서화하는 것입니다.

마지막 단계는 생산성이 높은 클론을 스크리닝하고 선택하는 것입니다. 궁극적으로 역상 HPLC를 통해 연속 및 유가 배치 배양에서 항체 생산을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 비디오. 이 절차에는 복잡한 설정이 포함되어 있기 때문에 사실 분류 및 pcan 80 dgl 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시연이 중요하며, 실험실의 다음 과학자들은 숙주 세포 효과의 transfection을 위한 이러한 절차를 시연하고, 군체 형성 문서화를 위해 Jason Sanders를, 테칸 샘플링을 위해 Russell Kan을 분류합니다.

그리고 Eliza: 형질주입 하루 전에 이 절차를 시작하기 위해, 세포 배양 플라스크에 숙주 세포를 15ml의 성장으로 파종합니다. 보통. 다음 날 섭씨 37도, 7.5% 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 배양하고, 트랜스펙션 복합체를 먼저 8마이크로그램, DNA를 혈청 없이 800마이크로리터의 성장 배지에 부드럽게 혼합하여 부드럽게 혼합하여 희석합니다. 다음으로, 폴리스티렌 튜브에 혈청이 없는 800마이크로리터의 성장 배지에 40마이크로리터의 립을 희석합니다.

희석된 DNA를 희석된 리포펙타민에 첨가합니다. 부드럽게 혼합하고 실온에서 30분 동안 배양하여 transfection을 위해 숙주 세포를 준비합니다. 세포에서 성장 배지를 제거하고 혈청이 없는 6.4ml의 성장 배지로 교체합니다.

1.6 ml의 transfection 복합체를 플라스크에 첨가합니다. 플라스크를 흔들어 부드럽게 섞습니다. 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 6시간 동안 세포를 배양합니다.

6시간 후, 플라스크에 8ml의 성장 배지를 넣고 다음 날 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도의 온도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 흡인에 의해 매체를 제거하고 플라스크에 새로운 성장 배지를 추가합니다. 하룻밤 배양 후 다시 하룻밤 동안 세포를 배양합니다.

성장 배지를 선택 항목으로 교체합니다. 보통. 세포를 섭씨 37도의 이산화탄소 배양기에서 2-3주 동안 배양합니다. transfection된 후 2-3주 후, 세포는 유세포 분석을 통해 플라스크 및 원심분리기에서 제거된 세포를 분류하여 섭씨 4도에서 5분 동안 800RPM으로 클로닝할 수 있습니다.

2% 소 혈청 알부민이 보충된 선택 배지에서 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 형광 표지된 항인간 IgG 항체를 추가합니다. 1-20 희석액을 추가하고 15-30 분 동안 얼음에서 배양 한 다음 폴리 프로필렌 튜브의 XPBS 1 개에서 차가운 PBS 재현탁액 세포로 두 번 세척합니다.

염색된 세포의 예가 이 그림에 나와 있으며, BD 팩스 아리아에서 무균 정렬을 위해 각 웰에 200마이크로리터 선택 배지를 포함하는 96웰 세포 배양 플레이트를 준비합니다. 무균적으로 튜브에 세포를 로드하고 BD 사실을 분석합니다. Aria는 염색된 세포와 염색되지 않은 세포에 대한 결과를 각각 기록합니다.

원하는 형광 염색 프로파일의 단일 세포를 96 Well 플레이트로 분류하도록 게이트 및 설정을 설정하고, 0일차, 3일차, 7일차, 13일차에 섭씨 37도의 인큐베이터에서 플레이트를 2주 동안 배양한 후 클론 선택 이미저의 96 웰 플레이트에서 콜로니 형성을 문서화한 후 단일 세포에서 파생된 클론을 선택하여 높은 생산성을 위해 스크리닝 및 선택합니다. 클론. 받는 96 잘 assay 판에 있는 첫번째 문서 표본 위치. 그런 다음 로봇 액체 취급 시스템을 사용하여 20마이크로리터 상등액의 분취액을 96웰 분석 플레이트의 각 웰로 옮기고 샘플의 항체 생성을 샌드위치로 분석합니다.

Human IgG는 다음과 같은 방식으로 액체 처리 시스템에서 ELI SA를 검출합니다. 먼저, 샘플과 표준물질은 사전 코딩된 바이오 코트 항인간 IgG 분석 플레이트에 로드됩니다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양한 후 PBS를 세 번 세척합니다.

다음 면역 순수 염소 항인간 IgG. HRP를 1 - 2000 희석으로 플레이트에 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 1 시간 후, 플레이트를 PBS로 3 회 세척 한 다음 A BTS 기판을 첨가합니다.

마지막으로, 플레이트는 감지를 위해 405나노미터의 흡광도를 사용하는 플레이트 리더에서 빨간색입니다. 이 자동화된 플랫폼을 사용하여 형광 표지된 항인간 IgG로 염색하여 반사된 표면 항체 수준이 세포의 항체 생산성과 상관관계가 있음을 발견했습니다. 높은 표면 항체 발현을 가진 세포 집단에서 생성된 상위 2개의 클론에 대해 여기에서 볼 수 있듯이, 특정 생산성은 하루에 세포당 50 - 70 피코그램 범위였습니다.

대조적으로, 항체 생산성은 표면 항체 발현이 낮은 세포 집단에서 생성된 상위 2개의 클론에 대해 하루에 세포당 약 20 피코그램이었습니다. 또한, 팩트 분류에 의해 개발된 세포주는 수동 제한 희석을 통해 복제된 세포주보다 항체 생산과 관련하여 더 안정적입니다. 수동 제한 희석에 의해 생성된 상단 클론 클론 1의 비생산성은 80개의 세포 배양을 위해 배양한 후 약 30 PCD에서 약 10 PCD로 떨어졌습니다.

반면에, 팩스 분류 클론 2에 의해 생성된 상위 하위 클론은 최소 100개의 셀 더블링에 대해 약 20 PCD의 특정 생산성을 유지할 수 있었습니다. 형광 제자리 교잡에 의한 세포 염색체의 전이유전자 통합 부위의 확인은 클론 1이 표현형 A와 표현형 B.In 대조의 혼합 집단임을 보여주었으며, 사실 분류된 클론은 표현형 A의 세포의 99.5%를 가진 보다 균질한 집단으로 나타났습니다. 이 비디오를 시청한 후, 치료용 단백질의 보호를 위한 제조 세포주를 개발하는 방법에 대해 잘 이해해야 합니다.