Name: 에서 시냅틱 형광의 자동 부량 C. elegans (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 배우세요 C. elegans에서 시냅스 형광을 자동으로 정량화하는 방법을 통해 신경전달물질 수용체 분포를 분석하고 시냅스 기능을 연구하세요. 이 기법은 단일 샘플에서 수백 개의 시냅스를 신속하게 특성화할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

저자 프로토콜의 개발 지원을위한 A. Benham 감사드립니다. 이 작품은 BAB에 NIH 교부금 NS06747 추진하는 사업

1. 이미징에 대한 웜의 작성 프로토콜의이 세그먼트는 게시 C. 기반으로 elegans 문화 기술 1,2, 그리고이 그림 1에 설명되어있다. <ol><li> NA22 E. 높은 펩톤 NGM 한천 플레이트 (10 ㎝) 씨앗에 벌레를 성장 대장균 박테리아는 거의 굶어까지. immunostaining 경우, 한 접시가 안정적으로 길을 따라 계정 손실을 고려하고, 영상에 대한 웜 (파트 2 참조)을 선택하는 데 사용되는 엄격한 기준, 얼룩 한 개인에 대한 충분한 벌레를 생산합니다. </li><li> 접시에 ddH 2 0 몇 ML를 따르고 의한 수확 웜, 간략하게 소용돌이 치는, 그리고 15 ML 원뿔 튜브 (반복 튜브에 벌레의 대부분을 전송하기 위해 필요한 경우)에 액체를 붓는. 3 분, 1000x g 대한 임상 원심의 펠릿. 뜨는가 잔류 세균을 제거해도 좋다 때까지 ddH 2 O로 1 배 펠릿 씻으십시오. 벌레가 유리에 집착로 supernatants를 제거하는 폴리 프로필렌 전송 pipettes를 사용하여(이 단계 이후부터 그것은 계란 생존의 손실을 방지하기위한 조치 사이의 시간을 최소화하는 것이 중요합니다.) </li><li> 마지막 세척 후 resuspend 웜 펠렛은 5 ML 알칼리성 염소산 용액에 웜 및 릴리스 계란을 lyse합니다. 부드럽게 바위, 약 한 분당 해부 현미경 하에서 튜브를 검사합니다. 벌레의 약 50 %가 (그들은 구부 러와 오픈 깨진 나타납니다) lysed 때, 계란 버퍼, 반전 여러 번으로 맨 위로 튜브를 충전하고, 3 분, 1000x g을 위해 pelleting하여 용해를 종료할 수 있습니다. 용해 시간은 5 분 초과할 수 없습니다. </li><li> 전달 피펫으로 뜨는 제거하고 계란 버퍼와 함께 펠릿 배 씻는다. </li><li> 파편으로부터 계란을 분리하려면 ddH 2 O의 30 % 자당의 쿠션에 흘려 보내곤 : 1.4 단계에서 최종 세척 후 신중 5 ML ddH 2 0에서 뜨는 및 resuspend 펠릿를 제거합니다. ddH 2 O 5 ML 멸균 60 % 자당을 추가하고 잘 섞는다. 임상 원심 분리기로 6 분, 1000x G를 봐. 계란은 (그들이 저기에됩니다 초승달 모양으로 수집합니다) 흐린 모양이 있어요, 파편 펠릿 하겠읍니다. </li><li> 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 최소한의 볼륨에 계란을 빨고 unseeded NGM 한천 플레이트로 전송합니다. 튜브의 측면을 지키는 모든 계란이 부드럽게 아래로 씻어서 잘으로 전송할 수 있습니다. 한 10cm는 분석 스트레인 당 플레이트가 충분 unseeded. </li><li> 20 하룻밤 달걀 (~ 16 시간) ° C.로 unseeded 번호판을 품어 몇 시간 동안 약간 떨어져 뚜껑을 떠나는하여 건조 처음 몇 시간 동안 번호판을 빼낼하지만 하룻밤 사이에 충당해야합니다. </li><li> 부화 후, S의 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는에서 15 ML 원뿔 튜브 (관에 부어, 몇 ML S 플레이트에 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 소용돌이 추가)로 L1의 유충을 전송. 임상 님의 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중 최소 볼륨에서 resuspend 원심 분리기 (3 분, 1000x G), 그리고 NA22 박테리아 놓는 10cm의 NGM 한천 플레이트로 전송에서 펠릿. 1.1 단계에서 각 원본 판은 여기 두 접시를 사용합니다. 벌레가 원하는 연령에 도달할 때까지 알을 품다. </li><li> 한 두 번 하루에 문화를 모니터링합니다. 그들은 위험 O에있는 경우F 굶주리고, 신선한 NA22 플레이트로 전송. 야생 형 N2의 웜 들어, 기아는 동물들이 멀리 식품 고갈 영역에서 실내 masse을 마이 그 레이션으로 번호판을 가로질러 이동하는 벌레의 라인이나 파도의 형성에 의해 선행된다. 이 양식되면, 음식 완전히 몇 시간 이내에 소진됩니다. </li><li> 웜 지금 immunostaining 또는 라이브 이미징을위한 준비가되어 있습니다. 그대로 웜 다수가 쉽게 몇 군데 수 있기 때문에 문제점을 해결하는 서스펜션의 벌레를 더럽히는 것은 최적입니다. 웜 다수가 영상에 필요한되기 때문에 Finney와 Ruvkun 프로토콜 3-6을 바탕으로 염색법 절차는 동결 균열 절차 바람직합니다. </li></ol> 2. 공촛점 이미징 <ol><li> 공촛점 이미징을위한 슬라이드에 벌레를 탑재합니다. microliter 당 몇 백에 벌레의 밀도를 조정합니다. 관련 2퍼센트 아가로 오스의 패드를 만들어 S-기저 (컷 - 오프 25 게이지 바늘로 장착되어 3 ML에 주사기를 통해 적용) 이미징 동안 증발을 방지하기 위해 바셀린의 얇은 고리에 둘러싸여. 를 피펫커버 슬립 진입 웜 정지 몇 microliters은 (영상 라이브 웜 경우 마취제를 사용하여), 그리고 커버 슬립에 아가로 오스 패드를 낮추고, 패드 위에 고르게 웜 확산. </li><li> 이미징에 대한 웜을 선택합니다. ± 45 ° (0 °가 직접 목표 방향으로 지향적인 의미 임)보다 관심이 시냅스는 더 이상의 방사상 변위와 함께 객관적인 렌즈쪽으로 방향 웜을 선택합니다. photobleaching 피하기 위해 (몇 초) 신속하게 이러한 평가를 수행합니다. 초기 문화의 규모는 충분한 웜 이러한 기하학적인 기준을 충족하도록 최적화되어 있습니다. </li><li> 표본의 공촛점 이미징을 완료합니다. 0.4 약 14 μm의 두께 구역 내에 포함하고 있습니다 비교적 평평한 샘플은 최상의 결과를 생산하고 있습니다. 높은 속도, 낮은 해상도 이미지 (512 X 512 픽셀) 급속한 정확한 데이터 수집을위한 충분한입니다. 이것은 형광의 싼 견적을 일으킬하므로 포화에게 과도한 신호 강도와 검출기를 피하십시오신호. </li></ol> 3. 개인 시냅틱 클러스터의 자동 식별 및 분석 <ol><li> 오픈 멀티 TIF 출력 Volocity 4.0 (이상) 소프트웨어 (PerkinElmer)를 사용 공촛점 현미경에서 파일. </li><li> 자르기 떨어진 관심의 구조가 포함되지 않은 이미지의 영역 (이미지 -&gt; 확장 포커스 -&gt; 작업 - - &#39;자유형 투자 수익 (ROI)&#39;도구를 사용하여 관심&gt; 선택 영역 선택으로 돌아가기&gt; 자르기, 그림 2A). 참고 확장 초점은 분석을 돕기 위해 컴퓨터 화면 Z-평면 투영을 생산하지만, 기본 데이터에 영향을주지 않으며 동일, 필요한 경우) 밝기 및 대비 조정을위한 사실이다. </li><li> 선 도구를 사용하여 분석 영역의 길이를 측정합니다. 라인의 길이를 계산하고 데이터 테이블 (그림 2B)에 추가됩니다. </li><li> 필터 (측정 모드) &#39;강도에 의해 객체&#39;를 사용하여 개체를 식별합니다. 시냅스 클러스터가 그러한 한계를 지정강조와 비 시냅스 배경은 (그림 2C)되지 않습니다. 다른 색상으로 표시하는 독립적인 시냅스 마커의 포함은 시냅스를 식별 unambiguously 도움이 될 수 있습니다. 전형적인 시냅스는 몇에서 몇 백 voxels로 다양합니다. 컨트롤 샘플을 사용하여 한번 임계값을 설정하고, 이후의 모든 샘플을 위해 사용합니다. 그것이 실험자 바이어스의 가능성을 소개하기 때문에 각 예제를 Thresholding 것은 별도로 받아 들일수 없죠. 개체가 선택되고 (그림 2D) 자동으로 표로하고 있습니다. </li><li> 정렬 및 데이터를 내보냅니다. 이들은 보통 배경 점들 때문에, 2 개 이하 voxels의 개체를 제거합니다. 이러한 추가적인 필터링에 의해, 또는 후속 분석하는 동안 제거될 수 있습니다. &#39;개체 크기&#39;하여 제거 하류, 다시 정렬 데이터 파일을 촉진하기 때문에 그들은 모두 그룹이 함께합니다. Microsoft Excel 또는 다른 스프레드 시트 프로그램에서 열 수 CSV 형식에서 데이터를 내보냅니다. 각 이미지는 하나의 출력 파일을 생성합니다. </li><li> 만약 Volocity의 소프트도자기를 사용할 수 없습니다, 다른 방법은 3 차원 정보가 손실됩니다 있지만 (토론 참조) (예 : 심판. 7 또는 ImageJ를 사용하여 수동 분석) 활용할 수 있습니다 공촛점 데이터의 Z-비행기 전망을 분석하는 것입니다. </li></ol> 4. 대표 결과 제시 부량 방식은 서로 다른 밝기와 다른 볼륨의 클러스터 인구를 구분할 수 있어야합니다. 그림 3에 제시된 대표 이미지와 해당 양적 데이터는 이러한 매개 변수에 기초하여 차별의 예를 보여줍니다. 일반적으로 결과는 눈에 분명 무엇을 따라야한다. C의 복부 신경 코드를 immunostaining UNC-49 GABA 수용체의 경우 elegans, 모든 동물은 일반적으로 크기와 성숙에 매우 유사한 나타나 다섯 웜의 그룹 (분석 신경 코드의 길이로 정규화)에 대한 총 시냅스 형광 값은 표준 오류를 보여주<html> 평균 4의 약 10 %의 가치. 유전자 돌연변이 및 기타 실험적인 트리 트먼트 (예 : 약물 노출) 볼륨과 강도 가치와 시냅스 클러스터의 주파수 분배뿐만 아니라 변경할 수 있지만, 아마도, 시간 코스와 웜의 synchrony 발달은 높은 변화로 이어지는. 그러나 정량 결과는 항상 오류가 발생하고 다시 thresholding 또는 artefactual 객체의 제거 등 시정 조치를 제안하는 위치를 공개해야 Volocity으로 식별 이미지와 개체의 검사, 시각 및이 아니라면 감상할 수 있습니다 무엇 반영한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig1.jpg" /> 1 그림. 동기식 C.의 작성 elegans 문화. 동기 문화가이 과정에서 얻은되어 있기 때문에 C. elegans 개발 체포 및 식품의 부재에서 L1 애벌레의 무대, 그리고 음식이 소개되었을 때 다시 시작합니다. <html> ove_content &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig2.jpg" /> 그림 2. 시냅스 puncta의 Quantitation. <ol class="ualpha"><li> 이미지의 필요없는 영역은 파일 크기를 줄이고 특이성을 높이기 위해 자른있다. 왼쪽 패널은 이미지를 시작 보여주고, 중간 패널은 선택된 영역을 보여주는, 오른쪽 패널 자르기 후 이미지를 보여줍니다. 빨간 신호가 UNC-49 GABA 수용체 immunofluorescence이며, 녹색 신호가 presynaptic GABA 뉴런 4에서 표현 synaptobrevin-GFP (presynaptic 마커)입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2alarge.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . </li><li> 선 분석되는 신경 코드 세그먼트의 길이를 그려 있으며, 그 길이가 자동으로 결과를 테이블에 기록됩니다. 이 정보는 벌레가 염색법 도중에 조각되어있다면 몇 배 다를 수 analyzable 신경 코드의 길이로 인해 시냅스 데이터를 정상화하는 데 필요합니다.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. </li><li> 임계값은 개별 시냅스 클러스터를 식별하는 데 적용됩니다. 왼쪽 패널 thresholding 전에 이미지를 보여주고, 다른 thresholding 수준의 예제는 별도의 패널 (녹색 신호가 생략)에 표시됩니다. 각 확인된 개체는 색 영역으로 이미지 그려져 있습니다. 가장 왼쪽 패널에서 시각적으로 확연히 시냅스 클러스터와 가장 오른쪽 패널의 컬러 영역 간의 통신을 확인합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2clarge.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . </li><li> 각 확인된 개체는 결과 테이블에 별도로 나열됩니다. 개별 개체가 선택될 수 있으며, 원하는 경우 검사 이미지를 강조 표시됩니다. 저 테이블은 빨간색 ( &#39;rhodamine&#39;)과 녹색 ( &#39;EGFP&#39;) 채널에 대한 정보가 포함되어 있습니다; 객체 였을 때부터 녹색 채널 정보는 잠재적으로 잘못된 것입니다엄격히 적색 형광을 기반으로 밝혀졌습니다. 이 분석은 또한 하나의 컬러 이미지에서 수행됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2dlarge.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig3.jpg" /> 그림 3. 대표 결과입니다. 대표 micrographs 야생 형 C.부터 전에 UNC-49 GABA 수용체에 대해 묻다 elegans ()와 muscimol, 장기 노출 후 downregulated 될 수용체를 일으키는 GABA 수용체 작용제와 (B) 치료 후. 패널은 전 (왼쪽)와 (오른쪽) thresholding과 작은 배경 얼룩의 제거 후 자른 이미지를 보여줍니다. (C)과 같이 표본에 대한 정량 시냅스 매개 변수의 음모 (A)와 (B) : 총 형광 용기는 코드 길이 (왼쪽) 및 누적 확률 histograms 개별 시냅스의 형광 컨텐츠 (가운데)와 시냅스 볼륨 (맞로 정규화T), 작용제 노출 (muscimol-치료를위한 치료, N = 115 시냅스를위한 n은 = 60 시냅스에 의해 유도된 시냅스 내용과 볼륨에서 통계적으로 의미있는 감소를 시연, P &lt;0.001, Kolmogorov - 스미 르 노프 검사 <a href="http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html" target="_blank">http://www.physics.csbsju .edu / 통계 / KS-test.html</a> ).

<ol><li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li>
<li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li>
<li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li>
<li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li>
<li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li>
<li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li>
<li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent%2C+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li>
<li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2%2B+entry+into+the+nerve+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

여기에 제시된 방법은 C.에있는 시냅스의 대규모 인구에 대한 정량 멀티 파라미터 데이터를 추출하도록 설계되었습니다 elegans, 치료 그룹 내에서 일관성을 극대화하면서. 세 가지 특징은 이러한 목적에 기여한다. 첫째, immunostaining 모든 동물들이 같은 나이가되도록 동기 웜 집단에서 수행됩니다. 표현 수준의 발달 규정 실험적 치료의 효과를 흐릿하게 수 있기 때문에이 단계는 중요합니다 (예 : UNC-49 GABA 수용체 immunofluorescence는 동안 몇 배 차이가 개발 (K. 데이비스 외., 준비)). 또한 permeabilization 및 고정은 양적 비교는 어렵 만드는 고도의 변수가 될 수 있습니다. 동기화된 문화권을 사용하면 기술의 신뢰성 향상이 내재된 다양성을 최소화합니다. 이러한 다양성을 해결하는 다른 방법은 내부와 같은 독립적 시각이 될 수 무관한 대상으로 두 번째 항체를 사용하여 포함permeabilization위한 제어하거나 영상이 한꺼번에 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 소프트웨어의 이름 </td><td> 회사 </td><td></td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> Volocity V4.0 이상 </td><td> PerkinElmer / Improvision </td><td></td><td> 이 소프트웨어에 액세스하려면 로컬 이미징 핵심 시설을 확인합니다. 데모 소프트웨어는 PerkinElmer 웹사이트에서 사용할 수 있습니다. 이 방법은 Volocity만을 Quantitation 모듈이 필요합니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 2. 특정 시약 및 장비. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 계란 버퍼 </td><td> NaCl KCl CaCl 2 MgCl 2 HEPES (7.3로 산도를 조절) </td> &lt;TD&gt; 118 MM 48 MM 이 MM 이 MM 24 MM </td></tr><tr><td> 알카라인 차아 염소 산염 (5 ML 용) </td><td> 신선한 가정용 표백제 (30 일 개장 이후 병을 폐기) 10 N NaOH ddH 2 O </td><td> 1.0 ML 0.25 ML 3.75 ML </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 솔루션. </td></tr></tbody></table>

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; c. elegans</em

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

시냅스 강도는 presynaptic 신경 전달 물질 릴리스 행사 postsynaptic 응답의 진폭을 참조하고, 전반적인 신경 회로의 기능에 큰 영향을 미치고 있습니다. 시냅스 강도가 매우 postsynaptic 멤브레인에서 시냅스 사이트에서 클러스터된 신경 전달 물질 수용체의 풍부에 따라 달라집니다. 수용체 레벨이 발달 설립되며, 시냅스 소성 및 neuromodulation의 중요한 메커니즘을 나타내는 표면화된, subsynaptic, 그리고 세포 내 수영장, 사이 수용체 인신 매매에 의해 변경될 수 있습니다. synaptically-화된 신경 전달 물질 수용체 풍요로움을 계량하기위한 엄격한 방법은 시냅스 개발 및 소성을 공부하는 것이 필수적입니다. 그것이 아닌 시냅스 수영장에서 시냅스 구별, 그리고 시냅스의 다른 유형에 지역화된 수용체 인구들 사이에서 차별, 공간 정보를 유지하기 때문에 형광 현미경은 최적의 접근 방식이다. 유전자 모델 생물 Caenorhabditis elegan의은 특히 손상 동물의 네이티브 시냅스의 시험을 수 있도록 작은 크기와 상대의 신경 계통의 단순화, 투명성, 그리고 강력한 유전자 기술의 가용성으로 인해 이러한 연구에 가장 적합합니다. 여기에서 우리는 C.에 fluorescently-라벨이 시냅스 신경 전달 물질 수용체를 quantifying위한 방법을 제시 elegans. 그 주요 기능은 멀티 비행기 공촛점 현미경 출력 파일, tabulating 위치, 볼륨, 형광 강도 및 각 시냅스에 대한 전체 형광 세 차원에서 개별 시냅스의 자동 식별 및 분석입니다. 이 접근법은 공촛점 데이터의 Z-비행기 예측의 수동 분석을 두번 주요 장점이 있습니다. 공촛점 데이터 집합의 모든 비행기가 포함되어 있기 때문에 첫째, 어떤 데이터는 일반적으로 화소 농도의 평균이나 맥시멈을 토대로 Z-평면 투영을 통해 손실되지 않습니다. 시냅스의 둘째, 신분증은 자동이지만, 예전에 의해 검사를 수시냅스 다수의 데이터를 신속하고 정확하게 추출 수 있도록 데이터 분석 진행 등 perimenter. 샘플 당 시냅스 수천 수백 쉽게 큰 데이터를 생산하는 통계 능력을 극대화할 수 설정, 얻을 수있다. C를 준비하기위한 고려 사항 분석 및 치료 그룹 내에서 동물 간의 다양성을 최소화하기 위해 공촛점 이미징을 수행하기위한 elegans도 설명합니다. C를 분석하기 위해 개발된 있지만 elegans postsynaptic 수용체가이 방법은 실제로 synaptically-화된 단백질, 또는 개별 클러스터, puncta 또는 organelles에 현지되는 형광 신호의 모든 유형에 대해 일반적으로 유용합니다. 절차는 세 단계로 수행됩니다 : 1) 표본 2의 준비)를 공촛점 이미징, 그리고 3) 이미지 분석. 단계 1과 2는 C.에만 해당 elegans, 3 단계는 일반적으로 공촛점 micrographs에 작은 반점이있는 형광 신호에 적용할 수있는 동안.

시냅스에서 신경 전달 물질 수용체 클러스터의 풍부한 강력히 시냅스 강도에 영향을 미칩니다. 이 방법에서는 단일 시냅스 해상도로 가로, 세로, 높이로 fluorescently-라벨이 신경 전달 물질 수용체를 quantifies<em&gt; C. elegans</em&gt;, 시냅스 수백이 빠르게 Z-평면 투영에 의해 도입 왜곡없이 하나의 샘플 내에서 특성화 수 있도록.

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

시냅스 강도는 시냅스 전 신경전달물질 방출 사건에 대한 시냅스 후 반응의 진폭을 의미하며, 전반적인 ...에 중대한 영향을 미칩니다.

본 절차의 목적은 가시 신경절 세포(gans) 내 점상 형광 신호의 크기와 밝기를 효율적으로 정량화하는 것입니다. 이를 통해 방대한 양의 객체 군집을 분석할 수 있습니다. 통계적으로 시냅스 단백질을 이미징합니다.본 시연에서 절차의 첫 번째 단계는 관심 있는 ELEGANS의 고밀도 동기화 배양물을 생성하는 것입니다. 다음으로, 이미지 간의 일대일 변동성을 최소화하여 표지된 시냅스의 공초점 이미지를 얻습니다. 시냅스 펑처(puncture)는 자동으로 식별되며 배경 형광과 구분됩니다.마지막 단계는 효율적인 후속 분석을 위해 데이터를 표로 작성하고 정리하는 것입니다. 궁극적으로, 이러한 결과는 실험 조건이 시냅스 단백질이나 고대비 펑처(puncture)에 국소화된 다른 단백질의 분포에 어떻게 영향을 미치는지 정확하게 보여줄 수 있습니다. Zack 투영 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 시냅스 부피를 포함한 모든 데이터가 보존된다는 점이며, 자동화된 식별을 통해 조건당 수백 개의 샘플을 빠르게 수집할 수 있다는 것입니다.본 프로토콜에는 NA 22 E. coli 박테리아가 포함된 10 cm 높이의 펩타이드 NGM 한천 배지 플레이트에서 배양한 성체 C. elegans의 고밀도 배양체가 필요하며, 계획된 각 면역 염색당 정확히 한 개의 플레이트를 준비하십시오. 먼저 수 밀리리터의 물을 사용하여 웜을 수확합니다. 이들을 15 mL 원추형 튜브로 옮기고, 대부분의 웜이 수집될 때까지 이 과정을 반복합니다.웜을 펠렛화하고 상층액이 투명해질 때까지 최대 3회까지 물로 펠렛을 세척하십시오. 이렇게 하면 잔류 박테리아가 제거됩니다. 웜이나 알이 포함되어 있거나 포함되었을 가능성이 있는 용액은 유리관에 달라붙을 수 있으므로 항상 플라스틱 피펫을 사용하여 옮기십시오. 이제 알의 생존력 손실을 방지하기 위해 남은 단계들을 신속하게 진행하는 것이 중요합니다.5 mL의 알칼리성 차아염소산염 용액에 벌레를 넣고 다시 굽혀 알을 방출시킵니다. 튜브를 부드럽게 흔들어 주고, 약 1분마다 해부 현미경으로 관찰하십시오. 5분이 경과하거나, 튜브 내 벌레의 약 절반 정도가 굽혀져 터진 것처럼 보이면 즉시 중단하십시오.튜브의 상단까지 egg buffer를 채우고 여러 번 뒤집어 섞어줍니다. 원심분리를 통해 worm pellet을 형성시킨 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그 다음 egg buffer로 pellet을 세 번 세척합

automated-quantification-of-synaptic-fluorescence-in-c-elegans

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 칼슘 이미징의 개념을 소개하고 성형된 아가로스 웰에 포함된 벌레의 타임 랩스 이미징을 위한 예제 프로토콜을 포함합니다.

칼슘 이미징: 살아있는 예쁜꼬마선충의 신경 활동을 시각화하는 방법

출처: Pigazzini, M. L., et. al. 노화 시 아밀로이드 구조의 특성화 C. 엘레간스 형광 수명 이미징을 사용하여. J. Vis. Exp. (2020). 이 동영상은 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)을 사용하여 C. elegans 뉴런에서 polyQ 단백질 응집을 평가하고 대조군 및 샤페론 단백질 결핍 기생충을 비교하는 방법을 보여줍니다. 샤페론이 결핍된 웜의 응집이 증가하면 군집된 형광단 간의 에너지 전달이 촉진되어 형광 수명이 단축됩니다. FLIM에서 생성된 색상으로 구분된 지도는 이러한 차이를 묘사하여 실험 그룹 간의 집계 수준을 강조합니다.

Caenorhabditis elegans 뉴런에서 PolyQ 단백질 응집의 형광 수명 이미징

작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의...

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

여기에 우리가 수와 초파리의 광 수용체의 시냅스 활성 영역의 공간적 분포를 정량화하는 방법을 보여, 유전자 인코딩 된 분자 마커 강조하고, 빛에 장시간 노출 후 자신의 변조.

의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

여기, 우리는 넓은-범위 식이 제한 유전자 발현 및 수명에 관련 된 프레임 워크 제시. 우리는 넓은-범위 식이 제한 및 유전자 발현이이 패러다임에서의 양적 이미징에 대 한 프로토콜 설명합니다. 우리는 더 이상 음식 감지에 관여 유전자 회로의 정보 처리 기능 기본 공개 전산 분석 개요.

C. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화

이 연구는 자유롭게 사용할 수있는 이미지 처리 도구를 사용하여 C. elegans에서 시냅스 크기와 현지화, 근육 형태 및 미토콘드리아 모양의 정량적 측정을 설명합니다. 이 접근은 C. elegans에 있는 미래 연구 결과가 유전 돌연변이 결과로 조직과 세포기관 구조 변경의 넓이를 정량적으로 비교하는 것을 허용합니다.

예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법

반복-관련 비-ATG 의존적 번역 제품은 여러 반복 확장 기반 질병의 새로운 병원성 특징이다. 기재된 프로토콜의 목적은 모델 시스템 C. elegans에서행동 및 세포 분석술을 사용하여 이들 펩티드에 의한 독성을 평가하는 것이다.

C. 예쁜꼬마선충에서 RAN 펩타이드 독성 측정

이 프로토콜은 막 에바인딩 exophers의 형태로 C. elegans 세포에 의해 생성된 큰 골체 및/또는 세포기관 압출(~4 μm)의 검출 및 수량에 대한 접근 법을 설명합니다. 우리는 이 파편 추방 기계장치의 해부를 용이하게 하는 데 필요한 긴장, 성장 조건, 채점 기준, 타이밍 및 현미경 고려 사항을 설명합니다.

C. 예르간에서 큰 Exopher 소포에서 생체 신경 골집 및 세포구 압출에서 득점에 대한 정량적 접근

다음 프로토콜은 프로테오스타시스의 변화 평가로서 폴리글루타민 응집체를 정량화하기 위한 웜 배양, 형광 이미징 및 자동화된 이미지 처리를 위한 고처리량 워크플로우의 개발 및 최적화를 설명합니다.

Caenorhabditis elegans의 집계 정량화 자동화

이 논문은 살아있는 선충에서 단일 뉴런 해상도로 내인성 표지된 화물의 축삭 수송을 시각화하기 위한 형광 현미경 획득 매개변수의 최적화에 대해 설명합니다.

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo(내인성 화물의 축삭 수송 시각화 최적화)는 Living Caenorhabditis elegans에서 형광 현미경을 이용합니다.

여기에서는 ImageJ와 같은 이미지 분석 소프트웨어에서 후속 사용을 위해 광시야 현미경 이미지에서 개별 웜의 자동 분할을 위해 개발한 딥 러닝 시스템인 SegElegans를 효과적으로 활용하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 온라인과 오프라인 모두에서 시스템을 사용할 수 있는 방법을 제공합니다.

SegElegans를 사용한 C. elegans 형광 이미지의 자동 분석

배우세요 C. elegans에서 시냅스 형광을 자동으로 정량화하는 방법을 통해 신경전달물질 수용체 분포를 분석하고 시냅스 기능을 연구하세요. 이 기법은 단일 샘플에서 수백 개의 시냅스를 신속하게 특성화할 수 있습니다.

에서 시냅틱 형광의 자동 부량

더 많은 동영상 탐색