에서 시냅틱 형광의 자동 부량 C. elegans

이 절차의 목적은 gans에서 반점 형광 신호의 치수와 밝기를 효율적으로 정량화하는 것입니다. 따라서 많은 개체군을 분석할 수 있습니다. 통계적으로 시냅스 단백질이 이미지화됩니다.

이 시연에서 절차의 첫 번째 단계는 관심 ELEGANS의 고밀도 동기화 배양을 생성하는 것입니다. 다음으로, 이미지로부터 1:1 변동성을 최소화하는 라벨링된 시냅스의 컨포칼 이미지를 얻습니다. 시냅스 천자는 자동으로 식별되어 배경 형광과 구별됩니다.

마지막 단계는 효율적인 다운스트림 분석을 위해 데이터를 표로 만들고 구성하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 실험 조건이 시냅스 단백질 또는 고대비 천자에 국한된 다른 단백질의 분포에 어떤 영향을 미치는지 정확하게 보여줄 수 있습니다. Zack 투영 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 시냅스 볼륨을 포함한 모든 데이터가 보존되고 자동 식별을 통해 조건당 수백 개의 샘플을 빠르게 수집할 수 있다는 것입니다. 테스트.

이 프로토콜은 NA 22 e 대장균의 10cm 높은 펩타이드 NGM 한천 플레이트에서 자란 성체 CL egan's worms의 고밀도 배양이 필요하며, 계획된 각 면역학적 염색에 대해 정확히 하나의 플레이트를 준비해야 합니다. 벌레와 몇 밀리리터의 물을 수확하는 것으로 시작하십시오. 15ml 원뿔형 튜브에 넣고 대부분의 벌레가 수집될 때까지 이 과정을 반복합니다.

벌레를 펠렛으로 만들고 supnate가 투명해질 때까지 펠릿을 물로 최대 3회 씻습니다. 이것은 잔류 박테리아를 제거하고, 유리에 달라붙을 수 있으므로 플라스틱 피펫으로 벌레나 알을 포함할 수 있거나 포함할 수 있는 용액을 항상 전달합니다. 이제 난자 생존력 손실을 방지하기 위해 나머지 단계를 신속하게 진행하는 것이 중요합니다.

5ml의 알칼리성 차아염소산염 용액에 다시 구부려 벌레의 알을 풀어줍니다. 튜브를 부드럽게 흔들고 1분에 한 번 정도 해부 현미경으로 검사합니다. 5분 후, 또는 튜브 안에 있는 벌레의 절반 정도가 구부러지고 부러진 것처럼 보입니다.

튜브에 계란 완충액을 끝까지 채우고 여러 번 뒤집습니다. 거짓말을 펠릿으로 만든 후 벌레는 흡인하여 수프 natant를 버립니다. 그런 다음 계란 완충액으로 펠릿을 세 번 씻습니다.

세척 후 Reese는 펠릿을 5 밀리리터의 물에 현탁시킨 다음 5 밀리리터의 멸균 물질을 첨가합니다.60 % 물에 자당을 잘 섞습니다. 현탁액을 펠릿으로 만든 후 알은 반월판에 있고 탁하게 보입니다.

각 난자 수집을 파종되지 않은 자체 10cm NGM 한천 플레이트로 옮기십시오 물은 X를 플레이트에 헹구는 데 사용할 수 있지만 옮겨지는 액체의 양을 최소화하십시오. 처음 몇 시간 동안은 섭씨 20도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 뚜껑을 약간 열어 접시를 환기시키되 밤새 덮어야 합니다.

부화 후 L 1 유충을 S 바질로 채워진 15mm 원추형 튜브로 옮깁니다. L을 펠렛으로 만들고 최소한의 S 바질로 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 각 L 1 컬렉션을 NA 22 박테리아가 파종된 두 개의 10cm NGM 한천 플레이트로 나눕니다.

하루에 한두 번 배양을 모니터링하십시오. 그들이 굶어 죽을 위험에 처해 있다면. 굶어 죽기 전에 신선한 NA 22 접시로 옮기고 N형 두 개의 집결 라인을 이 접시의 음식 고갈 영역에서 물결처럼 함께 움직이면 음식은 몇 시간 내에 완전히 고갈됩니다.

기생충이 원하는 나이에 도달하면 면역 염색 또는 라이브 이미징을 통해 기생충을 장착할 준비가 됩니다. 컨포칼 이미징용. Antifa 마운팅 미디어를 사용하여 밀도를 마이크로리터당 수백 개의 웜으로 조정합니다.

경험을 통해 이 밀도는 서스펜션의 탁도에 의해 인식될 수 있습니다. 이상적으로는 웜이 현미경 슬라이드에 빽빽하게 채워지지만 과도하게 겹치지 않는 것이 좋습니다. 슬라이드에서 얇은 바셀린 링으로 둘러싸인 ESP 바질에 2%aros 패드를 만듭니다.

이미징 중 증발을 방지하려면 컷오프 25 게이지 바늘이 장착된 3ml 주사기를 통해 바셀린을 바르십시오. 이제 웜의 전단을 방지하기 위해 끝 컷오프가 있는 피펫 팁을 사용하여 웜 현탁액의 몇 마이크로리터를 커버 슬립에 피펫으로 피펫하고 어그로 로즈 패드를 커버 슬립 위로 내려 현미경 아래의 패드 위에 웜을 고르게 펴 놓습니다. 관심 시냅스는 렌즈의 45도 또는 렌즈를 직접 향하도록 방향을 지정해야 합니다.

사진 표백을 피하기 위해 몇 초를 투자하십시오. 배양과 조건은 복삭이 대물렌즈를 직접 향하는 이상적인 방향으로 여기에 표시된 이 엄격한 기준을 충족하기에 충분한 벌레를 제공해야 합니다. 이 다음 것은 복삭이 대물렌즈에서 직접 반대 방향을 향하고 있기 때문에 거부됩니다.

이 표본에서 수정체를 향하는 등삭이 어떻게 더 선명하게 초점이 맞춰진 이미지를 생성하는지 주목하십시오. 다음은 등쪽과 배쪽이 벌레의 가장자리를 향하고 있기 때문에 거부되는 또 다른 것입니다. 따라서 여기광과 방출광은 더 많은 벌레 조직을 통과해야 하고 왜곡될 수 있습니다.

주요 과제는 치료 그룹 연령 동기화 내의 변동성을 최소화하는 것이며, 관심 구조가 대물렌즈를 직접 향하는 웜을 선택하는 것이 많은 도움이 될 수 있습니다. 큰 배양으로 시작하면 최대한의 일관성을 위해 웜 선택의 폭이 넓어집니다. 최상의 이미징 결과를 얻으려면 14개 이하의 스택 내에 포함될 수 있는 비교적 평평한 샘플을 선택하십시오.

0.4 미크론 두께의 섹션. 고속, 저해상도 이미지만으로도 빠르고 정확한 데이터 수집이 가능합니다. 과도한 신호 강도로 검출기를 포화시키면 형광 신호가 과소평가될 수 있으므로

이 데모에서는 버전 4.0 이상이어야 하는 상용 소프트웨어 패키지 속도를 사용합니다. 많은 대체 소프트웨어 선택은 3차원 정보를 잃게 됩니다. 컨포칼 현미경에서 multi tiff 출력 파일을 연 후 이미지를 선택한 다음 확장 초점을 선택한 다음 자유형을 선택합니다.

ROI는 이제 관심 있는 구조를 포함하지 않는 이미지 영역을 잘라냅니다. 활성화된 도구를 사용하여 확장 초점은 ROI 선택을 용이하게 하기 위해 Z 평면 투영을 제공합니다. 이는 기본 데이터에는 영향을 주지 않습니다.

마찬가지로, 밝기 및 대비 조정은 기본 데이터에 영향을 주지 않습니다. 작업을 선택하고 선택 항목으로 잘라 자르기를 마칩니다. 다음으로, 분석된 영역의 길이를 측정합니다.

선 도구를 사용하여 선의 길이가 계산되어 데이터 테이블에 추가됩니다. 이제 측정 모드에서 강도 필터로 객체를 식별하십시오. 고유한 색상으로 표시된 독립적인 시냅스 마커를 포함하면 시냅스를 명확하게 식별하고, 시냅스 클러스터가 강조 표시되고 시냅스 배경이 아닌 시냅스 배경이 강조되지 않도록 임계값을 지정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

대조군 샘플을 사용하여 이 작업을 한 번만 수행하고 모든 후속 샘플에 사용하면 실험자 편향이 발생할 수 있으므로 각 샘플을 개별적으로 임계값을 설정하는 것은 허용되지 않습니다. 개체가 자동으로 선택되고 표로 작성됩니다. 일반적인 시냅스는 데이터를 내보내기 전에 몇 개에서 수백 개의 복셀까지 다양하며 개체 크기별로 데이터를 정렬합니다.

이렇게 하면 복셀이 두 개 이하인 물체의 다운스트림 제거가 쉬워지며, 이는 일반적으로 배경 사양일 뿐입니다. 이제 모든 스프레드시트 프로그램에서 열 수 있는 CSV 형식으로 데이터를 내보냅니다. 각 이미지는 하나의 출력 파일을 생성하여 49개의 GABA 수용체에 표시되는 CL gans 복부 신경삭의 현미경 사진을 정렬하고 내보내기 위해 설명된 프로토콜로 생성되었습니다.

모든 동물은 크기와 성숙도가 매우 비슷해 보였다. 5개의 벌레에 대한 총 시냅스 형광 값을 정규화하여 신경삭의 길이를 분석했습니다. 이 데이터는 평균의 약 10%의 표준 오차 값을 보여주었습니다.

왼쪽 이미지는 임계값 및 배경 사양 제거가 없는 원시 이미지입니다. 시냅스는 GABA 수용체 작용제인 mus carmal로 치료하여 장기간 노출 후 수용체가 하향 조절되도록 합니다. 총 형광을 정량화하고 신경삭 길이 누적 확률로 정규화했습니다.

개인의 히스토그램, 시냅스 형광 함량을 계산했습니다. 시냅스 부피에 대해서도 동일하게 계산되었습니다. 이러한 측정은 작용제 노출이 시냅스 함량과 부피를 크게 감소시킨다는 것을 보여줍니다.

전반적으로 정량적 결과는 항상 시각적으로 감상할 수 있는 것을 반영해야 합니다. 그렇지 않은 경우 속도로 식별된 이미지 및 물체를 검사하면 오류가 발생한 위치를 드러내고 이 절차를 시도하는 동안 임계값 설정 또는 아티팩트 제거와 같은 수정 작업을 제안해야 합니다. 가능한 경우 블라인드 스코어링이 적극 권장되는 경우 이미지 품질에 대한 주관적인 평가보다는 기하학적 방향이 어떻게 되어 있는지에 따라 이미징을 위해 웜을 선택하는 것이 중요합니다.