에서 시냅틱 형광의 자동 부량 C. elegans

본 절차의 목적은 가시 신경절 세포(gans) 내 점상 형광 신호의 크기와 밝기를 효율적으로 정량화하는 것입니다. 이를 통해 방대한 양의 객체 군집을 분석할 수 있습니다. 통계적으로 시냅스 단백질을 이미징합니다.

본 시연에서 절차의 첫 번째 단계는 관심 있는 ELEGANS의 고밀도 동기화 배양물을 생성하는 것입니다. 다음으로, 이미지 간의 일대일 변동성을 최소화하여 표지된 시냅스의 공초점 이미지를 얻습니다. 시냅스 펑처(puncture)는 자동으로 식별되며 배경 형광과 구분됩니다.

마지막 단계는 효율적인 후속 분석을 위해 데이터를 표로 작성하고 정리하는 것입니다. 궁극적으로, 이러한 결과는 실험 조건이 시냅스 단백질이나 고대비 펑처(puncture)에 국소화된 다른 단백질의 분포에 어떻게 영향을 미치는지 정확하게 보여줄 수 있습니다. Zack 투영 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 시냅스 부피를 포함한 모든 데이터가 보존된다는 점이며, 자동화된 식별을 통해 조건당 수백 개의 샘플을 빠르게 수집할 수 있다는 것입니다.

본 프로토콜에는 NA 22 E. coli 박테리아가 포함된 10 cm 높이의 펩타이드 NGM 한천 배지 플레이트에서 배양한 성체 C. elegans의 고밀도 배양체가 필요하며, 계획된 각 면역 염색당 정확히 한 개의 플레이트를 준비하십시오. 먼저 수 밀리리터의 물을 사용하여 웜을 수확합니다. 이들을 15 mL 원추형 튜브로 옮기고, 대부분의 웜이 수집될 때까지 이 과정을 반복합니다.

웜을 펠렛화하고 상층액이 투명해질 때까지 최대 3회까지 물로 펠렛을 세척하십시오. 이렇게 하면 잔류 박테리아가 제거됩니다. 웜이나 알이 포함되어 있거나 포함되었을 가능성이 있는 용액은 유리관에 달라붙을 수 있으므로 항상 플라스틱 피펫을 사용하여 옮기십시오. 이제 알의 생존력 손실을 방지하기 위해 남은 단계들을 신속하게 진행하는 것이 중요합니다.

5 mL의 알칼리성 차아염소산염 용액에 벌레를 넣고 다시 굽혀 알을 방출시킵니다. 튜브를 부드럽게 흔들어 주고, 약 1분마다 해부 현미경으로 관찰하십시오. 5분이 경과하거나, 튜브 내 벌레의 약 절반 정도가 굽혀져 터진 것처럼 보이면 즉시 중단하십시오.

튜브의 상단까지 egg buffer를 채우고 여러 번 뒤집어 섞어줍니다. 원심분리를 통해 worm pellet을 형성시킨 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그 다음 egg buffer로 pellet을 세 번 세척합니다.

세척 후, Reese는 펠릿을 5 mL의 물에 현탁시킨 다음, 멸균된 60% sucrose 수용액 5 mL를 추가하여 잘 섞어줍니다. 현탁액을 원심분리하여 펠릿화하면, 알들이 메니스커스(meniscus) 위치에 모여 뿌옇게 보일 것입니다.

각각의 알 수집물을 씨를 뿌리지 않은 10 centimeter NGM Agar 플레이트에 옮깁니다. X를 플레이트로 헹구어 낼 때 물을 사용할 수 있으나, 옮기는 액체의 양은 최소화하십시오. 처음 몇 시간 동안은 20 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 배양합니다. 뚜껑을 약간 열어두어 플레이트를 통기시키되, 하룻밤 동안은 반드시 덮어두십시오.

부화 후, L1 단계 유충을 S basil이 채워진 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. L1 유충을 원심 분리하여 펠렛(pellet)으로 만든 다음, 최소량의 S basil에 재부유시킵니다. 그런 다음 각 L1 수집물을 NA 22 박테리아가 도말된 두 개의 10 centimeter NGM agar 플레이트에 나누어 분주합니다.

배양 상태를 하루에 한두 번 확인하십시오. 영양 부족 위험이 있는 경우, 배양액이 고갈되기 전에 신선한 NA 22 플레이트로 옮기십시오. N2 유형의 수집선들이 형성되어 식품이 고갈된 구역으로부터 파도처럼 함께 이동하며, 이러한 플레이트에서는 몇 시간 내에 영양분이 완전히 고갈됩니다.

벌레가 원하는 연령에 도달하면, 면역 염색이나 생체 이미징을 위해 벌레를 마운팅할 준비가 된 것입니다. 공초점 이미징의 경우, Antifa 마운팅 매질을 사용하여 밀도를 마이크로리터당 수백 마리의 벌레가 되도록 조정하십시오.

경험이 쌓이면 현탁액의 탁도를 통해 이 밀도를 인식할 수 있습니다. 이상적으로는 벌레들이 현미경 슬라이드 위에 조밀하게 배치되되, 과도하게 겹치지는 않아야 합니다. 슬라이드 위에 바세린으로 얇은 링을 만든 후, 그 안에 ESP basil에 희석된 2%aros 패드를 만듭니다.

이미징 중 증발을 방지하기 위해, 끝을 자른 25 gauge 바늘을 장착한 3 mL 주사기로 바세린을 도포하십시오. 그다음, 벌레의 전단 응력을 방지하기 위해 끝을 자른 피펫 팁을 사용하여 벌레 현탁액을 몇 µL 커버슬립 위에 분주하고, 아가로스 패드를 커버슬립 위에 내린 뒤 현미경 하에서 벌레가 패드 위에 고르게 퍼지도록 하십시오. 관심 대상인 시냅스는 렌즈를 정면으로 향하거나 렌즈와 45도 이내의 각도로 위치해야 합니다.

광탈색을 방지하기 위해 이 과정에 몇 초간 시간을 할애하십시오. 배양 및 조건 설정은 여기 예시로 제시된 이상적인 방향, 즉 복측 신경삭이 대물렌즈를 직접 향하고 있는 엄격한 기준을 충족할 만큼 충분한 수의 벌레를 제공해야 합니다. 다음의 경우는 복측 신경삭이 대물렌즈 반대편을 향하고 있으므로 제외됩니다.

이 표본에서 렌즈를 향해 방향이 잡힌 등쪽 끈(dorsal cord)이 더 선명하게 초점이 맞은 이미지를 생성하는 점에 주목하십시오. 여기 등쪽 끈과 배쪽 끈이 벌레의 가장자리에 위치하여 거부될 만한 또 다른 사례가 있습니다. 이 경우 들뜸 빛과 방출 빛이 더 많은 벌레 조직을 통과해야 하므로 왜곡이 발생하게 됩니다.

주요 과제는 처리군 내의 변동성을 최소화하는 것이며, 연령 동기화와 관심 구조가 대물렌즈를 향해 직접적으로 배치된 벌레를 선택하는 것이 큰 도움이 될 수 있습니다. 대량 배양으로 시작하면 일관성을 최대화하기 위해 선택할 수 있는 벌레의 수가 늘어납니다. 최상의 이미징 결과를 얻으려면 14장 이하의 스택 내에 포함될 수 있는 비교적 평평한 샘플을 선택하십시오.

0.4 micron 두께의 절편입니다. 신속하고 정확한 데이터 수집을 위해서는 고속의 저해상도 이미지로도 충분합니다. 과도한 신호 강도로 인해 검출기가 포화되지 않도록 주의하십시오. 이는 형광 신호의 과소평가를 초래할 수 있습니다.

본 시연에서는 상용 소프트웨어 패키지인 velocity를 사용하며, 버전은 최소 4.0 이상이어야 합니다. 많은 대체 소프트웨어들은 3차원 정보를 손실시키는 경향이 있습니다. 공초점 현미경에서 출력된 multi tiff 파일을 연 후, image를 선택하고, extended focus를 거쳐 freehand를 선택하십시오.

이제 ROI를 사용하여 관심 구조가 포함되지 않은 이미지 영역을 잘라냅니다. 활성화된 도구를 사용하여 확장 초점(extended focus) 기능을 이용하면 Z 평면 투영이 제공되어 ROI 선택이 쉬워집니다. 이는 기본 데이터에 영향을 주지 않습니다.

마찬가지로, 밝기와 대비 조정은 기본 데이터에 영향을 주지 않습니다. 'actions'에서 'crop to selection'을 선택하여 자르기를 완료하십시오. 그다음, 분석된 영역의 길이를 측정하십시오.

선 도구를 사용하여 선의 길이를 계산하고 데이터 표에 추가합니다. 이제 측정 모드에서 강도별 객체 필터를 사용하여 객체를 식별하십시오. 고유한 색상으로 표지된 독립적인 시냅스 마커를 포함하면 시냅스를 명확하게 식별하는 데 도움이 될 수 있으며, 시냅스 클러스터는 강조되고 시냅스가 아닌 배경은 강조되지 않도록 임계값을 설정하십시오.

대조군 샘플을 사용하여 이 과정을 단 한 번만 수행하고 이를 모든 후속 샘플에 적용하십시오. 각 샘플을 개별적으로 임계값 처리하는 것은 실험자의 편향을 유발할 가능성이 있으므로 허용되지 않습니다. 객체는 자동으로 선택되어 표로 작성됩니다. 일반적인 시냅스는 수 개에서 수백 개의 voxel 범위이며, 데이터를 내보내기 전에 객체 크기별로 데이터를 정렬하십시오.

이렇게 하면 보통 배경 노이즈인 2 voxels 이하의 객체들을 사후에 쉽게 제거할 수 있습니다. 이제 데이터를 모든 스프레드시트 프로그램에서 열 수 있는 CSV 형식으로 내보내십시오. 각 이미지당 하나의 출력 파일이 생성되며, 설명된 프로토콜을 통해 49개의 GABA 수용체가 나타난 CL gans 복신경삭의 현미경 사진들을 분류하고 내보낼 수 있습니다.

모든 동물들의 크기와 성숙도는 매우 유사하게 나타났습니다. 5마리 벌레의 총 시냅스 형광 값을 분석된 신경삭의 길이로 정규화하였습니다. 이 데이터는 평균의 약 10%에 해당하는 표준 오차 값을 나타냈습니다.

왼쪽 이미지는 임계값 설정 및 배경 스펙트럼 제거를 거치지 않은 원본 이미지입니다. 시냅스는 장시간 노출 시 수용체의 하향 조절을 유도하는 GABA 수용체 작용제인 mus carmal로 처리되었습니다. 전체 형광 강도를 정량화하고 신경삭 길이 누적 확률에 대해 정규화하였습니다.

개별 시냅스의 형광 함량에 대한 히스토그램을 산출하였습니다. 시냅스 부피에 대해서도 동일하게 산출하였습니다. 이러한 측정 결과는 작용제 노출이 시냅스 함량과 부피를 유의하게 감소시킴을 보여줍니다.

전반적으로, 정량적 결과는 항상 시각적으로 확인 가능한 내용을 반영해야 합니다. 그렇지 않은 경우, 이미지와 속도에 의해 식별된 객체를 검토하여 오류가 발생한 지점을 찾아내고, 이 절차를 수행하는 동안 임계값 설정이나 아티팩트 제거와 같은 수정 조치를 제안해야 합니다. 이미지 촬영을 위한 벌레를 선택할 때는 이미지 품질에 대한 주관적인 평가보다는 기하학적 방향을 기준으로 선택하는 것이 매우 중요하며, 가능한 경우 블라인드 스코어링(blind scoring) 방식을 강력히 권장합니다.