루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

이 프로토콜은 루시퍼라제 리포터 세포주의 생성과 생물 발광 발현의 세포 자율 일주기 리듬의 후속 모니터링에 대해 자세히 설명합니다. 먼저 렌티바이러스 루시페라제 발현 리포터를 구성하고 렌티바이러스 입자를 생성하고, 관심 세포를 감염시키고 선택한 배양을 증폭합니다. 그런 다음 적절한 기록 장치를 사용하여 동기화된 리포터 세포에서 생물 발광 발현을 모니터링합니다.

궁극적으로 생물 발광 기록은 세포의 자율적인 일주기 리듬을 입증하는 데 사용됩니다. 일시적 형질주입(transfection) 및 생식세포 보호(germline protection)와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 VIR이 매개된다는 것입니다. 유전자는 세포 게놈에 안정적으로 통합될 뿐만 아니라 효율성과 다양성을 높입니다.

이 방법은 cied clock 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 조직 특이적 생체 시계가 있습니까? 만약 그렇다면, 조직 특이적 생체 시계의 특성은 무엇입니까?

이 방법은 clock 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 세포주기의 역학, 종양 발생 등과 같은 다른 시스템에도 적용 할 수 있습니다. 우리는 조직 또는 세포 유형별 고정 시계를 연구하기로 결정했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.

연구원인 Chita Norm Napkin 박사와 제 연구실 Atory의 대학원생인 Sandra가 절차를 시연할 것입니다. 전형적으로, 포유류의 일주기 리포터 구축물은 일주기 프로모터가 루시페라제 유전자와 융합된 발현 카세트를 포함합니다. 이 렌티바이러스 리포터에서, 불안정화된 루시퍼라제는 2개의 프로모터당 마우스의 제어 하에 있습니다.

recombination reaction에 의한 reporter 벡터를 구성하는 방법에 대한 자세한 지침은 함께 제공되는 원고를 참조하십시오. for efficient transfection. 90-100% 융합 통로가 낮은 인간 배아 신장 세포를 배양하는 것으로 시작합니다. 이제 6 개의 배양 플레이트를 코팅합니다.

transfection의 경우, 0.001 % 폴리 L 라이신 1 밀리리터를 각각 첨가하고 실온에서 20 분 동안 잘 배양 한 다음 PBS로 한 번 헹굽니다. 다음으로, 트립신을 사용하여 세포를 수확하고 사전 코팅된 플레이트의 각 웰에 세포를 파종합니다. 세포의 균일한 분포를 얻기 위해 플레이트를 소용돌이

파종된 세포가 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에서 80-90%의 합류점에 도달했는지 확인합니다. 렌티바이러스 리포터 플라스미드, DNA 및 3가지 패키징 벡터의 plasmid transfection mix를 transfection 및 후속 감염에 대한 control로 준비합니다. CMV promoter의 제어 하에 강화된 녹색 형광 단백질을 품고 있는 lentiviral GFP 발현 벡터에 대한 추가 well을 포함합니다.

다음으로, 100 마이크로 리터의 0.25 몰 염화칼슘을 플라스미드에 넣고 철저히 혼합합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 두 XBBS 용액을 넣고 부드럽지만 완전히 섞습니다. DNA 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양합니다.

기다리는 동안 2 9 3 T 세포의 배지를 2 밀리리터의 새 배지로 교체하십시오. 중간 pH의 평형을 이루기 위해 최소 10분 동안 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 다음으로, 적갈색 방식으로 형질주입 혼합물을 세포에 첨가하고, 플레이트를 부드럽게 소용돌이치며 현미경으로 입자 형성을 관찰한 다음, 세포를 밤새 인큐베이터에 넣습니다.

transfection 후 약 16시간 후에 배지에 2ml의 신선한 DMEM을 보충하고 밤새 배양합니다. 다음으로, 형질주입 효율을 평가하기 위해 형질주입 대조군 세포에서 EGFP 발현을 평가합니다. 높은 EGFP 발현과 함께 90 - 100%의 transfection 효율은 우수한 바이러스 전처리의 신뢰할 수 있는 예측 변수입니다.

분비된 감염성 바이러스 입자를 포함하는 배지를 수확하고 원심분리기를 사용하여 잔류 2, 9, 3 T 세포를 제거하고 상층을 포함하는 바이러스를 수집합니다. 3일째에 약 12, 003 T 3개의 세포를 12웰 플레이트에서 하룻밤 동안 배양하여 20-30%co의 유창성으로 만들고 4일째에 세포를 관찰합니다. 여전히 4일째에는 바이러스 입자가 포함된 수집된 배지에 poly brain을 추가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다.

이제 3개의 T 3 세포에서 배지를 흡인하고 웰당 1ml의 바이러스 혼합물을 추가합니다. PBS로 세포를 한 번 세척한 후 하룻밤 동안 섭씨 37도에서 배양하고 배지를 보충하고 회복과 성장을 위해 하룻밤 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. confluent가 나오면 세포를 분리하고 다음날 밤새 배양합니다.

감염된 세포를 선별하려면 밀리리터당 10마이크로그램을 함유한 새로운 배지를 추가합니다. blastic은 제쳐두고, kill car의 blast acid는 각 세포주에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 항생제 내성 세포를 지속적으로 선택하기 위해 2-3일마다 blastin을 포함하는 배지를 보충합니다.

시계 리포터를 표현합니다. blastin 저항성 리포터 세포 배양을 35mm 배양 접시에 합류할 때까지 전파한 후, 우리는 일반적으로 sarcy 표현형에 대한 각 조건에서 각 리포터 세포주에 대해 3개 이상의 접시를 준비합니다. PBS로 한 번 세척한 후 10마이크로몰 포린(forline) 또는 200나노몰 덱사메타손(dexamethasone)이 함유된 DMEM을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 세포를 동기화합니다.

이제 세포를 갓 만든 기록 매체에 넣습니다. 배양 접시를 40mm 멸균 커버 슬립으로 덮고 진공 그리스로 제자리에 밀봉하여 증발을 방지합니다. 루머스 사이클 광도계에 접시를 넣고 실시간 생물 발광을 시작합니다.

녹음 96 오래된 플레이트를 녹음합니다. GSR 2개의 녹음 장치에 대해서는 관련 원고를 참조하십시오. 우리는 럼 주기 분석 프로그램에서 5-7일 동안의 리듬을 쉽게 기록합니다.

첫 번째 기준선은 원시 데이터를 맞춥니다. 그런 다음 기준선에서 뺀 데이터를 사용하여 사인파에 피팅하고 필요한 파라미터 지속적인 리듬을 보여주는 샘플에 대해 결정합니다. 90% 이상의 피트 업 데이터의 장점은 높은 과도 Luminate로 인해 쉽게 달성됩니다.

센스 업과 중간 변화. 우리는 일반적으로 데이터 프레젠테이션을 위해 분석에서 데이터의 첫 번째 주기를 제외합니다. 필요한 경우 시간에 대한 원시 데이터를 플로팅합니다.

기준선에서 뺀 데이터를 플롯하여 2 9 3 T 세포의 일시적 형질주입과 세포주 감염 모두에서 진폭과 위상을 비교합니다. transfection 및 transduction된 GFP 발현 세포의 형광 이미지는 lentiviral 매개 유전자 전달 시스템이 매우 효율적임을 나타냅니다. 일주기 시계의 핵심 피드백 루프는 리듬 유전자 발현을 생성하기 위해 일주기 향상 요소에 작용하는 전사 인자로 구성됩니다.

여기서, 3개의 T 3 세포에서 4개의 서로 다른 리포터 구조체는 리포터 발현의 뚜렷한 단계를 생성합니다. RNAi 및 약리학적 활성 화합물을 통한 유전자 녹다운을 사용하여 여러 일주기 요소에 의한 조합 조절로 새로운 중간 단계를 생성할 수 있습니다. 이 실험은 U2 OS 세포의 35mm 접시에 있는 세포의 생물 발광 기록을 위해 럼 사이클 광도계를 사용했습니다.

Irna는 cry one과 cry two 유전자의 넉다운 효과를 조명하는 데 사용되었습니다. 여기서 세포의 생물 발광 기록에 시너지 광도계가 사용되었습니다. 3개의 T 3개의 리포터 세포에 있는 96 우물 판에서.

RNA는 세포 리듬에 대한 triune knockdown의 효과를 평가하는 데 사용되었습니다. 이 예에서는 UX 시스템과 테칸 광도계가 3 84 세포의 생물 발광 기록에 사용되었습니다. 표시된 플레이트가 선택되는 동안 작은 분자는 U2 OS 리포터 세포의 세포 리듬에서 단백질 기능을 약리학적으로 표적으로 삼고 교란할 수 있습니다.

개발 후. 이 기술은 다양한 세포 및 조직 유형의 시계 메커니즘과 생리학을 탐구하기 위한 일주기 생물학 분야의 연구를 위한 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 Lucifer를 생성하고, 세포주를 보고하고, 부피를 모니터링하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다.

또한 VIR로 작업하는 것은 매우 위험한 명령일 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 및 바이러스 오염 제거와 같은 사전 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.