루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

본 프로토콜에서는 루시페레이스 리포터 세포주를 생성하고, 이후 생물발광 발현의 세포 자율적 일주기 리듬을 모니터링하는 방법을 상세히 설명합니다. 먼저 렌티바이러스 루시페레이스 발현 리포터를 구축하고 렌티바이러스 입자를 생성한 다음, 대상 세포를 감염시키고 선택된 배양물을 증폭합니다. 그 후 적절한 기록 장치를 사용하여 동기화된 리포터 세포의 생물발광 발현을 모니터링합니다.

궁극적으로, 생물발광 기록은 세포 자율적인 일주기 리듬을 입증하는 데 사용됩니다. 일시적 형질전환이나 생식세포 보호와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 VIR 매개 유전자가 세포 게놈 내에 안정적으로 통합될 뿐만 아니라, 효율성과 다재다능함이 더 뛰어나다는 점입니다.

이 방법은 생체 시계 연구 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 조직 특이적 생체 시계가 존재하는가? 만약 그렇다면, 조직 특이적 생체 시계의 특성은 무엇인가? 와 같은 질문들입니다.

이 방법은 생체 시계 메커니즘에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 주기 역학, 종양 형성 등 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 저희는 조직 또는 세포 유형 특이적인 생체 시계를 연구하기로 결정했을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다.

실험 절차는 포스닥 연구원인 Dr.Chita Norm Napkin과 Atory 실험실의 대학원생인 Sandra가 시연하겠습니다. 일반적으로 포유류 서카디안 리포터 구조체는 서카디안 프로모터가 루시페레이스 유전자와 융합된 발현 카세트를 포함합니다. 이 렌티바이러스 리포터에서 불안정화된 루시페레이스는 마우스 per2 프로모터의 제어를 받습니다.

재조합 반응을 통한 리포터 벡터 구축에 관한 자세한 지침은 효율적인 형질전환을 위해 동봉된 원고를 참조하십시오. 90~100% 합류(confluence) 상태인 낮은 계대 배양수의 인간 배아 신장 세포 배양물로 시작합니다. 이제 6-웰 배양 플레이트를 코팅하겠습니다.

형질전환을 위해, 각 웰에 0.001% poly L lycine 1 mL를 첨가하고 상온에서 20분간 배양한 후 PBS로 한 번 헹굽니다. 다음으로, trypsin을 사용하여 세포를 수확하고, 사전 코팅된 플레이트의 각 웰에 세포를 분주합니다. 플레이트를 흔들어 세포가 균일하게 분포되도록 합니다.

1.5 mL 미세 원심분리 튜브 내에 파종된 세포가 80~90%의 합류도(confluence)에 도달했는지 확인합니다. 트랜스펙션 및 후속 감염 모두에 대한 대조군으로 렌티바이러스 리포터 플라스미드, DNA 및 3가지 패키징 벡터로 구성된 플라스미드 트랜스펙션 믹스를 준비합니다. CMV 프로모터의 제어 하에 강화 녹색 형광 단백질을 보유한 렌티바이러스 GFP 발현 벡터를 위한 웰을 추가로 포함합니다.

다음으로, 0.25 M 염화칼슘 100 µL를 플라스미드에 첨가하고 충분히 혼합합니다. 그런 다음 2X BBS 용액 100 µL를 첨가하고 부드럽지만 충분하게 혼합합니다. DNA 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양합니다.

대기하는 동안, 2 9 3 T 세포의 배지를 2 mL의 신선한 배지로 교체합니다. 배지의 pH를 평형 상태로 만들기 위해 플레이트를 인큐베이터에 최소 10분 동안 다시 넣어둡니다. 다음으로, 트랜스펙션 혼합물을 세포에 한 방울씩 첨가하고, 플레이트를 가볍게 흔든 뒤 현미경으로 입자 형성을 관찰하고, 세포를 인큐베이터에 넣어 하룻밤 동안 배양합니다.

형질전환 후 약 16시간이 지나면 2 mL의 신선한 DMEM으로 배지를 보충하고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, 형질전환 효율을 평가하기 위해 형질전환 대조군 세포의 EGFP 발현을 분석합니다. 높은 EGFP 발현과 함께 90~100%의 형질전환 효율이 나타나면 양질의 바이러스 조제물을 얻을 수 있는 신뢰할 만한 지표가 됩니다.

분비된 감염성 바이러스 입자가 포함된 배지를 수확하여 원심분리함으로써 잔류 2 9 3 T 세포를 제거하고 바이러스가 포함된 상층액을 수집합니다. 3일 차에 약 12, 003 T three 세포를 12-웰 플레이트에 접종하여 20~30% 합류도(confluency)가 될 때까지 하룻밤 동안 배양한 후, 4일 차에 세포를 관찰합니다. 마찬가지로 4일 차에 바이러스 입자가 포함된 수집 배지에 poly brain을 첨가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다.

이제 세 개의 T3 세포에서 배지를 흡입하여 제거하고, 웰당 1 mL의 바이러스 혼합물을 첨가합니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후, PBS로 세포를 한 번 세척하고 배지를 보충한 뒤 세포의 회복과 성장을 위해 37 °C에서 하룻밤 동안 더 배양합니다. 세포가 완전히 밀집되면 세포를 분할하여 다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다.

감염된 세포의 선택을 시작하려면 10 µg/mL가 포함된 신선한 배지를 첨가하십시오. Blasticidin의 사멸 농도는 각 세포주에 대해 실험적으로 결정해야 합니다. 항생제 내성 세포의 지속적인 선택을 위해 2~3일마다 Blasticidin이 포함된 배지를 교체해 주십시오.

클락 리포터 발현. blastin 내성 리포터 세포 배양액을 35 mm 배양 접시에 접종하여 세포가 confluent 상태가 될 때까지 배양합니다. 일반적으로 각 조건별로 각 리포터 세포주당 3개 이상의 접시를 준비하여 sarcy 표현형을 분석합니다. PBS로 1회 세척한 후, 10 µM forline 또는 200 nM dexamethasone이 포함된 DMEM을 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양하여 세포를 동기화합니다.

이제 세포를 새로 제조한 기록 배지에 넣습니다. 배양 접시를 40 millimeter 멸균 커버 슬립으로 덮고, 증발을 방지하기 위해 진공 그리스로 밀봉합니다. 접시를 lumous cycle 루미노미터에 장착하고 실시간 생체 발광 측정을 시작합니다.

기록 96-웰 플레이트의 기록을 위해. GSR two 기록 장치는 동봉된 원고를 참조하십시오. Lum cycle 분석 프로그램을 사용하여 5~7일 동안 리듬을 용이하게 기록할 수 있습니다.

먼저 원시 데이터의 베이스라인을 피팅하십시오. 그 다음, 베이스라인이 제거된 데이터를 사인파에 피팅하여 지속적인 리듬을 보이는 샘플에 필요한 파라미터를 결정하십시오. 높은 과도 루미네선스로 인해 90% 이상의 적합도(goodness of fit)를 쉽게 달성할 수 있습니다.

센싱 및 배지 교체. 데이터 제시를 위한 분석 시, 일반적으로 첫 번째 사이클의 데이터는 제외합니다. 필요한 경우 시간에 따른 원시 데이터를 그래프로 나타내십시오.

2 9 3 T 세포의 일시적 형질전환과 세포주의 감염 모두에서 진폭과 위상을 비교하기 위해 기선 보정된 데이터를 도식화합니다. 형질전환 및 형질도입된 GFP 발현 세포의 형광 이미지는 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템이 매우 효율적임을 나타냅니다. 서캐디언 시계의 핵심 피드백 루프는 서캐디언 인핸서 요소에 작용하여 리듬감 있는 유전자 발현을 생성하는 전사 인자들로 구성됩니다.

본 실험에서는 세 가지 T three 세포 내의 네 가지 서로 다른 리포터 구조체가 리포터 발현의 뚜렷한 위상을 생성합니다. RNAi를 통한 유전자 넉다운 및 약리학적 활성 화합물을 사용하여 여러 서카디언 요소들에 의한 조합 조절을 통해 새로운 중간 위상을 생성할 수 있습니다. 이 실험에서는 U2 OS 세포를 사용하였으며, 35 millimeter 디쉬에 배양된 세포의 생물 발광 기록을 위해 lum cycle 루미노미터를 사용하였습니다.

cry one 및 cry two 유전자의 넉다운 효과를 밝히기 위해 Irna가 사용되었습니다. 여기서는 세포의 생물 발광 기록을 위해 시너지 루미노미터가 사용되었습니다. 96웰 플레이트에 세 종류의 T3 리포터 세포를 분주하였습니다.

세포 리듬에 대한 triune knockdown의 효과를 평가하기 위해 RNA를 사용하였습니다. 본 예시에서는 3 84 플레이트에 담긴 세포의 생물 발광 기록을 위해 UX 시스템과 tecan 루미노미터를 사용하였습니다. 표시된 플레이트가 선택된 것처럼, 저분자 화합물을 통해 U2 OS 리포터 세포의 세포 리듬 내 단백질 기능을 약리학적으로 표적으로 삼아 교란할 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, 이를 통해 서카디안 생물학(circadian biology) 분야의 연구자들은 다양한 세포 및 조직 유형에서 생체 시계 메커니즘과 생리학을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 루시페라제 리포터 세포주를 제작하고 그 발현량을 모니터링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

또한 바이러스(VIR)를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장구 착용 및 바이러스 제염과 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.