Microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석

안녕하세요, 제 이름은 Ena이고 우리는 실험실에서 정기적으로 유전자 발현 프로파일링을 합니다. 그리고 우리는 이 기술을 사용하여 필로폰과 야생형 사이의 차등 조절 유전자를 모니터링합니다. 그리고 오늘 저는 야생형 RNA 샘플과 필로폰 RNA 샘플을 가지고 있는데 우리 모두 C를 먼저 합니다.

우리는 간접 라벨링 방법을 사용하며 이 기술의 장점은 직접 라벨링에서 발생할 수 있는 눈 편향을 방지하는 것입니다. 이를 위해 우리는 RNA 샘플을 가지고 있으며 총 부피 13마이크로리터에 3마이크로그램의 RNA를 얻습니다. 그리고 우리는 공원에 2.5마이크로의 무작위 he를 추가합니다.

그리고 우리는 8분 동안 RNA의 특성을 갖기 위해 75도에서 샘플을 배양할 것입니다. 이제 AM L-D-L-D-U-T-P 연속 믹스, 역전사 효소 완충액 및 ET TT Big it down을 포함하는 역전사 칵테일을 추가하고 42도에서 4시간 동안 샘플을 배양합니다. 그래서 4시간 후에 샘플을 꺼내기만 하면 됩니다.

그리고 이제 튜브에는 CDNA와 RNA가 혼합되어 있습니다. 그리고 우리가 원하는 것은 수산화나트륨과 EDTA를 첨가하여 하이드록스 RNA를 수행하는 것이며 수산화나트륨의 최종 농도는 100 어금니가 되어야 합니다. 그리고 e BT의 최종 농도는 5대구치여야 합니다.

이제 65도 수조에서 10 분 동안 샘플을 배양합니다. 배양이 완료되고 pH 7개, 무릎 1개, 물 1개를 최종 농도 500어금니에 추가하여 샘플을 활용할 것입니다. 이 시점에서 샘플을 영하 20도로 저장하거나 정리를 계속할 수 있습니다.

CDNA의 정제를 위해 KaiGen PCR 정제 키트를 사용합니다. 그러나 부시 버퍼와 이온 버퍼에는 프리잉이 포함되어 있기 때문에 우리는 그렇지 않습니다, 우리는 우리 자신의 운명 부시 버퍼와 페이트 이온 버퍼를 준비하고 당신은 300 리터의 PPI를 추가하고 우리는 그 연못을 천천히 파이프로 보내 혼합물을 기둥으로 옮길 것입니다 그리고 당신은 최고 속도로 1 분 동안 회전 할 것입니다 그리고 당신은 지켜 볼 것입니다. 우리가 준비한 버퍼입니다. 인산염 세척 버퍼, 750마이크로리터 등을 추가하고 다시 하나를 위해 다른 것을 추가합니다.

그래서 우리는 모든 침대를 모두 확보했는지 확인하기 위해 다시 돌릴 것입니다. 그리고 우리는 이 튜브를 빈 범죄자 튜브로 옮길 것입니다. 그리고 pH 8.5에서 인산칼륨 4몰 4개인 pho phosphate E buffer의 마커 30개를 추가하겠습니다.

그리고 여기에서 모든 것을 컬럼 중앙에 추가하고 실온에서 1분 동안 배양하는지 확인하기만 하면 됩니다. 그래서 다시 1분 동안 회전하고 인큐베이팅 또는 침실에 또 다른 30 마이크로 제로 버퍼를 추가합니다. 그래서 컬럼을 제거하면 총 부피가 60마이크로(CDA)가 됩니다.

일단 우리가 CDNA를 정리하면, 당신은 할 수 있습니다, 당신은 할 수 있습니다, 당신은 할 수 있습니다, 당신은 그것을 할 수 있습니다, 그리고 우리는 또한 그것을 건조시킬 수 있습니다, 그리고 나서 우리는 피드백에서 CDNA를 건조시킬 수 있습니다. 이제 튜브에는 변형된 건조 CDA가 있습니다. 그리고 우리가 할 일은 건조 샘플을 매달아 놓는 것입니다.

pH 9에서 15 LAR 중탄산염 10 ture에 샘플을 현탁시킵니다. 그리고 저는 이 단계에서 위아래로 움직여서 이 작업을 할 것인데, cDNA를 재생하는 것이 매우 중요합니다. 글쎄요, 일에 대한 기업의 반응을 사기 위해, 형광 라벨은 다이에 민감하기 때문에 이 반응은 암실에서 일어나야 합니다.

그러나 생명 과학에서 이를 선택하면 개별 패키지로 제공됩니다. S 5는 보라색 모자를 쓰고 사이드 3은 주황색 모자를 쓰고 있으며 S 5는 서스펜션 될 때 Sion이 나타나고 Cary는 자홍색으로 나타납니다. 그래서 제가 어두운 방에서 할 일은 이 샘플들을 염료 튜브로 옮기고, 염료를 다시 매달아 제가 가지고 있는 튜브로 다시 옮기는 것입니다.

그런 다음 어둠 속에서 2시간 동안 배양한 후 2시간 동안 배양하면 pH 5.2에서 100밀리몰의 아세트산나트륨 35개를 첨가하여 반응을 멈춥니다. 그 후 유사한 정리 절차로 청소했습니다. 그러나 이번에는 케이준에서 제공하는 세척 버퍼와 용리 버퍼를 사용합니다.

샘플을 넣는 장소와 기기를 청소해야 하는 위치를 설명할 수 있습니다. 그래서 당신은 당신의 샘플이나 당신의 블렌드를 지금 당장 할 수 있습니다, 그래서 이것은 내 공상 과학 라벨이 붙은 샘플이고 여기서 우리가 보는 것은 CDA 내용을 보여주는 OD two 60과 공상 과학을 위한 D 통합을 보여주는 OD six 50입니다. 그리고 여기 내 사이드 3 라벨 샘플이 있습니다.

다시 말하지만, 트위스트 6 농도 및 5 50 측정 사이트 3 통합. 내 D 법인이 효율적으로 일하고 있기 때문에 샘플을 합칠 것입니다 지금, Ms.Miss는 간략하게 설명합니다. 이제 피드백을 사용하여 샘플을 다시 작성하겠습니다.

자, 슬라이드의 화를 위해 우리는 보편적으로 슬라이드를 물 위에 올려 놓음으로써 수분을 보충할 것이고 그렇게 하면 반점이 더 커질 것입니다. 그런 다음 이를 보호하기 위해 섭씨 100도에서 스냅 건조한 다음 UV 하이브리드화 또는 UV 교차 연결을 통해 슬라이드에 반점을 연결한 다음 우리가 가지고 있는 프리 하이 버퍼에서 배양합니다. 그래서 슬라이드를 뒤집어 놓지만 아직 물에 닿지 않습니다.

그리고 우리는 5분 동안 이렇게 기다릴 것입니다. 나는, 그래서 이 상자는 더 커 보이고 넣기 전보다 더 빛나야 하며 슬라이드를 100도로 올려 놓으면 건조되고 결로가 관찰됩니다. 그리고 우리는 youi와 교차 연결할 것입니다.

그래서 수분 공급을 위해 슬라이드를 전쟁 전의 물에 담그겠습니다. 그리고 이것은 정말 빨라야 하는데, 왜냐하면 여기서의 목표는 연결되지 않은 모든 반점 또는 모든 올리고를 제거하려는 것이기 때문입니다. 그리고 이 과정에서 천천히 진행하면 그 자리에 컴테일만 생깁니다.

그래서 당신이 정말로 그것을 빨리 하고 있는지 확인하고 당신이 물 밖으로 비행기를 타고 이 일을 하지 않도록 하십시오 30초 동안 그리고 그냥 5분 동안 실온에서 즉시 fut 그리고 700 공기 오후 이것을 얻으십시오, 우리는 이 슬라이드를 우리가 가지고 있던 전쟁 전 파이프 스테이션 버퍼에 맞춥니다 그리고 천천히 슬라이드를 항아리에 밀어 넣고 우리는 이것을 42도에서 배양할 것입니다 최소 45분. 그래서 여기에 우리는 혼성화할 건조된 샘플을 가지고 있습니다. 그래서 우리는 먼저 Resus를 물에 매달아 놓을 것입니다.

이 단계에서 우리는 위아래로 발생하여 일시 중단을 재생하고 샘플을 너무 흰색, 흰색으로 노출시키지 않을 수 있습니다. 그런 다음 누군가의 정자 DNA 1.5를 더하면 농도는 밀당 10밀리그램입니다. 그리고 TRNA의 1.2 마케터를 추가합니다.

농도는 12.5 milligram이며, tRNA와 솜 정자 DNA를 첨가하여 비특이적 수력을 차단합니다. 그리고 5.35 마커 0 3 XSSC를 추가하여 3 x의 최종 농도를 제공합니다. 마지막으로 3.5 마이크로 리터의 1 % SDS를 추가합니다.

이제 혼합물을 5분 동안 끓이고 5분 동안 최고 속도로 회전하면 준비가 완료됩니다. 슬라이드를 품은 지 한 시간이 지났고 지금 물과 이소프로판올이 있습니다. 그래서 먼저 슬라이드를 물에 넣고 교반하여 SDS를 제거한 다음 dza 프로판올을 세척하고 표준 게이지에 직접 넣겠습니다.

그리고 여기에서는 건조를 방지하기 위해 빛을 공기에 너무 많이 노출시키지 않도록 주의하세요. 그래서 저는 위험 스테이션 버퍼에서 물로 직접 가서 슬라이드를 세척합니다. 몇 분 동안 동작이 옆이 아니라 위아래로만 있는지 확인하십시오.

또한 슬라이드가 물 위에 있지 않은지 확인하고 즉시 이소프로판올로 옮길 것입니다. 그리고 다시 몇 분 동안 여기에 머물러 있습니다. 그리고 귀하의 페이지는 실온에서 5분 동안 귀하의 페이지에 응답해 주시겠습니까?

700 R.쿨. 따라서 우리 슬라이드도 하이브리드화할 준비가 되어 있으며 버스로부터 보호하기 위해 슬라이드 상자에 보관하는 것이 좋습니다. 따라서 수확 스테이션의 경우 리프트 또는 슬립을 사용합니다.

커버 슬립에 흰색 스트립이 있으며 약간의 리프트를 제공하고 샘플이 커버 슬립과 슬라이드 사이에 들어갈 수 있는 공간을 제공합니다. 그리고 에탄올로 청소한 다음 와이어를 내려놓고 테스트 입자가 없는지 확인합니다. 먼저 인쇄 영역이 표시된 템플릿 슬라이드를 가져와서 그 위에 준비한 슬라이드를 놓고 완벽하게 정렬되었는지 확인합니다.

완벽하게 정렬되었는지 확인하십시오. 그리고 스트립이 측면에 있는지, 우리가 그것을 아래로 향하게 할 것인지 확인해야 합니다. 그래서 정말 보기 어렵지만 볼 수 있는지 확인하십시오.

그리고 줄무늬는 슬라이드의 측면에 있어야 합니다. 그리고 우리는 측면에서 샘플을 로드합니다. 소량의 샘플을 채취하므로 먼저 15마이크로리터를 취하고 커버 슬립의 모서리에서 적재를 시작합니다.

그리고 천천히 그것을 당겨서 가장자리를 따라 움직여 모든 영역을 덮습니다. 이 단계에서는 거품이 생기지 않는 것이 매우 중요하며 다른 15개의 마이그레이터를 사용하여 건조를 방지하기 위해 슬라이드 측면에 적용합니다. 따라서 샘플이 준비되었으며 슬라이드와 우선 순위 지정 챔버를 배양하게 되며, 여기에는 하이브리드화하는 동안 슬라이드를 수화할 수 있는 마이크로 채널이 있습니다.

그리고 슬라이드의 6개 모서리에 3개의 XSSC를 가진 10명의 마케터를 추가할 것입니다. 챔버 위에는 여섯 곳이 있었는데, 죄송합니다만, 각 모서리 I와 양쪽에 커버 슬립이 미끄러지지 않도록 슬라이드를 정말 부드럽게 옮기십시오. 그리고 슬라이드를 오른쪽이 위로 향하게 놓으면 쌓이고 넣은 물에 달라붙고 덮개를 씌우고 나사가 조여졌는지 확인하십시오.

우리는 65도 물 주머니에서 대화 챔버를 배양할 것이지만 직접 바닥에 놓고 싶지는 않습니다. 그래서 우리는 과도한 열 전달을 방지하기 위해 일종의 플라스틱 장벽을 설치했습니다. 그리고 우리는 우리의 화 챔버를 부드럽게 배치하고 변위를 방지하기 위해 일종의 무게를 넣을 수도 있습니다.

그리고 이 잠복기는 하룻밤 동안 진행되며 일반적으로 10시간에서 12시간 사이입니다. 따라서 슬라이스 세척을 위해 0.05% SDS의 XSSC를 사용합니다. 이것은 커버 슬립을 제거하기 위한 것입니다.

그리고 이것은 첫 번째 단계를 씻기 위한 것입니다. 그리고 우리는 우리가 가지고있는 모든 SDS를 통해 0.06 % six XSC로만 두 단계를 더 수행 할 것입니다. 그래서 우리는 모두 대화를 망치고 슬라이드를 가져다가 지갑 용기에 뒤집어 넣습니다.

그리고 우리는 그것을 좌우로 흔들면 커버 슬립이 부드럽게 떨어지는 것을 볼 수 있습니다. 자, 그리고 XES가 포함된 다른 세척 버퍼로 이동하겠습니다. 당신은 1분 동안 기다립니다.

오 six XSSC로 이동합니다. 그리고 모든 FDS를 제거했는지 확인하기 위해 한 번 더 반복할 것입니다. 건조를 위한 원심분리기는 실온에서 700RP로 5분 동안 진행되었습니다. 이 슬라이드는 빛에 민감하기 때문에 슬라이드 상자에 보관합니다.

이것은 슬라이드 스캐너이고 여기에 슬라이드를 넣고, 바로 여기에 작은 공간을 넣고, 슬라이드를 아래로 향하게 하고, 쪽으로 레이블을 붙이고, 두 번째 슬라이드에서는 스캔하려는 영역을 정의합니다. 슬라이드에서 이 영역을 살펴보겠습니다. 우리는 슬라이드를 인쇄하기 위해 16개의 핀을 사용합니다.

이렇게 각 구획은 1개의 핀에 대응하고 우리의 활주에는 8 이상 의 000의 반점이 포함한다. 그리고 우리는 vi color genome을 두 번 대표하는데, 왜냐하면 그것은 약 4,000개의 유전자이기 때문입니다. 그래서 우리는 우리가 사용하는 각 올리고당 두 개의 스팟이 있습니다.

그리고 이것을 확대하면 이 특정 실험에서 전사 조절자 돌연변이를 야생형과 비교하고 돌연변이체는 붉은색을 띠는 scifi로 분류됩니다. 그리고 와일드 타입은 3번 사이트였는데, 이는 초록색을 띱니다. 따라서 이 반점들처럼 붉게 보이는 모든 것은 돌연변이의 전사체가 야생형보다 더 많았다는 것을 나타냅니다.

그래서 그들은 붉은색 또는 붉은색의 음영으로 나타나며, 녹색으로 보이는 모든 것은 전사체의 풍부함이 돌연변이에 비해 야생형에서 더 높았다는 것을 나타냅니다. 그리고 노란색으로 보이는 모든 반점은 그 전사체가 돌연변이체와 야생형 모두에 동등하게 존재했다는 것을 나타냅니다. 그래서 그들이 오버레이되면 이 buts처럼 노란색으로 보일 것입니다.