Name: Microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 29 min 41 s
Description: 배우세요 세균의 유전자 발현 분석을 위한 간접 표기법과 마이크로어레이 하이브리다이제이션 기술을 활용한 방법입니다. 이 프로토콜은 돌연변이체와 야생형 샘플 간의 차등 발현 유전자를 신뢰성 있게 비교할 수 있습니다.

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Transcriptase 반응을 역방향 70-80로 가열 블록 돌려 ° C 42 ° C. 워터 온천도이 단계에서 사용할 수 있습니다. 가열 블록을 사용하는 경우, 열이 균일되도록 물을 넣어. <ol><li> 마중물 반응 <ol><li> RNA 3 μg을 가지고 </li><li> RNase 무료 물을 13 μl로 볼륨을 조정 </li><li> 랜덤 hexamer primers (2mg/mL) 2.5 μl 추가 </li></ol></li><li> 잘 믹스 8 분 동안 70-80 ° C에서 알을 품다. 5 분 얼음 그런 다음, 장소. </li><li> : RT 칵테일 (14.5 μl / rxn) 준비 <table border="0"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 음량 </td></tr><tr><td> 배 첫 스트랜드 버퍼 </td><td> 6 μl </td></tr><tr><td> 0.1 M DTT </td><td> 3 μl </td></tr><tr><td> 25X aminoallyl - dNTP 믹스 </td><td> 1.2 μl </td></tr><tr><td> 윗첨자 II RT (200U/μl) </td><td> 2.3 μl </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 2.0 μl </td></tr></tbody></table> * N 반응의 경우, 밖으로 실행되지 않습니다 보증하기위한 칵테일 N 0.5 aliquots에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. </li><li> 냉각 반응 14.5 μl를 추가합니다. </li><li> 혼합 (와동하지 않음)과 ° C 3-4시간에 대한 42 알을 품다 </li><li> 필요한 경우 샘플은 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> Hydrolyze RNA <ol><li> 각 샘플하려면, 1 N NaOH 3 μl와 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.6 μl를 추가합니다. (최종 conc.s = 100mM NaOH, 10mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) </li><li> 믹스 65에서 품어 ° C를 10 분. </li><li> 33.6 μl 1M HEPES를 추가하여 중화, 산도 = 7.0 (최종 CONC .= 500mM의 HEPES) </li><li> 샘플이 필요한 경우, -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 반응 정제 : 비법인 AA - dUTP의 제거와 무료 아민 참고 :이 정화 프로토콜은 Qiagen QIAquick의 PCRpurification 키트 프로토콜에서 수정됩니다. Qiagen 버퍼가 싸이 염료 커플링 반응과 경쟁 무료 아민을 포함하기 때문에 인산염 세척 및 용출 버퍼는 Qiagen 제공된 버퍼에 대한 대체됩니다. 미니 준비 키트에서 열이도 사용할 수 있습니다. <ol><li> 300 μl (또는 배 반응 볼륨 = 336 μl) 버퍼 PB (Qiagen 공급)와 cDNA 반응을 믹스하고 QIAquick 열로 전송할 수 있습니다. </li><li> 2 ML 수집 관에서 열 (Qiagen 공급)을 놓고 1 분 ~ 13,000 rpm으로 원심 분리기. 빈 컬렉션 튜브. </li><li> 세척하려면 1 분 ~ 13,000 rpm으로 열 및 원심을 750 μl 인산염 세척 버퍼 (안 Qiagen의)을 추가합니다. </li><li> 수집 튜브를 비우기와 750 μl 세척과 원심 분리의 단계를 반복합니다. </li><li> 수집 튜브를 비우기 및 열에게 최대 속도에서 추가로 1 분 원심 분리기. </li><li> 새로운 1.5 ML의 microfuge 튜브에 열을 전송 조심스럽게 30 μl 인산 용출 버퍼를 추가합니다. (솔루션 준비 부분을 참조) </li><li> 실온에서 1 분 알을 품다. </li><li> 1 분 ~ 13,000 rpm으로 원심 분리에 의해 Elute. </li><li> 반복 단계 6-8하여 동일한 튜브에 두 번 (인산 용출 버퍼의 다른 30 ​​μl)를 Elute. 최종 용출 량 ~ 60 μl해야합니다. </li><li> cDNA의 양은이 단계에서 계량 수 있습니다 : NG cDNA = (희석 계수) (OD260) (37) (총 볼륨이 칼럼에서 eluted) </li><li> 45 VAC 속도 드라이 샘플 ° C. </li><li> 필요한 경우 샘플은 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 다이 에스터을 싸이에 AA - cDNA 커플링 <ol><li> Resuspend 10 μl 50 MM 나 - 중탄산염, 산도 = 9.0 필요한 경우와 cDNA aminoallyl - 분류. (이 버퍼가 격주 신선한하여야한다) </li><li> 어두운 장소에서 작업, 해당 싸이의 염료의 튜브에 프로브를 추가합니다. Pipet 위아래로 여러 번은 염료를 resuspend 수 있습니다. </li><li> 상온에서 어둠 속에서 1 시간 동안 반응을 품어. (부화 최대 2 시간이 갈 수 있습니다) </li></ol> 반응 정제 II : uncoupled 염료의 제거 <ol><li> 반응 35 μl 100 MM NaOAc의 산도 5.2을 추가합니다. 완전히 섞는다. </li><li> 250 μl 추가 (또는 배 반응 볼륨을 = 225 μl) 버퍼 각각의 샘플 및 최대 pipetting 아래로 섞어 PB (Qiagen 공급). </li><li> 2 ML 수집 관에 QIAquick의 스핀 컬럼 (Qiagen 공급)을 장소, 그 결과 해당 컬럼에 대한 샘플을 신청하고, 1 분 ~ 13,000에서 원심 분리기. 빈 컬렉션 튜브. </li><li> 세척하려면 1 분 ~ 13,000에서 열 및 원심 분리기에 0.75 ML 버퍼 PE를 (Qiagen 제공)을 추가합니다. </li><li> 4 단계를 반복합니다. </li><li> 빈 수집 튜브와 최대 속도로 추가 1 분 원심 분리기 칼럼. </li><li> 신중하게 플레이스 깨끗한 1.5 ML의 microfuge 튜브의 열 및 열 막의 중심 30 μl 버퍼 EB을 (Qiagen 제공)을 추가합니다. </li><li> 실온에서 1 분 알을 품다. </li><li> 1 분 ~ 13,000 rpm으로 원심 분리에 의해 Elute. </li><li> 반복하여 동일한 튜브에 두 번 Elute단계 7-9. 최종 eluted 볼륨 ~ 60 μl해야합니다. </li></ol> 라벨링 반응 분석 cDNA의 금액과 레이블은이 단계에서 계량 수 있습니다 : <ul><li> OD 260, 550 및 650 (빈 물을 수 있습니다.) nanodrop microarray 프로그램을 사용을 측정합니다. </li><li> 염료의 설립 및 아래 방정식과 pmol DNA와 염료 / nuc 비율 pmol을 계산할 수 : pmol의 세포핵 = [OD260 * 볼륨 (μL) * 37 μL / NG * 1000 PG / NG] / 324.5 PG / pmol </li></ul> 주 : 1 OD260 cDNA를 위해 = 37 NG / μL, dNTP의 324.5 PG / pmol 평균 분자량) pmol Cy3 = OD550 * 볼륨 (μL) / 0.15 pmol Cy5 = OD650 * 볼륨 (μL) / 0.25 세포핵 / 염색 비율 = pmol pmol / cDNA 싸이 염료 당신이 nanodrop를 사용하는 경우, 이미 μl / pmol의 각 색소 있습니다. 당신은 전체 pmol 염​​료의 설립을 위해 볼륨을하여이 수를 모두 곱하면해야합니다. 참고 :&gt; 염료 샘플 당 정관 이하 20 세포핵 / 염료 분자의 비율은 150-200 pmol가 hybridizations 최적입니다. <ul><li> 샘플은 암흑에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. <ul><li> 함께 hybridized하는 프로브를 결합하고 42 speedvac 아래로 건조 ° C.를 </li><li> 샘플은 hyb 준비 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ul></li></ul> 사전 hyb 슬라이드 <ol><li> 3~5분을위한 깨끗한 빨간색 슬라이드 홀더에 넣어 슬라이드 땅에 얼굴 RT 100 ML 물 </li><li> 몇 초 동안 100 ° C 가열 블록에 얼굴을 배치하여 슬라이드를 건조 스냅 - 결로가 사라져 위해 감시 </li><li> 250 mJoules에서 UV는 상호 링크 슬라이드 (UV crosslinker에 2500 입력) </li><li> 사전 예열 42 ° C의 물 속에서 수영의 수화물 슬라이드. RT에서 700 rpm으로 5 분 스핀. </li><li> 필요한 경우 적어도 45 분 동안 미리 예열 사전 hyb (5XSSC, 1 % BSA, 0.1 % SDS)를 포함 50ml 코플린있는 항아리에 품어 슬라이드는 @ 42 ° C, 그리고 부화 더 오래 갈 수 있습니다. 50 ML 사전 hyb 버퍼 : 12.5 ML 20x SSC, 10 ML 5% BSA, 0.5 ML 10% SDS, 27 ML 물 </li><li> 딥 사전 예열 물 (42 ° C)에서 슬라이드와 사전 hyb 버퍼를 제거하는 몇 분을 선동하다. </li><li> 이소프로판올에 씻어 700 RPM, 온도는 실온, 건조시 5 분 스핀. </li></ol> 하이브 리다이 제이션 준비 샘플 <ol><li> 물에 Resuspend의 프로브 (볼륨이 아래에 있습니다) <table border="0"><tbody><tr><td> 총 권하십시오. = 30μl </td><td> 총 권하십시오. = 35μl </td><td> 총 권 .= 40μl에 대한 </td><td></td></tr><tr><td> 19.8 μl 물 </td><td> 23.55 μl 물 </td><td> 27.2 μl 물 </td><td> </td></tr><tr><td> 1.5 μl </td><td> 1.5 μl </td><td> 1.5 μl </td><td> 10 MG / ML 연어 정자 DNA (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1.2 μl </td><td> 1.2 μl </td><td> 1.2 μl </td><td> 12.5 MG / ML tRNA </td></tr><tr><td> 4.5 μl </td><td> 5.25 μl </td><td> 6 μl </td><td> 20XSSC (배 최종) </td></tr><tr><td> 3 μl </td><td> μl 3.5 </td><td> 4 μl </td><td> 1퍼센트 SDS </td></tr></tbody></table> 참고 : 시약의 이외의 순서가 중요합니다. 마스터 믹스를 준비하지 마십시오. </li><li> 5 분 삶아 후 14,000 rpm으로 5 분만 스핀. 온도는 실온에서 2 분 쿨. </li></ol> 이종 교잡 <ol><li> 각 모서리와 중앙에 하이브리드화 챔버의 우물에 배 SSC의 10-12 μl를 추가합니다. </li><li> 슬라이드의 해당 영역에 깨끗한 리프터 전표를 추가하고 부드럽게 (30 -40 μl) 하이브 리다이 제이션 솔루션에로드합니다. 커버 슬립 중 하나를 가장자리에 여분의 샘플이 있어야합니다. </li><li> 챔버에있는 슬라이드를 놓습니다. 하룻밤 65 ° C 물 목욕에있는 나사와 장소를 조이십시오. 물 목욕의 바닥에 직접 챔버을 올려 놓지 마십시오. 장소에 모든 잡아 맨 위에 챔버 위에 블록을 배치합니다. 빛을 민감한 샘플을 보호하기 위해 물을 욕조에 뚜껑을 유지. </li></ol> Hyb은 세척 <ol><li> 다음 버퍼를 준비 : <ul><li> 1X SSC, 0.05 % SDS </li><li> 0.06 X SSC </li></ul></li><li> 부화 풀어봐 하이브리드화 챔버 후. coverslip을 방해하지 않도록 돌봐, 챔버에서 슬라이드를 제거합니다. </li><li> coverslips을 제거하려면, 따뜻한 1X SSC, 접시의 바닥을 향하고 0.05 % SDS 세척 버퍼 coverslip을 포함 접시에 잠수함 슬라이드. coverslip는쪽으로 슬라이드 사이드를 이동하여 떨어질 것입니다. </li><li> coverslip가 제거되면 따뜻한 1XSSCm 0.05 % SDS와 랙 신선한 목욕탕에서 슬라이드를 놓으십시오. 몇 분 동안 선동 </li><li> 0.06 X SSC의 목욕에 슬라이드 플러스 랙을 전송합니다. </li><li> 다른 바로 슬라이드를 전송0.06 X SSC는 신선한 욕조에 넣어 전에 가능한 한 많은 SDS - 포함된 버퍼를 제거하는 종이 타월에있는 슬라이드를 모래 바닥, 신선한 랙을 포함의 일. </li><li> 몇 분 동안 슬라이드를 선동. </li><li> 5 분 @ 700 RPM에 상온에서 바로 스핀, 그리고 슬라이드는 스캔 준비가되었습니다. 스캔까지 어둠 속에 보관하십시오. </li></ol>

<ol><li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays+%26+TIGR+Microarray+Labeled+Probe+Hybridization%22%5BJournal%5D)">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.</li>
<li>Gilbert,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+%26+Hybridization+of+probed+labels%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Hedge,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , Forthcoming.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>AA-dUTP</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0410</td><td>5-(3-aminoallyl)-2&amp;rsquo;deoxyuridine-5&amp;rsquo;-triphosphate</td></tr><tr><td>dNTP</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2035-01</td><td>100 mM dNTP 세트 PCR 등급</td></tr><tr><td>Random Hexamer 프라이머</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2166-01</td><td>3mg/mL</td></tr><tr><td>SuperScript III RT</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>80800444</td><td>200U/&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>CyDye&amp;#8482;</td><td></td><td>Amersham</td><td>RPN5661</td><td>사후 라벨링 반응성 염료 팩</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td></td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR 정제 키트</td></tr><tr><td>1 M K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KPO4</td><td>완충액</td><td></td><td></td><td>1M 인산 완충액(KPO4, pH 8.5-8.7)을 제조하려면 1M K2HPO4 9.5 mL와 1M KH2PO4 0.5 ml를 혼합한다.</td></tr><tr><td>인산 세척 완충액</td><td>완충액</td><td></td><td></td><td>인산 세척 완충액 100 mL(5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH)를 제조하려면 1 M KPO4 pH 8.5 0.5 ml + MilliQ water 15.25 mL + 95% ethanol 84.25 mL를 혼합한다. 세척 완충액은 약간 탁할 수 있다.** 중요: 인산 세척 완충액은 매일 제조해야 한다.</td></tr><tr><td>인산 용출 완충액</td><td>완충액</td><td></td><td></td><td>멸균수를 사용하여 1 M KPO4, pH 8.5를 4 mM로 희석한다.</td></tr><tr><td>탄산나트륨 완충액</td><td></td><td></td><td></td><td>(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. NaHCO3 4.2 g을 멸균수 80 mL에 녹이고 10 N NaOH로 pH를 9.0으로 조절한 후, 멸균수로 최종 부피를 100 mL로 맞춘다. 염료 결합 반응을 위한 50 mM 용액을 제조하려면 물로 1:10 희석한다. 참고: 탄산 완충액은 시간이 지남에 따라 조성이 변하므로, 2주에서 한 달마다 새로 제조한다.</td></tr></tbody></table>

microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석

안녕하세요, 제 이름은 Ena입니다. 저희 실험실에서는 정기적으로 유전자 발현 프로파일링을 수행하고 있습니다. 저희는 이 기술을 사용하여 meth와 야생형(wild type) 사이의 차등 발현 유전자를 모니터링합니다. 오늘은 야생형과 meth RNA 샘플을 준비했으며, 먼저 cDNA 합성을 진행하겠습니다.간접 표지법을 사용하며, 이 기술의 장점은 직접 표지 시 발생할 수 있는 실험자 편향(eye bias)을 방지하는 것입니다. 이를 위해 RNA 샘플을 준비하여, 총 부피 13 µL 내에 3 µg의 RNA를 확보합니다. 여기에 random hexamer 2.5 µg을 추가합니다.RNA의 변성을 위해 샘플을 75°C에서 8분 동안 배양합니다. 이제 AM L-D-L-D-U-T-P 컨티뉴 믹스, 역전사 효소 버퍼 및 RT 프라이머가 포함된 역전사 칵테일을 첨가하고 가볍게 탭핑합니다. 그 후 샘플을 42°C에서 4시간 동안 배양합니다. 4시간이 지나면 샘플을 꺼냅니다.이제 튜브에는 cDNA와 RNA 혼합물이 들어 있습니다. 여기서 우리가 수행할 작업은 수산화나트륨과 EDTA를 첨가하여 RNA를 가수분해하는 것입니다. 수산화나트륨의 최종 농도는 100 mM이어야 하며, EDTA의 최종 농도는 5 mM이어야 합니다.이제 샘플을 65 °C 항온수조에서 10분 동안 배양하겠습니다. 배양이 완료되었으므로, 최종 농도가 500 M이 되도록 pH 7 HEPES 완충액을 첨가하여 샘플을 처리합니다. 이 단계에서 샘플을 -20 °C에 보관하거나 바로 정제 단계를 진행할 수 있습니다.cDNA 정제를 위해 KaiGen PCR purification kit를 사용합니다. 하지만 Bush buffer와 ion buffer에 프리징 현상이 있으므로, 자체적으로 phosphate wash buffer와 phosphate ion buffer를 준비합니다. PPI 300 µL를 추가한 후, 혼합물을 컬럼으로 천천히 파이펫팅하여 옮깁니다. 그리고 최고 속도로 1분간 원심분리합니다. 준비한 phosphate wash buffer 750 µL를 추가하고, 다시 한번 1분 동안 원심분리합니다.모든 펠렛을 확실히 회수하기 위해 다시 원심분리하겠습니다. 그리고 이 튜브들을 빈 원심분리 튜브로 옮기겠습니다. 여기에 pH 8.5의 4 M 인산칼륨이 포함된 phosphate E buffer 30 µL를 추가하겠습니다.여기서는 모든 시료가 컬럼 중앙에 추가되었는지 확

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연구

JoVE Journal

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