Name: RNA-seq의 트롬빈 - 처리의 Transcriptomes 분석 및 제어 인간 폐 Microvascular 내피 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: 배우세요 RNA-seq를 활용한 인간 폐 미세혈관 내피 세포의 전사체 분석 방법으로, 트롬빈 처리 여부에 따른 차등 발현 유전자를 식별하고 RT-PCR으로 검증하는 기술입니다.

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저자는 우리의 데이터 분석을 위해 자신의 컴퓨팅 클러스터의 사용에 대한 어린이의 자비 병원 및 클리닉에서 박사 스티븐 Kingsmore 및 소아 게놈 의학 센터에 진심으로 감사드립니다, Illumina의 현장 서비스 팀 (엘리자베스 Boyer, 스콧 쿡과 마크 쿡) 및 기술 자신의 빠른 응답 및 차세대 DNA 시퀀싱 장비, HiScanSQ, 데이터 품질 분석의 실행에 대한 유용한 제안에 대한 컨설턴트 팀. 이 작품은 건강 기금 HL080042 (SQY까지) 국립 연구소에 의해 일부 지원과 어린이의 자비 병원과 클리닉의 시동 기금과 기금, 캔사스 시티의 미주리 대학 (SQY까지).되었습니다

<html> 이 프로토콜을 요약 순서도는 그림 1에 표시됩니다. 1. 트롬빈, RNA 분리, RNA의 품질 평가 및 정량화와 세포의 치료 <ol><li> 5% FBS, 성장 요인 및 항생제와 EGM-2 중간에 6 잘 접시에 90~100%의 합류로 문화 인간 폐 Microvascular 내피 세포 (HMVEC-LBl) (Lonza, 고양이 # CC-3202). </li><li> 기아 미디어 (0 % FBS) 이전 트롬빈 치료를 30 분에 미디어를 변경합니다. </li><li> 0.05 U / ML 트롬빈으로 세포를 치료하거나 ° C 5 % CO 2 37에서 6 시간에 대한 제어로 치료 둡니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 Ambion 미르 Vana 키트를 사용하여 처리 및 제어 세포로부터 총 RNA를 분리합니다. </li><li> Experion 자동 전기 영동 역 (에서 표준 프로토콜에 따라 Experion StdSense의 진핵 세포 RN​​A 칩과 RNA의 품질을 평가= &quot;_blank&quot;&gt; www.bio-rad.com). </li><li> 표준 분광 방법을 사용하여 RNA을 수량화. </li></ol> 2. 도서관 건축 장면 <ol><li> 자료를 시작으로 샘플 당 고품질의 총 RNA의 1 μg을 사용합니다. </li><li> 라이브러리를 구축하려면, Illumina (프로토콜 # 15008136 목사)에서 표준 절차를 수행하십시오. 이 프로토콜에서는 폴리의 두 발 (A)가 포함 된 mRNA의 선택은 rRNA 배열을 최소화하기 위해 rRNA를 제거하는 수행됩니다. </li><li> Experion 자동 전기 영동 역 (에서 표준 프로토콜에 따라 Experion의 DNA 1K 칩을 사용하여 라이브러리의 품질 평가 <a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.com을</a> ). </li><li> qPCR을 사용하여 라이브러리를 수량화 : 이전에 표준 곡선과 출혈도 잡았 어댑터에 대한 특정 프리 머으로 순서가 된 라이브러리를 사용합니다. 알 수없는 라이브러리 (예 : 1:100, 1:500 및 1:1,000)의 dilutions의 범위를 사용합니다. qPCR acco를 실행SyberGreen MM 프로토콜에 rding 각 도서관의 원래 주식 농도를 계산합니다. </li><li> 클러스터 흐름 셀을 할 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 10 NM하고 저장할 라이브러리 주식을 희석. </li><li> 경우 클러스터 흐름 셀을 할 준비가 물 목욕에 cBot 시약 판을 해동. cBot은 클러스터 생성 과정을 간소화하는 데 사용 Illumina 악기입니다. </li><li> cBot 악기를 씻으십시오. </li><li> 라이브러리를 변성 : 튜브의 측면에 13 μl 1X TE 6 μl 10 μM 라이브러리 및을 조합 한 μl 1 N NaOH를 (Illumina에서 제공)를 추가합니다. 소용돌이, 스핀 다운 5 분 동안 실온에서 배양과 얼음의 변성 라이브러리를 배치합니다. </li><li> 라이브러리를 희석 : 12 PM의 최종 농도에 996 μl HT1과 4 μl 변성 라이브러리를 결합하여 사전에 차가운 하이브 리다이 제이션 버퍼로 변성 라이브러리 (HT1, Illumina에서 제공)을 희석. 얼음의 변성과 희석 라이브러리를 배치합니다. </li><li> , cBot 판의 튜브의 각 행을 반전모든 시약이 해동되어 있도록. 판 스핀 다운 / 펑크 호일 씰을 제거하고 cBot에로드합니다. </li><li> 스트립 관의 희석, 변성 도서관 나누어지는 120 μl는, 1-8이라는. 제어 스파이크 -에서와 같이 각 튜브에 1.2 μl 희석, 변성 PhiX 제어 라이브러리를 (Illumina에서) 추가합니다. 소용돌이와 튜브를 스핀 다운하고 올바른 방향으로 cBot (오른쪽 튜브 # 1)을로드합니다. </li><li> cBot로 흐름 셀 및 매니 폴드를로드합니다. </li><li> 흐름이 확인하고 클러스터링 실행을 시작 완료합니다. </li><li> 실행이 완료되면 모든 차선에서 시약 납품을 확인합니다. 모든 이상주의하십시오. 어느 4 ° C.에서 바로 시퀀싱 실행을 시작하거나 제공된 튜브에 흐름 세포를 저장 </li><li> 시퀀싱 별 합성 (SBS, Illumina) 시약을 해동. </li><li> 절단 믹스를 만진 후에는 다른 시약을 터치하지 않도록하고, 시약 트레이에 적절한 장소에 시약을로드합니다. </li><li> 더를 사용하여N-시퀀싱 흐름 셀 (즉, 이전에 순서가되었다 하나), 주요 시약 선 두 번. </li><li> 철저하게 70 % EtOH 및 렌즈 종이에 이어 70 % EtOH와 Kimwipes과 시퀀싱 흐름 세포를 청소하십시오. 모든 줄무늬의 흐름 셀을 검사합니다. 그 필요한 경우 다시 청소하십시오. </li><li> 시퀀서에 흐름 셀을로드하고 매니 폴드 및 흐름 세포 사이의 인감 꽉 있는지 확인 확인 흐름을 수행합니다. </li><li> 시퀀싱 실행을 시작합니다. </li><li> 사람들이 실행하는 동안 제공 될 품질 측정 항목을 (클러스터 밀도를 예를 들어, 필터를 통과 클러스터, 질문 30, 강도) 평가합니다. </li><li> 실행에 걸쳐 강도를 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 101 사이클이 완료되고 나면, 두 번째 읽기 완료 처리 화학을 수행 페어​​ 최종 시약 및 두 번째 읽기 설립 버퍼 (ICB, SBS 시약의 구성 요소, Illumina)를 해동 및 시약을로드합니다. </li><li> 제 2는 강도, 질문 30를 참조 평가, 순서 실행을 계속실행 진행 차 기타 품질 통계를 확인할 수 있습니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 각 샘플에 대해 하나의 fastq 파일의 생성을 보장하기 위해 0으로 fastq-클러스터 수를 설정. fastq 파일에 기본 통화 파일 (. BCL) 파일을 변환 할 수 CASAVA (Illumina, 현재 1.8.2)의 최신 버전을 사용 . 하류 분석을위한 fastq 파일의 압축을 풉니 다. </li><li> RNA-seq은 매우 높은 처리량 짧은 읽기 aligner (Bowtie, 0.12.7) 6 SAMtools을 (0.1 사용 포유류의 크기 genomes을 읽어 정렬 TopHat (1.4.1) 5의 최신 버전을 사용하여 쌍으로 최종 정렬을 수행합니다. 17) 7. SAMtools는 SAM 형식의 후 처리 정렬을위한 다양한 유틸리티를 구현합니다. 참조 인간 transcriptome는 iGenomes (에서 다운로드 할 수 있습니다 <a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a> ). TopHat를 실행, 우리는 FR-unstranded (기본값)로 라이브러리 유형 옵션을 포함한 모든 기본 매개 변수 설정을 사용했습니다. </li><li> 우리8 소프트웨어 패키지 프로그램 CuffDiff, 커프스 단추의 일부를 (1.3.0) 들죠, 인간의 참조 transcriptome에 따라 이전에 differentially 표현 유전자 성적 증명서를 화면에 컨트롤 세포에 트롬빈 - 처리 세포를 비교합니다. 이 비교 알려진 성적 차등 표현을 감지합니다. 테이블 형태의 결과를 시각화하기 위해 Microsoft Excel을 사용합니다. 커프스 단추 프로그램을 실행에서, 우리는 모든 기본 매개 변수 설정을 사용했습니다. FPKM &lt;0.05 및 P&gt;있는 사람 유전자 성적은 0.05는 제외됩니다. </li><li> 소설 isoforms을 검색하려면, 참조 transcriptome없이 커프스 단추를 실행합니다. Cuffcompare를 사용하여 참조 게놈에 샘플 스크립트 파일을 비교 한 분석을위한 참조 게놈과 두 번째 분석을위한 참조 게놈으로 통합 제어 스크립트 파일로 결합 된 트롬빈 대본 파일을 사용 Cuffdiff으로 차등 표현을 테스트합니다. 표 형식의 결과를 시각화하기 위해 Microsoft Excel을 사용합니다. 다시 도스FPKM &lt;0.05 및 P&gt;과 전자 유전자 성적은 0.05는 제외됩니다. 이 단계 후, 조사관은 UCSC 게놈 브라우저 웹 사이트 (에 새로보고 된 성적 증명서의 목록을 업로드하도록 선택할 수 있습니다 <a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a> 수동으로 검사하여 유효성을 확인하기 위해). </li><li> 독창성 경로 분석 (IPA에 differentially 표현 유전자의 목록을 제출 <a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a> 트롬빈 치료에 의해 ​​영향을 유전자 및 경로의 특성을 위해). 이 단계에서, 수사관들이 CummeRbund (사용하도록 선택할 수 있습니다 <a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a> 시각화, 관리 할 수 있도록), 커프스 단추 RNA-seq 출력을 분석하는 작업을 지원하고 단순화하도록 설계되었습니다 R 패키지를, 그리고 Cuffdiff 분석에 의해 생산의 모든 데이터를 통합 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 수량 실시간 - 포에 의한 RNA-seq 결과의 유효성을 검사lymerase의 연쇄 반응 (qRT-PCR) <ol><li> 제어 및 트롬빈 - 처리 HMVEC - LBl 세포 RN​​A 품질 평가 및 1.6 단계 1.4에 설명 된 RNA의 정량화에서 총 RNA 격리를 수행합니다. </li><li> 제조업체의 지침 (Invitrogen, 18080-051)에 따라 윗 첨자 III 1 스트랜드 합성 시스템 RT 키트 각 샘플의 1 μg 총 RNA에서 DNA 보완를 생성 할 수 있습니다. </li><li> CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor의 검출을위한 Taqman 분석 주문형 설계 oligonucleotides를 사용하여 응용 Biosystems ViiA 7 리얼 타임 PCR 시스템에 qRT-PCR 분석을 수행 - 관련 인자 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) 및 β-고를 (ACTB, Hs99999903_m1). 각 샘플은 총 RNA의 5 NG에 해당 템플릿을했습니다. DDCt 방법을 사용 quantitation를 측정하고 β-고를를 정상화. 각 분석은 복제 적어도 세 생물학에 걸쳐 수행되었다. </li></ol>

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
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</ol>

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주요 단계 RNA 처리 : RNases는, 가장 높은 품질의 RNA를 저하됩니다 따라서 치료는 RNA (10)의 분리, 저장, 사용하는 동안주의해야합니다. 장갑은 항상 인간의 손에있는 RNases하여 오염을 방지하기 위해 착용하고 있습니다. 장갑은 특히 터치 피부, 문 손잡이 또는 기타 일반적인 표면 후, 자주 변경해야합니다. 피펫의 세트 작업을 RNA에 전적으로 헌신해야하고 모든 팁과 튜브는 RNase 무료이​​어야합니다. RNA 격리 및 응용 프로그램 하류는 정기적으로 이러한 RNase-해치와 같은 제품과 함께 소독 아르 트래픽이 낮은 지역에서 수행해야합니다. 저하는 반복 냉동 해동 사이클 발생할 수 있습니다. 이러한 고립 즉시 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 RNA를 aliquoting하여 최소화 할 수 있습니다. 또는 cDNA 직접 고립 된 이후로 qRT-PCR과 같은 다운 스트림 응용 프로그램에 만들 수 있습니다. RNA...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> 시약 및 장비 </td><td width="85"> 회사 </td><td width="185"> 카탈로그 번호 </td><td width="359"> 코멘트 </td></tr><tr><td> 인간 폐 Microvascular 내피 세포 </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, 글 머리 기호 키트 </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> EGM-2, FBS, 성장 요인 및 항생제를 포함 </td></tr><tr><td> 트롬빈 </td><td> 시그마 </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion 미르 Vana 키트 </td><td> 생명 기술 </td><td> 오전 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-해치 </td><td> 생명 기술 </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens RNA </td><td> 바이오 RAD </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNA 준비키트 </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> AMPureXP 비즈 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> 어깨 역 Transcriptase II </td><td> 생명 기술 </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion DNA의 1K </td><td> 바이오 RAD </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE 클러스터 생성 키트 </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX 제어 키트 </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 사이클 SBS 키트 </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> cBot </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> qPCR 기계 - Viia7 </td><td> 생명 기술 </td><td> 모델 # VIIA7 / 장비 # 10631261 </td><td> 또는 동급 </td></tr><tr><td> Experion 시스템 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer는 다른 시스템입니다 </td></tr><tr><td> 분광 광도계 </td><td> 바이오 테크 </td><td> 시대 Microplate 분광 </td><td> 또는 동급 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 - Sorvall 전설 XTR </td><td> 열 과학 </td><td> 75004521 </td><td> 또는 동급 </td></tr><tr><td> 자기 스탠드 </td><td> 생명 기술 </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> thermocycler 96 - 웰 </td><td> 일반 실험실 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 주요 시약 및 주요 E 표 3. 목록quipment. * 동영상에서는 대신 HiScanSQ의 HiSeq1000이 입증되었습니다. </td></tr></tbody></table>

rna-seq의 트롬빈 - 처리의 transcriptomes 분석 및 제어 인간 폐 microvascular 내피 세포

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

mRNA 수준의 측정을 통해 세포의 유전자 발현의 특성은 세포의 전사 기계가 외부 신호 (예 : 약물 치료), 또는 어떻게 세포가 건강한 상태와 병에 걸린 상태 사이의 차이에 의해 영향을하는 방법을 결정하는 유용한 도구입니다. 차세대 DNA 시퀀싱 기술의 출현과 지속적인 개량을 통해 RNA-시퀀싱 (RNA-seq)는 성적 증명서의 모든 종류를 분류하기위한 모든 표현 유전자의 전사 구조를 파악하고 계량화 할 수 transcriptome 분석의 점점 인기있는 방법이되었다 주어진 셀, 조직 또는 유기체 1,2의 성적 증명서의 총 집합의 변화 표현 수준. RNA-seq은 점차 그 완전한 transcriptome를 프로파일의 장점을 가지고 있기 때문에, transcriptome 분석을위한 선호하는 방법으로 DNA의 microarrays를 대체하는 디지털 형 자료 (모든 증명서의 사본 번호)를 제공하고 알려진 게놈의 sequen에 의존하지 않습니다CE 3. 여기, 우리는 함께 또는 트롬빈 치료없이 인간의 폐 microvascular 내피 세포에 프로필 transcriptomes에 RNA-seq를 적용 할 수있는 완전하고 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 자격이 최근 출판 연구에 기초가 성공적으로 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 첫 번째 전체 transcriptome 분석을 수행하는 4 &quot;RNA-seq은 트롬빈으로 치료 인간의 폐 Microvascular 내피 세포의 유전자와 Isoforms의 소설 Transcriptome를 보여&quot; 트롬빈은 RNA-seq을 사용하여 치료. 그것은 염증 조건, 암, 당뇨병, 관상 동맥 심장 질환의 pathogenesis에 트롬빈로 인한 내피 기능 장애의 근간이 분자 메커니즘에 통찰력을 얻기 위해 추가 실험을위한 전례없는 자원을 굴복, 이러한 질병에 대한 치료 타겟에 대한 잠재적 인 새 리드를 제공합니다. 이 프로토콜의 설명 텍스트네 부분으로 나누어 져 있습니다. 첫 번째 부분은 트롬빈과 RNA 분리, 품질 분석 및 정량화와 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 치료에 대해 설명합니다. 두 번째 부분은 도서관 건설 및 시퀀싱에 대해 설명합니다. 세 번째 부분은 데이터 분석에 대해 설명합니다. 네 번째 부분은 RT-PCR 검증 분석을 설명합니다. 몇 가지 주요 단계를 대표 결과가 표시됩니다. 주요 단계에서의 성공을 높일 수 유용한 팁이나주의 사항은 토론 섹션에서 제공됩니다. 이 프로토콜은 트롬빈로 치료 인간의 폐 microvascular 내피 세포를 사용하지만, 그것은 포유류와 비 포유류의 세포 모두에서 서로 다른 자극이나 억제제, 또는 건강 상태 사이의 셀이나 조직에 transcriptomes를 비교로 치료 조직의 프로필 transcriptomes에 일반화 할 수 및 질병 상태.

1 단계의 경우 : 28s : 18의 비율은 전통적으로 RNA 저하의 지표로 사용됩니다. 이상적으로, 28s 피크는 18 밴드 (2의 비율)의 약 두 배 공간을 갖추고해야하지만이 이상적인 비율은 자주 연습에서 볼 수 없습니다. 또한, 28s : 분광 방법에서 얻은 18 비율은 RNA의 저하의 양을 과소 평가 할 수 있습니다. 보다 정확하게 저하, 따라서 RNA 샘플의 품질을 수량화하기 위해 Experion 시스템은 RNA 품질 표시 (RQI) 번호를 계산합니다. RQI 알고리즘은 표준화 저하 RNA 샘플의 시리즈에서 데이터 RNA 샘플의 electropherogram을 비교하여 자동으로 10 일 (그대로 RNA)과 1 (저하 RNA) 사이의 숫자를 반환합니다. RNA 품질이 8보다 이상적으로 큰 최소 7의 RQI을 가지고 있어야합니다. 그림 2는 8.4의 RQI과 높은 품질의 RNA 샘플을 사용하여 Experion 결과를 보여줍니다. <p class="jove...

이 프로토콜은 다음과 같은 또는 트롬빈 치료없이 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 프로필 transcriptomes에 RNA-seq, 강력한 차세대 DNA 시퀀싱 기술을 적용 할 완전하고 자세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 시약 또는 질병 상태에 의해 영향을 다양한 세포 나 조직에 generalizable 수 있습니다.

RNA-seq의 트롬빈 - 처리의 Transcriptomes 분석 및 제어 인간 폐 Microvascular 내피 세포

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

이 절차의 전반적인 목표는 강력한 차세대 DNA 염기서열분석 기술인 RNA-Seq를 전사체 프로파일링에 적용하기 위한 완전하고 상세한 프로세스를 제시하는 것입니다. 이는 먼저 트롬빈 처리 여부에 관계없이 인간 폐 미세혈관 내피 세포에서 전체 RNA를 분리하고 RNA 품질을 확인함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 이러한 RNA 샘플에서 DNA 라이브러리를 구성하는 것입니다.cbot 기기를 사용하여 클러스터 생성을 간소화하고 HighSeq 1000에서 DNA 염기서열분석 작업을 수행합니다. 다음으로 차등적으로 발현된 유전자 전사체를 최종적으로 식별하고 표시하기 위해 데이터 분석을 수행합니다. 마지막 단계는 RT TP CR로 RN aeq 결과를 검증하는 것입니다. 전사체 분석을 위한 DNA 마이크로 어레이와 같은 기존 방법에 비해 IC의 주요 장점은 IC가 완전한 전사체를 프로파일링하고 디지털 유형의 데이터를 제공하며 세포 내 유전자 발현의 알려진 게놈화에 의존하지 않는다는 것입니다.MRA 수치 측정은 세포 기계의 전사가 외부 신호에 의해 어떻게 영향을 받는지 또는 건강 상태와 질병 상태 간에 세포가 어떻게 다른지 결정하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜에서는 트로빈 처리의 전사체와 대조군 인간 폐 미세혈관 인도 신세포의 IC 분석을 시연합니다. 이 프로토콜은 인기 있는 차세대 DNA 염기서열 분석 플랫폼인 High SEQ 1000에서 RNA-Seq를 사용하여 트롬빈으로 처리된 인간 폐 미세혈관 내피 세포의 첫 번째 완전한 전사체 분석을 성공적으로 수행한 최근 발표된 연구를 기반으로 합니다. VS seven R-T-P-C-R 시스템을 사용하여 Dr.Denova는 인간 폐, 미세혈관 내피 세포 및 총 세포 RNA 분리의 트롬빈 처리를 시연할 예정이며, Mrs. Margaret Gibson은 Cbot에서 RNA 품질 및 DNA 라이브러리와 클러스터 생성을 확인하는 Experian 시스템을 시연할 예정입니다.그리고 Dimitri Gregor 박사는 이 프로토콜 문화를 시작하기 위해 데이터 분석을 시연할 것입니다. 인간의 폐 미세혈관 내피 세포는 90에서 100% 사이입니다.EGM의 6개 웰 플레이트에 5% FBS 성장 인자와 항생제가 함유된 2개의 배지. 트롬빈으로 치료하기 30분 전에 배지를 기아 매체로 교체하십시오.30분 후, 밀리리터당 0.05단위, 트롬빈으로 세포를 처리하거나 대조군으로 처리하지 않고 방치합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 6시간 동안 세포를 배양합니다. 6시간 치료 후.처리된 세포에서 총 RNA를 분리하고 제조업체의 지침에 따라 Nirvana 키트를 사용하여 세포를 대조합니다. Experian 자동 전기영동 스테이션의 표준 프로토콜에 따라 Experian 표준 감지 진핵생물, RNA 칩으로 RNA의 품질을 평가합니다. 마지막으로, 라이브러리 구축을 위한 표준 분광 광도측정 방법을 사용하여 RNA를 정량화합니다.샘플을 위한 시작 물질로 샘플당 1마이크로그램의 고품질 총 RNA를 사용합니다. 제조업체의 표준 프로토콜을 따릅니다. 이 프로토콜에서는 Mr.mRNA를 포함하는 poly의 두 라운드가 수행됩니다.RNA 염기서열분석을 최소화하기 위해 RNA를 제거하려면 Experian DNA one K 칩을 사용하여 라이브러리의 품질을 평가하십시오. Experian 자동 전기영동 스테이션의 표준 프로토콜에 따릅니다. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 라이브러리를 정량화합니다.서면 프로토콜에 설명된 대로 Q-R-T-P-C-R로 약칭됩니다. 이 비디오와 함께 사이버 그린 MM 프로토콜에 따라 Q-R-T-P-C-R을 실행하고 각 라이브러리의 원래 재고 농도를 계산합니다. 라이브러리 재고를 10나노몰로 희석하고 섭씨 20도에서 보관합니다.플로우 셀을 클러스터링할 준비가 되면 수조에서 cbot 시약 플레이트를 해동합니다. CBOT는 클러스터 생성 프로세스를 간소화하는 데 사용되는 도구입니다. cbot 기기를 세척한 후 먼저 13마이크로리터의 1XTE와 6마이크로리터의 10나노몰을 결합하여 라이브러리를 변성시킵니다.그런 다음 각 튜브의 측면에 1 마이크로 리터의 일반 수산화 나트륨을 넣고 튜브를 회전시키고 5 분 동안 실온에서 배양합니다. 그런 다음 변성된 라이브러리를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 996마이크로리터의 완충액과 4.0마이크로리터의 변성 라이브러리를 결합하여 12피코 어금니의 최종 농도를 얻어 사전 냉각된 혼성화 완충액으로 변성 라이브러리를 희석합니다.변성된 희석된 라이브러리를 위에 놓습니다. 그런 다음 cbot 플레이트의 각 튜브 행을 뒤집어 모든 시약이 해동되었는지 확인합니다. 플레이트를 회전시킨 후 수산화나트륨 튜브의 열에서 호일 씰을 제거하고 cbot 부분 표본에 로드합니다.120 마이크로리터의 희석된 변성 라이브러리를 1에서 8까지 표시된 스트립 튜브로 만듭니다. 1.2마이크로리터의 희석된 변성 PHI X 제어 라이브러리를 제어 스파이크로 각 튜브에 추가합니다. 튜브를 소용돌이치고 회전시킨 후 튜브 번호 1을 오른쪽에 놓고 올바른 방향으로 cbot에 로드합니다.플로우 셀(flow cell)과 매니폴드(manifold)를 cbot에 로드합니다. 흐름 검사를 완료하고 클러스터링 실행을 시작합니다. 실행이 완료된 후 모든 차선에서 시약 배송을 확인하십시오.모든 이상을 기록해 두십시오. 염기서열분석 실행을 즉시 시작하거나 제공된 튜브에 플로우 셀을 섭씨 4도의 온도에 보관하십시오. 염기서열분석을 시작합니다.합성 시약에 의한 염기서열분석을 해동합니다. 시약 트레이의 적절한 지점에 시약을 넣고 다른 시약을 만지지 않도록 합니다. cleavage mix를 만진 후 nons sequencing flow cell을 사용하여 시약 라인을 70% 에탄올과 Kim wipes로 두 번 철저히 세척한 다음 70% 에탄올과 렌즈 종이로 sequencing flow cell을 청소합니다.플로우 셀에 줄무늬가 있는지 검사하고 필요한 경우 다시 청소합니다. 플로우 셀을 시퀀서에 로드하고 플로우 검사를 수행하여 매니폴드와 플로우 셀 사이의 밀봉이 단단히 조여졌는지 확인합니다. 염기서열분석 실행을 시작합니다.실행 중에 사용할 수 있게 되는 품질 메트릭을 평가합니다.실행 전반에 걸쳐 강도를 모니터링합니다. 101 사이클이 완료된 후. 턴어라운드 화학을 수행하여 두 번째 판독을 완료합니다.첫 번째 아버지는 쌍을 이루고 시약을 읽고 두 번째 아버지는 통합 버퍼를 읽습니다. 그런 다음 시약을 로드하고 염기서열분석을 계속하고 평가를 실행합니다. 둘째, 실행이 진행됨에 따라 강도 Q3 및 기타 품질 메트릭을 읽습니다.데이터 분석을 시작하려면 최신 버전의 cassava를 사용하여 기본 호출 파일을 FAST Q 파일로 변환합니다. 빠른 Q 클러스터 수를 0으로 설정하여 단일 빠른 Q 파일을 만들 수 있습니다. 각 샘플에 대해 다운스트림 분석을 위해 빠른 Q 파일의 압축을 풉니다.초고처리량 단판독(short read) 및 SAM 형식의 후처리 정렬을 위한 다양한 유틸리티를 구현하는 SAM 도구를 사용하여 RNA-Seq 읽기를 포유류 크기 게놈에 정렬하는 최신 버전의 top hat을 사용하여 페어링 및 정렬을 수행합니다. 참조 인간 전사체는 실행 중인 I 게놈에서 다운로드할 수 있으며, 커프링크스 소프트웨어 패키지의 프로그램 cuff diff 부분을 사용하여 단편이 벗겨진 라이브러리 유형 옵션을 포함하여 모든 기본 매개변수 설정이 사용되었습니다. 트롬빈이 처리된 세포와 대조 세포를 비교합니다.human reference transcriptome을 기반으로 트롬빈 처리된 세포에서 차등적으로 발현된 유전자 전사체를 스크리닝합니다. 그런 다음 스프레드시트를 사용하여 결과를 테이블 형식으로 시각화합니다. 이 경우, 모든 기본 매개변수 설정이 사용되었으며, FPKM이 0.05 미만이고 p가 0.05보다 큰 유전자 전사체를 필터링하여 참조 없이 커프 링크를 실행하는 새로운 동형을 검출했습니다.전사체는 커프 비교를 사용하여 샘플 전사체 파일을 참조 게놈과 비교합니다. 결합된 트롬빈 전사체 파일을 한 번째 분석에 대한 참조 게놈으로 사용하고 결합된 대조군 전사체 파일을 두 번째 분석에 대한 참조 게놈으로 사용하여 커프 diff로 차등 발현을 테스트한 다음, 다시 스프레드시트를 사용하여 결과를 표 형식으로 시각화합니다. 이전과 마찬가지로 FPKM이 0.05 미만이고 p가 0.05보다 큰 유전자 전사체는 필터링되었습니다.이 단계가 끝나면 조사관은 새로 보고된 전사체 목록을 uc SC 게놈 브라우저 웹사이트에 업로드하여 수동 검사로 유효성을 확인할 수 있습니다. 차등적으로 발현된 유전자 목록은 트롬빈 처리에 의해 영향을 받는 유전자 및 경로의 특성화를 위해 Ingenuity 경로 분석에 제출할 수도 있습니다. 이 단계에서 조사자는 커프 차이 분석에 의해 생성된 모든 데이터를 관리, 시각화 및 통합하는 데 도움이 되는 커프스 단추 RN aeq 출력 분석 작업을 지원하고 단순화하도록 설계된 R 패키지인 cummerbund를 사용하도록 선택할 수 있습니다.RN aeq 결과의 검증은 먼저 Q-R-T-P-C-R에 의해 수행되고, 비디오의 앞부분에서 시연된 바와 같이 대조군 및 트롬빈 처리된 인간 폐 미세혈관 내피 세포에서 전체 RNA 분리, RNA 품질 평가 및 RNA 정량화를 수행합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 위 첨자 3개의 첫 번째 가닥 합성 시스템 rt를 사용하여 각 샘플의 총 RNA 1마이크로그램에서 무료 DNA를 생성합니다. 마지막으로, 이 비디오와 함께 제공되는 서면 프로토콜에 나열된 TAC MAN 어세이 온 디맨드 설계 뉴클레오티드를 사용하여 VI a seven real-time PCR 시스템에서 Q-R-T-P-C-R 분석을 수행하고 여기에 설명된 대로 정량을 측정합니다.28 S 대 18 S 비율은 전통적으로 RNA 분해의 지표로 사용되었으며, 분해를 보다 정확하게 정량화하기 위해 경험 시스템은 RNA 품질 지표 또는 RQI 번호를 계산합니다. RQI 알고리즘은 RNA 샘플의 전기표도를 일련의 표준화된 분해된 RNA 샘플의 데이터와 비교하고 10에서 1 사이의 숫자를 자동으로 반환합니다. RNA 샘플의 RQI는 7 이상이어야 하며 이상적으로는 8 이상이어야 합니다.이러한 Experian 결과는 RQI가 8.4인 고품질 RNA 샘플을 나타냅니다. 라이브러리는 고품질 라이브러리에 대한 이 Experian 결과 그림에 표시된 것처럼 약 250-300 염기쌍의 광대역을 가져야 합니다. 여기에서는 표준 곡선 샘플과 하나의 미지 샘플의 Q-R-T-P-C-R 결과가 표시됩니다.염기서열분석 실행의 진행 상황과 품질은 실행 전반에 걸쳐 지속적으로 관찰되어야 합니다. 이 그림은 첫 번째 주기 이미징 단계 동안 적절한 클러스터 밀도를 보여줍니다. 이것은 실행의 첫 번째 표시입니다.고품질 클러스터는 밝고 집중적이어야 합니다. 제1 사이클의 완료 후에 생성된 제1 베이스 리포트의 일 예가 도시되어 있다. 이 시점에서 예상되는 클러스터 밀도 강도 수준과 초점 품질을 평가하는 것이 중요합니다.주기 4 이후의 다음 품질 검사점이 여기에 표시됩니다. 이는 각 레인에 대한 절대 클러스터 밀도를 보여줍니다. 클러스터 밀도는 사이클 13 이후 제곱밀리미터당 850K를 넘지 않아야 합니다.Phasing 및 Pre phaseing 통계가 계산됩니다. 일반적인 숫자는 0.1에서 0.25 사이입니다. 주요 품질 평가는 여러 품질 지표가 계산되는 주기 24 이후에 가능합니다.Q3 이상의 판독 비율은 기저에 대한 신뢰도를 측정한 것입니다. Q 점수가 3인 읽기를 호출하면 기본 호출이 잘못될 확률이 1000분의 1임을 의미합니다. Q 점수는 실행이 진행됨에 따라 감소하지만 Q3를 충족하거나 초과하는 읽기의 95% 이상으로 시작해야 합니다. filter 또는 pf를 전달하는 클러스터는 실제 시퀀스 데이터를 가져올 클러스터입니다.이상적으로는 85% 이상이어야 합니다.클러스터 pf는 위상 조정, 사전 위상 강도를 포함한 여러 요인을 기반으로 하며 실행이 진행됨에 따라 변경되지 Q3.It. 정렬된 비율은 FI x 게놈에 실시간으로 정렬되는 판독값의 측정값입니다. 약 1%FI x 라이브러리가 샘플 라이브러리로 급증했기 때문에 정렬된 비율은 0.5에서 1 사이여야 합니다.이 통계는 라이브러리 콘텐츠가 클러스터에 의해 잘 표현되고 여기에 나열된 클러스터 생성 편향이 대조군 및 트롬빈 처리된 인간 폐 미세혈관 내피 세포 모두에서 발현된 유전자 및 동형이 없음을 보여줍니다. 특히, 약 26,000개의 새로운 동형이 검출되었으며, 이는 RN aeq의 강도를 보여줍니다. 미지의 RNA를 식별할 수 있습니다.대안적으로, 스플라이싱된 전사체 및 대안적인 프로모터 사용, 마이크로어레이 기술에 의해 검출될 수 없음. RNA-Seq는 또한 대체 접근 방식을 사용하여 RNA-Seq 결과를 검증하기 위해 마이크로어레이에 의해 부정확하거나 정량화되거나 검출되지 않는 덜 풍부한 전사체를 측정할 수 있습니다. A-Q-R-T-P-C-R 실험을 수행하여 RNA-Seq 데이터에서 3개의 서로 다른 유전자를 분석했으며, TR 하나는 7.96배 자체에 의해 상향 조절되었습니다.Q-R-T-P-C-R 데이터에서 1개는 1.16배 하향 조정되었고 2개는 1.70배 하향 조정되었으며, 이러한 해당 수치는 각각 플러스 7.25배에서 1.15배를 뺀 값과 마이너스 2.07배입니다. RNA-Seq 및 Q-R-T-P-C-R에 의해 분석된 이 세 가지 유전자의 결과는 RNA-Seq 결과를 확증하는 양호한 일치를 보입니다. 이 프로토콜은 상급 세포에서 트로빈 처리된 인간 폐 미세혈관의 한 시점에 IC에 특이적이지만, 다중 시점 연구 또는 다른 자극 또는 억제제로 처리된 다른 세포 조직에 대한 연구 또는 건강한 상태와 질병 상태 사이의 세포 또는 조직 내 전사체 비교에 쉽게 적용할 수 있습니다.이 프로토콜은 High SQ 1000에 특이적이지만 HighSeq 제품군 또는 게놈 분석기에 적용할 수 있습니다. 클러스터 생성 단계와 염기서열분석 시약을 약간 수정한 두 개의 기기. solid series와 같은 다른 차세대 DNA 염기서열분석 플랫폼.GS 시스템과 일부 새로운 시스템도 RNA-Seq의 목적으로 사용됩니다. 라이브러리 구성 및 염기서열분석 절차는 약간 다를 수 있지만 이 프로토콜에 제시된 RNA 처리 팁, 데이터 분석 부분 및 R-T-P-C-R에 의한 검증은 RNA-Seq 응용 분야에 참조 가치가 있을 수 있습니다.

rna-seq-analysis-transcriptomes-thrombin-treated-control-human

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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