RNA-seq의 트롬빈 - 처리의 Transcriptomes 분석 및 제어 인간 폐 Microvascular 내피 세포

이 절차의 전반적인 목표는 강력한 차세대 DNA 염기서열분석 기술인 RNA-Seq를 전사체 프로파일링에 적용하기 위한 완전하고 상세한 프로세스를 제시하는 것입니다. 이는 먼저 트롬빈 처리 여부에 관계없이 인간 폐 미세혈관 내피 세포에서 전체 RNA를 분리하고 RNA 품질을 확인함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 이러한 RNA 샘플에서 DNA 라이브러리를 구성하는 것입니다.

cbot 기기를 사용하여 클러스터 생성을 간소화하고 HighSeq 1000에서 DNA 염기서열분석 작업을 수행합니다. 다음으로 차등적으로 발현된 유전자 전사체를 최종적으로 식별하고 표시하기 위해 데이터 분석을 수행합니다. 마지막 단계는 RT TP CR로 RN aeq 결과를 검증하는 것입니다. 전사체 분석을 위한 DNA 마이크로 어레이와 같은 기존 방법에 비해 IC의 주요 장점은 IC가 완전한 전사체를 프로파일링하고 디지털 유형의 데이터를 제공하며 세포 내 유전자 발현의 알려진 게놈화에 의존하지 않는다는 것입니다.

MRA 수치 측정은 세포 기계의 전사가 외부 신호에 의해 어떻게 영향을 받는지 또는 건강 상태와 질병 상태 간에 세포가 어떻게 다른지 결정하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜에서는 트로빈 처리의 전사체와 대조군 인간 폐 미세혈관 인도 신세포의 IC 분석을 시연합니다. 이 프로토콜은 인기 있는 차세대 DNA 염기서열 분석 플랫폼인 High SEQ 1000에서 RNA-Seq를 사용하여 트롬빈으로 처리된 인간 폐 미세혈관 내피 세포의 첫 번째 완전한 전사체 분석을 성공적으로 수행한 최근 발표된 연구를 기반으로

. VS seven R-T-P-C-R 시스템을 사용하여 Dr.Denova는 인간 폐, 미세혈관 내피 세포 및 총 세포 RNA 분리의 트롬빈 처리를 시연할 예정이며, Mrs. Margaret Gibson은 Cbot에서 RNA 품질 및 DNA 라이브러리와 클러스터 생성을 확인하는 Experian 시스템을 시연할 예정입니다.

그리고 Dimitri Gregor 박사는 이 프로토콜 문화를 시작하기 위해 데이터 분석을 시연할 것입니다. 인간의 폐 미세혈관 내피 세포는 90에서 100% 사이입니다.EGM의 6개 웰 플레이트에 5% FBS 성장 인자와 항생제가 함유된 2개의 배지. 트롬빈으로 치료하기 30분 전에 배지를 기아 매체로 교체하십시오.

30분 후, 밀리리터당 0.05단위, 트롬빈으로 세포를 처리하거나 대조군으로 처리하지 않고 방치합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 6시간 동안 세포를 배양합니다. 6시간 치료 후.

처리된 세포에서 총 RNA를 분리하고 제조업체의 지침에 따라 Nirvana 키트를 사용하여 세포를 대조합니다. Experian 자동 전기영동 스테이션의 표준 프로토콜에 따라 Experian 표준 감지 진핵생물, RNA 칩으로 RNA의 품질을 평가합니다. 마지막으로, 라이브러리 구축을 위한 표준 분광 광도측정 방법을 사용하여 RNA를 정량화합니다.

샘플을 위한 시작 물질로 샘플당 1마이크로그램의 고품질 총 RNA를 사용합니다. 제조업체의 표준 프로토콜을 따릅니다. 이 프로토콜에서는 Mr.mRNA를 포함하는 poly의 두 라운드가 수행됩니다.

RNA 염기서열분석을 최소화하기 위해 RNA를 제거하려면 Experian DNA one K 칩을 사용하여 라이브러리의 품질을 평가하십시오. Experian 자동 전기영동 스테이션의 표준 프로토콜에 따릅니다. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 라이브러리를 정량화합니다.

서면 프로토콜에 설명된 대로 Q-R-T-P-C-R로 약칭됩니다. 이 비디오와 함께 사이버 그린 MM 프로토콜에 따라 Q-R-T-P-C-R을 실행하고 각 라이브러리의 원래 재고 농도를 계산합니다. 라이브러리 재고를 10나노몰로 희석하고 섭씨 20도에서 보관합니다.

플로우 셀을 클러스터링할 준비가 되면 수조에서 cbot 시약 플레이트를 해동합니다. CBOT는 클러스터 생성 프로세스를 간소화하는 데 사용되는 도구입니다. cbot 기기를 세척한 후 먼저 13마이크로리터의 1XTE와 6마이크로리터의 10나노몰을 결합하여 라이브러리를 변성시킵니다.

그런 다음 각 튜브의 측면에 1 마이크로 리터의 일반 수산화 나트륨을 넣고 튜브를 회전시키고 5 분 동안 실온에서 배양합니다. 그런 다음 변성된 라이브러리를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 996마이크로리터의 완충액과 4.0마이크로리터의 변성 라이브러리를 결합하여 12피코 어금니의 최종 농도를 얻어 사전 냉각된 혼성화 완충액으로 변성 라이브러리를 희석합니다.

변성된 희석된 라이브러리를 위에 놓습니다. 그런 다음 cbot 플레이트의 각 튜브 행을 뒤집어 모든 시약이 해동되었는지 확인합니다. 플레이트를 회전시킨 후 수산화나트륨 튜브의 열에서 호일 씰을 제거하고 cbot 부분 표본에 로드합니다.

120 마이크로리터의 희석된 변성 라이브러리를 1에서 8까지 표시된 스트립 튜브로 만듭니다. 1.2마이크로리터의 희석된 변성 PHI X 제어 라이브러리를 제어 스파이크로 각 튜브에 추가합니다. 튜브를 소용돌이치고 회전시킨 후 튜브 번호 1을 오른쪽에 놓고 올바른 방향으로 cbot에 로드합니다.

플로우 셀(flow cell)과 매니폴드(manifold)를 cbot에 로드합니다. 흐름 검사를 완료하고 클러스터링 실행을 시작합니다. 실행이 완료된 후 모든 차선에서 시약 배송을 확인하십시오.

모든 이상을 기록해 두십시오. 염기서열분석 실행을 즉시 시작하거나 제공된 튜브에 플로우 셀을 섭씨 4도의 온도에 보관하십시오. 염기서열분석을 시작합니다.

합성 시약에 의한 염기서열분석을 해동합니다. 시약 트레이의 적절한 지점에 시약을 넣고 다른 시약을 만지지 않도록 합니다. cleavage mix를 만진 후 nons sequencing flow cell을 사용하여 시약 라인을 70% 에탄올과 Kim wipes로 두 번 철저히 세척한 다음 70% 에탄올과 렌즈 종이로 sequencing flow cell을 청소합니다.

플로우 셀에 줄무늬가 있는지 검사하고 필요한 경우 다시 청소합니다. 플로우 셀을 시퀀서에 로드하고 플로우 검사를 수행하여 매니폴드와 플로우 셀 사이의 밀봉이 단단히 조여졌는지 확인합니다. 염기서열분석 실행을 시작합니다.

실행 중에 사용할 수 있게 되는 품질 메트릭을 평가합니다.실행 전반에 걸쳐 강도를 모니터링합니다. 101 사이클이 완료된 후. 턴어라운드 화학을 수행하여 두 번째 판독을 완료합니다.

첫 번째 아버지는 쌍을 이루고 시약을 읽고 두 번째 아버지는 통합 버퍼를 읽습니다. 그런 다음 시약을 로드하고 염기서열분석을 계속하고 평가를 실행합니다. 둘째, 실행이 진행됨에 따라 강도 Q3 및 기타 품질 메트릭을 읽습니다.

데이터 분석을 시작하려면 최신 버전의 cassava를 사용하여 기본 호출 파일을 FAST Q 파일로 변환합니다. 빠른 Q 클러스터 수를 0으로 설정하여 단일 빠른 Q 파일을 만들 수 있습니다. 각 샘플에 대해 다운스트림 분석을 위해 빠른 Q 파일의 압축을 풉니다.

초고처리량 단판독(short read) 및 SAM 형식의 후처리 정렬을 위한 다양한 유틸리티를 구현하는 SAM 도구를 사용하여 RNA-Seq 읽기를 포유류 크기 게놈에 정렬하는 최신 버전의 top hat을 사용하여 페어링 및 정렬을 수행합니다. 참조 인간 전사체는 실행 중인 I 게놈에서 다운로드할 수 있으며, 커프링크스 소프트웨어 패키지의 프로그램 cuff diff 부분을 사용하여 단편이 벗겨진 라이브러리 유형 옵션을 포함하여 모든 기본 매개변수 설정이 사용되었습니다. 트롬빈이 처리된 세포와 대조 세포를 비교합니다.

human reference transcriptome을 기반으로 트롬빈 처리된 세포에서 차등적으로 발현된 유전자 전사체를 스크리닝합니다. 그런 다음 스프레드시트를 사용하여 결과를 테이블 형식으로 시각화합니다. 이 경우, 모든 기본 매개변수 설정이 사용되었으며, FPKM이 0.05 미만이고 p가 0.05보다 큰 유전자 전사체를 필터링하여 참조 없이 커프 링크를 실행하는 새로운 동형을 검출했습니다.

전사체는 커프 비교를 사용하여 샘플 전사체 파일을 참조 게놈과 비교합니다. 결합된 트롬빈 전사체 파일을 한 번째 분석에 대한 참조 게놈으로 사용하고 결합된 대조군 전사체 파일을 두 번째 분석에 대한 참조 게놈으로 사용하여 커프 diff로 차등 발현을 테스트한 다음, 다시 스프레드시트를 사용하여 결과를 표 형식으로 시각화합니다. 이전과 마찬가지로 FPKM이 0.05 미만이고 p가 0.05보다 큰 유전자 전사체는 필터링되었습니다.

이 단계가 끝나면 조사관은 새로 보고된 전사체 목록을 uc SC 게놈 브라우저 웹사이트에 업로드하여 수동 검사로 유효성을 확인할 수 있습니다. 차등적으로 발현된 유전자 목록은 트롬빈 처리에 의해 영향을 받는 유전자 및 경로의 특성화를 위해 Ingenuity 경로 분석에 제출할 수도 있습니다. 이 단계에서 조사자는 커프 차이 분석에 의해 생성된 모든 데이터를 관리, 시각화 및 통합하는 데 도움이 되는 커프스 단추 RN aeq 출력 분석 작업을 지원하고 단순화하도록 설계된 R 패키지인 cummerbund를 사용하도록 선택할 수 있습니다.

RN aeq 결과의 검증은 먼저 Q-R-T-P-C-R에 의해 수행되고, 비디오의 앞부분에서 시연된 바와 같이 대조군 및 트롬빈 처리된 인간 폐 미세혈관 내피 세포에서 전체 RNA 분리, RNA 품질 평가 및 RNA 정량화를 수행합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 위 첨자 3개의 첫 번째 가닥 합성 시스템 rt를 사용하여 각 샘플의 총 RNA 1마이크로그램에서 무료 DNA를 생성합니다. 마지막으로, 이 비디오와 함께 제공되는 서면 프로토콜에 나열된 TAC MAN 어세이 온 디맨드 설계 뉴클레오티드를 사용하여 VI a seven real-time PCR 시스템에서 Q-R-T-P-C-R 분석을 수행하고 여기에 설명된 대로 정량을 측정합니다.

28 S 대 18 S 비율은 전통적으로 RNA 분해의 지표로 사용되었으며, 분해를 보다 정확하게 정량화하기 위해 경험 시스템은 RNA 품질 지표 또는 RQI 번호를 계산합니다. RQI 알고리즘은 RNA 샘플의 전기표도를 일련의 표준화된 분해된 RNA 샘플의 데이터와 비교하고 10에서 1 사이의 숫자를 자동으로 반환합니다. RNA 샘플의 RQI는 7 이상이어야 하며 이상적으로는 8 이상이어야 합니다.

이러한 Experian 결과는 RQI가 8.4인 고품질 RNA 샘플을 나타냅니다. 라이브러리는 고품질 라이브러리에 대한 이 Experian 결과 그림에 표시된 것처럼 약 250-300 염기쌍의 광대역을 가져야 합니다. 여기에서는 표준 곡선 샘플과 하나의 미지 샘플의 Q-R-T-P-C-R 결과가 표시됩니다.

염기서열분석 실행의 진행 상황과 품질은 실행 전반에 걸쳐 지속적으로 관찰되어야 합니다. 이 그림은 첫 번째 주기 이미징 단계 동안 적절한 클러스터 밀도를 보여줍니다. 이것은 실행의 첫 번째 표시입니다.

고품질 클러스터는 밝고 집중적이어야 합니다. 제1 사이클의 완료 후에 생성된 제1 베이스 리포트의 일 예가 도시되어 있다. 이 시점에서 예상되는 클러스터 밀도 강도 수준과 초점 품질을 평가하는 것이 중요합니다.

주기 4 이후의 다음 품질 검사점이 여기에 표시됩니다. 이는 각 레인에 대한 절대 클러스터 밀도를 보여줍니다. 클러스터 밀도는 사이클 13 이후 제곱밀리미터당 850K를 넘지 않아야 합니다.

Phasing 및 Pre phaseing 통계가 계산됩니다. 일반적인 숫자는 0.1에서 0.25 사이입니다. 주요 품질 평가는 여러 품질 지표가 계산되는 주기 24 이후에 가능합니다.

Q3 이상의 판독 비율은 기저에 대한 신뢰도를 측정한 것입니다. Q 점수가 3인 읽기를 호출하면 기본 호출이 잘못될 확률이 1000분의 1임을 의미합니다. Q 점수는 실행이 진행됨에 따라 감소하지만 Q3를 충족하거나 초과하는 읽기의 95% 이상으로 시작해야 합니다. filter 또는 pf를 전달하는 클러스터는 실제 시퀀스 데이터를 가져올 클러스터입니다.

이상적으로는 85% 이상이어야 합니다.클러스터 pf는 위상 조정, 사전 위상 강도를 포함한 여러 요인을 기반으로 하며 실행이 진행됨에 따라 변경되지 Q3.It. 정렬된 비율은 FI x 게놈에 실시간으로 정렬되는 판독값의 측정값입니다. 약 1%FI x 라이브러리가 샘플 라이브러리로 급증했기 때문에 정렬된 비율은 0.5에서 1 사이여야 합니다.

이 통계는 라이브러리 콘텐츠가 클러스터에 의해 잘 표현되고 여기에 나열된 클러스터 생성 편향이 대조군 및 트롬빈 처리된 인간 폐 미세혈관 내피 세포 모두에서 발현된 유전자 및 동형이 없음을 보여줍니다. 특히, 약 26,000개의 새로운 동형이 검출되었으며, 이는 RN aeq의 강도를 보여줍니다. 미지의 RNA를 식별할 수 있습니다.

대안적으로, 스플라이싱된 전사체 및 대안적인 프로모터 사용, 마이크로어레이 기술에 의해 검출될 수 없음. RNA-Seq는 또한 대체 접근 방식을 사용하여 RNA-Seq 결과를 검증하기 위해 마이크로어레이에 의해 부정확하거나 정량화되거나 검출되지 않는 덜 풍부한 전사체를 측정할 수 있습니다. A-Q-R-T-P-C-R 실험을 수행하여 RNA-Seq 데이터에서 3개의 서로 다른 유전자를 분석했으며, TR 하나는 7.96배 자체에 의해 상향 조절되었습니다.

Q-R-T-P-C-R 데이터에서 1개는 1.16배 하향 조정되었고 2개는 1.70배 하향 조정되었으며, 이러한 해당 수치는 각각 플러스 7.25배에서 1.15배를 뺀 값과 마이너스 2.07배입니다. RNA-Seq 및 Q-R-T-P-C-R에 의해 분석된 이 세 가지 유전자의 결과는 RNA-Seq 결과를 확증하는 양호한 일치를 보입니다. 이 프로토콜은 상급 세포에서 트로빈 처리된 인간 폐 미세혈관의 한 시점에 IC에 특이적이지만, 다중 시점 연구 또는 다른 자극 또는 억제제로 처리된 다른 세포 조직에 대한 연구 또는 건강한 상태와 질병 상태 사이의 세포 또는 조직 내 전사체 비교에 쉽게 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 High SQ 1000에 특이적이지만 HighSeq 제품군 또는 게놈 분석기에 적용할 수 있습니다. 클러스터 생성 단계와 염기서열분석 시약을 약간 수정한 두 개의 기기. solid series와 같은 다른 차세대 DNA 염기서열분석 플랫폼.

GS 시스템과 일부 새로운 시스템도 RNA-Seq의 목적으로 사용됩니다. 라이브러리 구성 및 염기서열분석 절차는 약간 다를 수 있지만 이 프로토콜에 제시된 RNA 처리 팁, 데이터 분석 부분 및 R-T-P-C-R에 의한 검증은 RNA-Seq 응용 분야에 참조 가치가 있을 수 있습니다.