구현을위한 프로토콜 대장균을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

이 절차의 전반적인 목표는 전사 번역 또는 TX tl이라고 하는 대장균 기반 무세포 발현 시스템을 만드는 것입니다. 이는 먼저 TX TL 조세포 추출물, 아미노산 용액 및 에너지 용액의 세 가지 초기 구성 요소를 만들어 수행됩니다. 아미노산 용액과 에너지 용액은 나중에 TX TL 버퍼를 만들기 위해 결합됩니다.

두 번째 단계는 조세포 추출물을 보정하여 최적의 마그네슘, 칼륨 및 DTT 농도를 측정하여 최대 발현 수준의 TX TL 반응을 생성하는 것입니다. 다음으로, 보정 결과를 사용하여 버퍼 미처리 세포 추출물과 DNA로 구성된 3개의 튜브 TX TL 시스템을 만듭니다. 마지막 단계는 방금 만든 시약을 사용하여 TX TL 반응을 실행하는 것입니다.

궁극적으로 TX TL은 합성 생물학 회로와 기존의 무세포 발현 응용 분야를 시연하는 데 사용됩니다. 이 방법은 생체 내에서 이를 에뮬레이트하는 체외 동일 환경을 제공하여 합성 생물학 분야의 회로를 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 모든 프로토타이핑 단계를 생체 내에서 수행할 필요성을 제거함으로써 합성 생물학 설계의 속도를 높이는 방향으로 확장됩니다.

절차를 보조하는 것은 우리 그룹의 연구 조교인 Claire Hayes가 맡을 것입니다. 이 비디오는 촬영에 중요한 프로토콜의 일부 섹션만 진행한다는 점에 유의하시기 바랍니다. 전체 프로토콜은 텍스트 기사에서 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜의 초기에, 박테리아 세포를 성장시키고 펠릿화하였다. 이제 박테리아 세포는 비드 비터를 사용하여 용해됩니다. 세포 현탁액이 들어 있는 50밀리리터 팔콘 튜브를 모두 얼음 위에 보관하십시오.

이 비디오의 목적을 위해 하나의 튜브에 대해서만 비드 비드 장식을 시연합니다. 비드는 3개의 부분 표본으로 Falcon 튜브에 간헐적으로 첨가해야 하며, 각 분취량은 전체 비드의 1/3을 사용해야 합니다. 구슬의 첫 번째 부분 표본을 튜브 소용돌이에 30초 동안 넣고 얼음 위에 놓습니다.

같은 방법으로 구슬의 두 번째 부분 표본, 소용돌이를 넣고 얼음 위에 놓습니다. 마지막 부분 표본을 추가하고 볼텍싱을 한 후 비드가 균일하게 분포되었는지 확인하고 세 번째 와류 단계 후에 두꺼운 페이스트를 형성해야 합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

멸균 가위를 사용하여 끝을 잘라 5ml 용량의 피펫 팁을 준비합니다. 3-4mm 개구부를 만들려면 피펫을 2밀리리터로 다이얼합니다. 얼음 위에 20개의 멸균 비드 구슬 튜브를 놓습니다.

변형된 피펫을 사용하여 비드 셀 용액의 높은 점도를 확인합니다. 피펫 팁에서 거의 나오지 않을 정도로 점성이 있어야 합니다. 배출하는 동안 Falcon 튜브에서 비드 셀 용액을 제거하고 비드 비딩 튜브로 옮깁니다.

그것을 채우고, 3/4을 완전히 회전시키고, 미니 원심 분리기에서 아주 짧게 회전시킵니다. 비드를 재분배하지 않고 기포를 제거하려면 튜브에 비드 세포 용액을 추가하여 오목한 반월판을 형성하는 마무리를 합니다. 다음으로, 비드 비드 튜브 캡 내부에 매우 작은 방울의 비드 셀 용액을 추가합니다.

캡의 바깥쪽 입술에 용액이 들어가지 않도록 주의합니다. 그렇지 않으면 비드 비딩 튜브가 충분히 닫히지 않습니다. 평평한 표면의 캡을 두드리고 캡 바닥에 기포가 없는지 확인합니다.

비드 박동 튜브의 캡을 씌웁니다. 올바르게 수행되면 캡을 단단히 밀봉해야 합니다. 기포가 보이지 않아야 하며 여기에서 비드 셀 용액이 넘쳐나지 않는 경우 비드 비드를 효율적으로 수행하기 위해 두 사람이 필요합니다.

채워진 튜브를 비드 비드 부착을 위해 조수에게 건네는 동안 첫 번째 시연자는 나머지 비드 셀 용액으로 더 많은 비드 비드 튜브를 계속 채웁니다. 채워진 구슬 구슬 튜브를 얼음 위에 올려 놓습니다. 일단 두 개의 채워진 비드 구슬 튜브를 모아 최소 1분 동안 얼음 위에 두었습니다.

46 RPM에서 30초 동안 튜브 하나를 비드 비드 비드 작업으로 시작합니다. 얼음 위에 거꾸로 놓고 30초 동안 다른 튜브를 치십시오. 채워진 각 비드 구슬 튜브가 총 1분 동안 두드리도록 구슬 장식과 아이싱을 반복합니다.

채워진 모든 비드 비드 튜브가 처리되면 15ml 팔콘 튜브로 필터 장치를 구성합니다. 먼저 새 비드 구슬 캡 평평한 부분을 튜브 바닥까지 추가합니다. 그런 다음 처리된 비드 비딩 튜브에서 캡을 제거하고 완전히 밀봉될 때까지 처리된 비드 비딩 튜브의 끝에 마이크로 크로마토그래피 컬럼을 단단히 누릅니다.

마이크로 크로마토그래피 컬럼의 엘루시안 끝을 떼어내고 엘루시안으로 놓습니다. 빈 비드 구슬 튜브로 끝냅니다. 이 복합체를 15ml 매 튜브에 넣습니다.

채워진 모든 비드 비팅 튜브에 대한 필터 장치를 구성하고 얼음 위에 보관하십시오. 완전한 원심 분리기가 되면, 여과기 기구 팔콘 관은 구슬에서 추출물과 펠릿을 분리하기 위하여 4 섭씨 온도에 5 분 동안 6, 000 G에 뚜껑을 열었다. 원심분리 후 각 비드 비딩 튜브에서 실행 가능한 추출물이 생성되었는지 확인합니다.

적절하게 두들겨 맞은 추출물은 탁하지 않으며 펠릿은 왼쪽의 튜브에서 볼 수 있듯이 두 개의 뚜렷한 층을 갖게 됩니다. 오른쪽 예와 같이 탁한 튜브는 폐기해야 합니다. 비투리드 튜브의 상등액을 개별 1.75ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 가능한 한 적은 펠릿을 취합니다.

모든 비드 비딩 튜브가 처리될 때까지 얼음에 보관하십시오. 다음으로, 마이크로 원심분리기 튜브를 스핀다운하고 상층액을 수집합니다. 500 마이크로 리터의 펠릿없는 상등액을 새로운 비드 비딩 튜브로 통합 한 후.

캡을 제거한 튜브를 220RPM 및 37°C에서 80분 동안 배양합니다. 이것은 bead beading 과정에서 방출되는 내인성 엑소뉴클레아제를 사용하여 남아 있는 핵산을 소화합니다. 배양이 완료되면 추출물이 탁해 보일 것입니다.

1.75 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 추출물을 12, 000 G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 튜브당 최대 1.5 밀리리터까지 통합합니다. 피펫을 사용하여 펠릿이 없는 상등액을 1.75 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 넣어 더 적은 수율을 얻거나 15 밀리리터 팔콘 튜브를 사용하여 얼음에서 더 많은 수율을 얻을 수 있습니다. 튜브의 뚜껑을 덮고 뒤집어서 잘 섞습니다.

나중에 단백질 농도를 측정하기 위해 얼음 위에 10마이크로리터의 상등액을 저장하십시오. 생성된 추출물의 총량을 측정하고 S 30 B 버퍼에 2분 동안 담궈 10 분자량 차단 투석 카세트의 필요한 수를 수화합니다. 카세트에 최대 2.5ml의 추출물을 로드합니다.

각 비커는 최대 2개의 카세트를 사용할 수 있으며 섭씨 4도에서 3시간 동안 교반하여 투석할 수 있습니다. 투석 후 처리 단계에 대해서는 작성된 기사를 참조하십시오. 기본 전사 번역 반응은 조세포 추출물, 완충액 및 DNA의 세 부분으로 구성됩니다.

반응의 부피는 다양할 수 있지만 이 프로토콜은 사전 작성된 템플릿을 사용하여 10마이크로리터 반응을 수행합니다. 여기. 보라색 항목은 사용자 입력 값을 나타내고, 파란색 항목은 마스터 믹스 준비 섹션 및 DNA 준비 섹션을 사용하여 sili 실험을 설계하는 반응에 추가할 추가 시약을 나타냅니다. 일반적으로 상수는 마스터 믹스 준비 섹션에 넣을 수 있고 변수는 DNA 준비 섹션에 넣을 수 있습니다.

시료 증발 및 실험 시작 시간 편향을 방지하기 위해 실험당 시료를 최소화합니다. 샘플 설정이 이 표에 나와 있습니다. 각 샘플에 대한 DNA 샘플을 준비하기 위해 ID는 표시된 DNA 물과 사용자가 제공한 항목을 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다.

실온에서 완충액 추출물과 얼음 및 와류에 보관하는 글로벌 사용자 제공 품목으로 구성된 마스터 믹스를 준비합니다. 각 항목을 추가한 후 각 DNA 샘플에 적당량의 마스터 믹스를 첨가하고 실온에서 보관합니다. 이를 반응 시작 시간으로 취급합니다.

와류는 10, 실내 온도에 30 초 동안 000 G에 각 표본 및 분리기를 어떤 잔여 표본든지 끌어내리고 거품을 감소시키기 위하여 작동한다. 섭씨 29도의 384웰 플레이트에서 반응을 실행합니다. 실행 시간은 실험에 따라 다르지만 일반적으로 8시간 미만으로 지속됩니다.

실행이 완료되면 플레이트 리더에서 데이터를 읽을 수 있습니다. 이 논문은 내인성 대장균 기반 전사 번역 또는 TXTL cell-free 발현 시스템의 준비를 위한 5일 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템의 발현 조건은 다양한 플라스미드 처리 방법과 elucian buffer의 효과 테스트를 통해 최적화되었습니다.

예를 들어, 플라스미드 처리 방법의 비교에서는 정제 방법 1에서 kaya prep spin mini prep kit만 사용하는 반면, 정제 방법 2에서는 동일한 Mini Prep Kit를 사용하여 플라스미드를 준비한 다음 카약으로 후처리합니다. 빠른 PCR 정제 키트. 이 그래프는 8시간 후의 종말점 형광과 12분 이동을 기반으로 한 단백질 생산의 최대 속도를 보여줍니다. 평균 오차 막대는 서로 다른 날에 4번의 독립적인 실행에서 1 표준 편차입니다.

관찰된 발현의 차이는 염분 함량의 차이 때문입니다. 그러나 elucian buffer와 같은 다른 항목은 TXTL에 영향을 미치지 않을 수 있습니다. TS 염화물의 상이한 농도는 플라스미드의 1 ano molar의 발현을 기초로 한 cell-free 발현 반응에서 비교되었다.

주어진 농도는 트리스 클로라이드의 최종 농도입니다. 반응에서 사용되는 엘루시안 완충액은 10 밀리몰이며, 트리스 클로라이드 오류 막대는 서로 다른 날에 세 번의 독립적인 실행에서 하나의 표준 편차입니다. 이 그림은 추가 마그네슘 글루타메이트, 글루타민산 칼륨 및 DTT 수치에 대해 보정된 미처리 세포 추출물에 대한 일반적인 검량 플롯을 보여줍니다.

8시간 후의 종말점 형광과 12분 이동 평균을 기반으로 한 최대 단백질 생산 속도가 표시됩니다. 모든 조세포 추출물은 이 세 가지 변수에 대해 독립적으로 보정해야 합니다. 일반적으로 결과는 조세포 추출물이 마그네슘 글루타메이트 수치에 가장 민감하고 그 다음으로 글루타민산 칼륨 수치에 민감하다는 것을 나타냅니다.

이러한 플롯을 기반으로 추가 마그네슘 글루타메이트의 허용 가능한 범위는 4 밀리몰 글루타민산 칼륨은 60 - 80 밀리몰이고 DTT는 아래쪽에서 0 - 3 밀리몰 공기입니다. 각 조세포 추출물 준비의 최종 효율은 사용자 숙련도와 환경 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적인 수율 변화는 5%에서 10% 사이이지만, 서로 다른 연대에 제조된 두 개의 미가공 추출물의 종말점 형광이 여기에 나와 있습니다.

오차 막대는 서로 다른 날에 세 번의 독립적인 실행에서 하나의 표준 편차입니다. cell-free 발현 시스템을 입증하기 위해 Tet 억제를 기반으로 하는 negative feedback loop를 구성하고 TC가 있거나 없는 상태에서 실행된 동일한 회로를 테스트하여 7중 종말점 발현을 보여주었습니다. 8시간 동안 표현 오차 막대가 적용된 후 D-E-G-F-P 리포터의 변경은 서로 다른 날에 3개의 독립적인 실행에서 1개의 표준 편차입니다.

유전 회로는 삽입 부분에 표시되어 있습니다. 이 마지막 그림은 경쟁 미처리 세포 추출물의 비용 및 발현 분석을 보여줍니다. 의 파이 차트는 2012년 12월 기준 시약 비용과 시간당 14의 인건비를 기준으로 TX TL cell-free 발현 시스템의 인건비 및 재료 비용을 분류합니다.

패널 B는 TX cell-free 발현 시스템 비용을 다른 상용 시스템과 비교합니다. 비용은 마이크로리터당 세분화되지만 반응 부피는 키트마다 다를 수 있습니다. 이 시스템의 재료 비용은 마이크로리터 반응당 약 3센트이며, 이는 유사한 상용 무세포 시스템에 비해 98% 비용 절감입니다.

패널 C는 TX TL cell-free 발현 시스템 수율과 다른 상용 시스템의 수율을 비교한 것입니다. 이 시스템은 Lambda 파지 연산자가 있는 Sigma 70 기반 프로모터 또는 T seven 구동 프로모터를 사용하여 밀리리터당 최대 0.75mg의 리포터 단백질을 생산할 수 있습니다. 이러한 비교는 TX TL cell-free 발현 시스템이 T 7 기반 시스템이 유사한 상용 시스템에 엄청난 비용 절감을 추가하는 것과 동일한 양의 단백질을 생산할 수 있음을 나타냅니다.

우리는 이 기술이 합성 생물학에서 엔지니어링 프로세스를 단순화하는 길을 열기를 바랍니다.