Name: 구현을위한 프로토콜 대장균을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: 배우세요 대장균 기반 TX-TL 무세포 발현 시스템 구축 방법을 합성생물학 연구에 활용하세요. 이 프로토콜은 단백질 발현 최적화 및 생물학적 회로 테스트를 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공합니다.

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우리는 프로젝트의 초기 단계에서 지원을 Jongmin 김, 댄 Siegal-Gaskins, 아누 Thubagere 및 프로토콜을 간소화 도움 에녹 영, 클레어 첸과 바클레이 리 감사합니다. 이 물질은 생활 파운드리 프로그램, 계약 번호 HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS 또한 UCLA / Caltech의 의료 과학자 지원하는 방위 고등 연구 계획국 (DARPA / MTO)에 의해 부분적으로 지원 작업을 기반으로합니다 교육 프로그램의 교제에 의해 국방부, 과학 연구, 국방 과학 및 공학 대학원 (NDSEG) 원정대, 32 CFR의 168A의 공군 사무실은.이 문서에 포함 된 전망과 결론은 저자의 사람입니다과은 대표로 해석 할 수 없습니다 공식적으로 정책을 명시 적 또는 묵시적, 방위 고등 연구 프로젝트 기관 또는 미국 정부의.

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<li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+designing+and+building+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li>
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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 설명 된 내생 대장균 기반 TX-TL 무 세포 발현 시스템은 데이터 수집에 설정에서 여덟 개 미만의 시간이 걸릴 수 있습니다 쉬운 실행 세 튜브 반응이다. 모든 시약을 만드는 과정은 오일의 시간 합계 (하루 만에 상당한 노동 요구 사항)를 필요로하지만, 3000 반응에 조 추출물을 생산하고 버퍼 만들기 만 반응 시약 (그림 1). 또한, 조 추출물 및 버퍼 결정 시약 한 준비의 여러 사용을 허용, -80 ° C에서 1 년 이상 안정적이다. 4를 10 ㎕의 반응 당 $ 0.11 (노동을 포함하여 $ 0.26)에서, 비용은 비교 98 % 감소 상용 시스템 (그림 2). 몇 가지 해결되지 않은 제한 사항이 시스템에, 그러나,이 있습니다. 각 조 세포 추출물 제제의 단부 효율, 사용자 능력에, 환경 조건에 따라 달라질 수 있지만 typical 수율의 변화는 5 ~ 10 % (그림 4B) 사이에있다. 결과적으로, 두 종점 발현 및 발현 역학 뱃치 간 변이가 예상하여야한다. 추출물의 생성이 완전 자동화 될 때까지 추출이 완전히 특징이나 될 때까지 이러한 변화는 가능성이 남아 있습니다. 무 세포 발현 시스템은 민감한 정량 실험을 수행하는 데 사용되는 경우, 조 세포 추출물의 동일한 배치로 모든 실험을 실행하는 것이 바람직하다. 하나의 원유 세포 추출물 배치, 약 3000 반응의 수율은 일반적인 실험 과정에 대한 충분합니다. 우리는 편차가 스케일링 및 절차를 자동화함으로써 제거 될 수있다 의심하지만, 이러한 시도들은 상당한 자원 투자를 수반한다. 종점 발현 수준을 결정하게 합리적 쉽지만 또한, 많은 작업이 무 세포계 본질적인 이해 역학에서 수행 될 필요가있다. 그것은 알려져 그 자원 competitio 모두n 및 자원 제한은 표현의 역학 관계에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 제한된 내인성 시그마 70. 9,27하지만, 역학 시스템을 충분히 활용하는 것으로 이해되지 않아도 증가 DNA 템플릿은 뉴클레오티드 또는 아미노산 고갈 된 것과 유사한 발현 양상을 생산하는 포화 정권 초래할 수있다. 수율의 순수한 증가를 위해, 최적화 기계 학습 방법에 의해 수행 할 수 있습니다. 자원 경쟁과 제한의 28 문제는 실험 데이터를 사용하여 확인 수학적 모델에 의해 해결 될 수있다. 여기에 제시된 프로토콜은 BL21-Rosetta2 변형에 최적화 된, 그러나 다른 E.에 일반화입니다 대장균의 변종. 이러한 유전자 부호화 LON 프로테아제 희귀 된 tRNA를 코딩하는 유전자의 첨가의 제거와 같은 BL21-Rosetta2의 변형은, 최대한의 단백질 생산을 허용한다. 우리는 다른 두 개의 추출 균주 프로토콜을 시도했다 - 만 BL21과 BL21 trxA의 녹아웃을D는 50 % 미만의 단백질 수율을 발견했다. 우리는 다른 균주를 사용하는 경우 수익률이 유사하게 감소한다는 가설을 세웠다. 이러한 LB 및 기타 풍부한 국물에 2xYT 성장 매체를 전환과 같은 매개 변수, 다른 변화는 감소 단백질 수율에 성공. 내인성 및 외인성 전사 - 번역 기계 및 규제 메커니즘을 모두 활용 한 무 세포 발현 시스템은 단백질과 대사 산물의 표현 모두에서 합성 생물학의 다양한 응용 프로그램이 있습니다. 대신 T7 조절 회로에 한정되는 것이, 하나는 복잡한 생체 분자를 생산하는 구상 할 수 3,29 E. 고유의 혼합을 사용하여 사용자 환경에서 제어 가능한 대장균의 발기인 및 외생 적 공급 전사 및 규제 메커니즘. 세포 분열과 신진 대사의 제한없이, 이러한 repressilator 또는 그 생산 아르테 미시 닌으로 대사 공학 경로에서 같은 합성 회로의 변동성이 감소하거나 더 잘 이해 될 수있다. (30, 31) 우리는 근래전자는 유전 적 스위치를 구현하기 위해,뿐만 아니라 시그마 인자 격리을 이해하는 이러한 장점을 이용 9,32 이러한 기술은 또한 &quot;최소한의&quot;또는 &quot;인공&quot;세포의 골격 형성 할 수있다 -. 작은, 잘 특성화와의 자급 자족 내재 단위 추출물. 33, 34 궁극적으로, 우리는 합성 생물학의 프로토 타입 환경 등이 내인성 무 세포 발현 시스템의 즉각적인 사용을 기대하고 있습니다. 기본 플라스미드, 선형, 또는 화학적으로 synthetized DNA에 대한 검사의주기, 다음 - 별명 &quot;TX-TL 생명 브레드,&quot;무 세포 발현 시스템은 프로토 타입의 라운드를받을 수 합성 회로가 궁극적으로 생체 내 발현을 대상으로 제어 환경을 제공합니다 분석과 신속한 수정에 의해. 프로토 타이핑 라운드 현재 개발되고 예측 수학적 모델에 의해 도움을받을 수 있습니다. 복제 비 최종 회로에 대한 생체 조작에서 제거함으로써, 우리는 공학부 예상니어링 사이클 시간 대신 현재 주 &#39;기준 1-3 일로 단축된다.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

세포 자유로운 표현 기술은 T7 박테리오파지 DNA를 사용하여 결합 전사 - 번역의 메커니즘을 포함하는 년 후 발전, 순수하게 번역으로 1950 년에 시작되었다. 11, 12, 그 이후로, 수많은 노력은 원유 세포 추출물의 창조 (또는 E를 최적화되었습니다 . 대장균 S30 추출물). (13, 14) 이러한 최적화는 ATP 재생 또는 변형 수정을 통해 세포 단백질 합성을 연장하고, 프로토콜의 시간과 비용을 줄일 수 있습니다. 15-17 대체 무 세포 발현 시스템이 존재하는 원유 대신에 사용 재구성 구성 요소 표현 세포 추출물. 5 조 세포 추출물과 재구성 방법은 모두 상업적 목적으로 개발되었다. 합성 생물학의 출현과 함께, 설계 생물학적 모듈과 회로를 테스트하고 표현할 수있는 잘 특성화 플랫폼을위한 증가 필요가있다. 18, 19이 플랫폼이어야합니다다목적 잘 특징, 조작이 간단하고, 사용자가 제공 한 구성 요소에 초점을 맞추었다. 반세기 이전의 개발에도 불구하고, 세포가없는 시스템은 E.에 근거 그들은 성장과 신진 대사의 복잡성없이 세포 프로세스의 체외 표현의 단순화로 대장균은 본질적으로, 이러한 요구 사항을 공유 할 수 있습니다. 또한, E.에 생체 내 작품에서 기초 지식의 ​​모든 대장균 E.에 쉽게 적용 대장균 세포없는 시스템. 무 세포 발현 시스템은 대부분의 무 세포 발현 시스템의 목표를 지금까지 합성 생물학에 응용 프로그램이있을 수 있지만 단백질과 대사 산물의 수율을 극대화하고있다. 이것은 T7 프로모터에 의해 구동 시퀀스의 T7 박테리오파지의 전사를 사용하여 수행됩니다. 20 표현이 효율적이고 강력하지만, 이러한 시스템은 고도로 전문화 된 목적을 제공하고 있습니다. 셀 규제 방법이 제한되어 대상 DNA 템플릿을해야합니다T7 프로모터를 포함하도록 재 설계하고, 이러한 리보솜 단지 특정 시퀀스가 전사 및 조립 할 수 없습니다. (21, 22) 기존의 무 세포 발현 시스템은 내생 규정하는 기계, 합성 생물학에 필요한 기능성을 유지하면서 높은 수율을 유지할 수 없습니다. 우리는 내생 E.을 개발했습니다 이전 시스템에 의해 입증 단백질 발현의 효율성을 유지하지만 있도록하여 추가 기능성을 추가 대장균 세포 표현의 자유의 시스템 표현과 (T7 또는 기타) 메커니즘 내인성 및 외인성 양에 따라 조절. 여기에 설명 된 프로토콜은 원래. Kigawa 등을 기준으로 (2004 년)와 리우 등. (2005), 그러나 중요한 수정을 가지고 있습니다. 그것은 효율성 향상을위한 마그네슘과 K-아세테이트 mg 이상 및 K-글루탐산을 활용 2 - 머 캅토 에탄올을 제거하고, 비드 비터를 사용하여 세포를 lyses. 17,23,24 비드 박동이 균질화를 통해 선택,때문에 경쟁 시스템의 낮은 비용과 유사한 수율에 압력 기반의 방법, 또는 초음파는. 23 3 phosphoglyceric 산 (3-PGA는)이 크레아틴 인산에 비해 우수한 단백질 수율을 제공하는 것으로 확인되었을 때 에너지 원으로 사용된다 포스. 4,25 우리의 시스템은 하나 람다 파지 사업자와 sigma70 기반의 발기인 또는 다른 상용 시스템에서 수익률과 유사한 T7 중심의 프로모터를 사용하여 기자 단백질의 0.75 ㎎ / ㎖을 생성 할 수 있습니다. 4,6 다섯 일 필요한 모든 시약 (그림 1)를 생성해야합니다. 또한, 비교 광고 셀없는 시스템에 비해 98 %의 비용 절감을 제공합니다 - 재료 비용 노동 (그림 2)를 포함으로 $ 0.26로 상승하는 10 ㎕의 반응 당 $ 0.11이다.

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP 바이오메디컬</td><td>3012-032</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>시그마-알드리치</td><td>P8877</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ATP</td><td>시그마-알드리치</td><td>A8937</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto-한천</td><td>BD 진단</td><td>214010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>비드 박동 튜브 (폴리프로필렌 마이크로바이알)</td><td>BioSpec</td><td>522S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>비드, 직경 0.1mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli 균주</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bradford BSA 단백질 분석 키트</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9501</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1919</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CoA</td><td>시그마-알드리치</td><td>C4282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>큐벳, 1.5ml</td><td>피셔</td><td>14-955-127</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>시그마-알드리치</td><td>D0632</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>폴린산</td><td>시그마-알드리치</td><td>F7878</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>H6147</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>K-글루타메이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>G1149</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mg-글루타메이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>49605</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로 바이오-스핀 크로마토그래피 컬럼</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NAD</td><td>시그마-알드리치</td><td>N6522</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc 384웰 광학 바닥 플레이트</td><td>Thermo-Scientific</td><td>142761</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc 밀봉 테이프</td><td>Thermo-Scientific</td><td>232701</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>프로메가</td><td>V3011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RTS 아미노산 샘플러</td><td>5 프라임</td><td>2401530</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 투석 카세트, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>스페르미딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>85558</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>tRNA (from E. coli)</td><td>Roche Applied Science</td><td>MRE600</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1L 원심분리기 병</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A98813</td><td>이것은 Avanti J 시리즈에만 해당됩니다. 사용 중인 원심분리기와 동일한 크기를 구하십시오.</td></tr><tr><td>4L 에를렌마이어 플라스크</td><td>킴블 체이스</td><td>26500-4000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Avanti J-26XP 원심분리기</td><td>Beckman-Coulter</td><td>393127</td><td>또는 1L 지원 원심분리기 동급.</td></tr><tr><td>Forma 480 Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>480</td><td>또는 가슴 크기 6x4L 쉐이커에 해당.</td></tr><tr><td>JLA-8.1000 로터</td><td>Beckman-Coulter</td><td>363688</td><td>또는 1L 가능, 원심분리기용 5000 x g 로터 등가.</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>BioSpec</td><td>3110BX</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">보충 자료 1. Items. 레시피
Chloramphenicol, 34 mg/ml: 0.51 g의 클로람페니콜을 준비하고 15 ml에 에탄올을 첨가한다. 필터 살균 (0.22 &mu; M), 1 ml 튜브에 부분 표본, -20 °°C에서 보관; 나중에 사용할 수 있도록 C. 
2xYT+P+Cm 한천 플레이트: 1.24g 2xYT, 1.6ml 인산칼륨 이염기성 용액 @ 1M, 0.88ml 인산칼륨 일염기성 용액 @ 1M, 0.6g 한천 및 물을 40ml에 준비합니다. 오토클레이브. 50도로 식히십시오. C에 40 &mu를 더합니다. l Cm. 100x15mm 페트리 접시에 25ml를 분취하고 한 시간 동안 식히십시오. 
2xYT+P media: 124g 2xYT, 160ml 인산칼륨 이염기성 용액 @1M, 88ml 인산칼륨 일염기성 용액 @ 1M, 물을 4L로 준비합니다. 2x1.88L 및 0.24L로 분취합니다. Autoclave. 
Tris 베이스, 2M: 60.57g의 트리스 베이스와 250ml의 물을 준비합니다. 살균하고 나중에 사용할 수 있도록 RT에 보관하십시오. 
DTT, 1M: 2.31g의 DTT와 15ml의 물을 준비합니다. 필터 살균 (0.22 &mu; M), 1 ml 튜브에 부분 표본, -20 °°C에서 보관; 나중에 사용할 수 있도록 C. 
S30A 완충액 : 10.88g Mg- 글루타메이트 및 24.39g K- 글루타메이트, 2M에서 50ml Tris, 아세트산 (pH 7.7까지) 및 물을 2L. 오토 클레이브까지 준비하고 4 °C에서 보관하십시오. C, 사용하기 전에 4ml 1M DTT를 추가합니다. 
S30B 완충액: 10.88g Mg-글루타메이트 및 24.39g K-글루타메이트, Tris를 2M(pH 8.2까지)에서, 물을 2L. 오토클레이브까지 준비하여 4°C에서 보관합니다. C, 사용하기 전에 2ml 1M DTT를 추가합니다. 
Hepes: 1.91g HEPES(MW 238.21), KOH(pH 8까지) 및 물 4ml를 준비합니다. 
tRNA: 30mg의 tRNA와 물을 600 &mu;l. 까지 준비합니다.
CoA: 30mg의 CoA(MW 767.53)와 물을 600 &mu;l. 까지 준비합니다.
NAD: 34.83mg의 NAD(MW 663.43), 2M의 트리스(pH 7.5-8), 300μl에 물을 추가합니다(27 &mu 추가; 용액을 pH 7.5-8). 로 가져오기 위해 2M에서 Tris의 l
cAMP: 42.80mg의 cAMP(MW 329.22), Tris를 2m(pH 8까지), 물을 200μl.에 추가합니다(73 &mu를 추가합니다. 용액을 pH 8)로 끌어올리기 위해 2M에서 Tris의 l). 
폴린산(33.9mM): 고체 폴린산 칼슘염(MW 511.5) 20mg에 물 1.15ml를 추가합니다. 
Spermidine: 준비 23.55 &mu; l의 스페르미딘 (MW 145.25) 및 물 150 &m; l. 37 &deg;C. 에서 잠시 녹인 후 실온에서 준비합니다.
3-PGA: 3-PGA 1.03g(MW 230.02), Tris를 2M(pH 7.5까지), 물을 3.2ml에 추가합니다(용액을 pH 7.5로 가져오기 위해 2M에서 Tris 1.73ml를 추가). 
뉴클레오티드 혼합물: ATP 이칼륨 염 이수화물 145mg(MW 619.4), GTP 이나트륨 염(MW 567.14) 133mg, CTP 이나트륨 염 이수화물 79.4mg(MW 563.16), UTP 삼나트륨 염 이수화물 82.6mg(MW 586.12), 15% 희석(pH 7.5까지)의 KOH, 1.5ml에 물을 추가합니다. 용액을 pH 7.5). 로 가져오기 위해 15% 희석에서 KOH의 l
보충 자료 2. Bradford Assay.
<올>
	<li>4에서 Bradford 에이전트를 제거하십시오. C 및 실온으로 설정합니다.</li>
	<li>50 준비 &mu; l 1 mg/ml 및 0.1 mg/ml.</li에 있는 BSA 표준>
	<li>Prepare 40 &mu; L 1.47.</Li 단계에서 추출물의 20배 희석>
	<li> 더하기 800 &mu; l 7 큐벳에 물. </li>
	<li>0 mg/ml, 1 mg/ml(10 &mu; l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 & må; l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 & mú; l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 & mú; l 1 mg/ml BSA).</li>
	<li>2 &mu; 샘플의 L 및 4 &mu; sample.</li의 l>
	<li> 200 추가 &mu; l Bradford 에이전트의 각 큐벳에 넣고 피펫팅으로 잘 섞습니다. 실온에서 최소 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>단계 6.5의 큐벳을 사용하여 OD 595nm에서 표준 곡선을 생성합니다. r2 인 경우 표준 곡선을 거부합니다. 0.95.</리>
	<li> TEP 6.6.</li의 큐벳을 사용하여 OD 595nm에서 추출물 농도를 측정합니다>
</ol>
보충 자료 3. 버퍼 보정 spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank"> TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a> 참조. 
보충 물자 4. 셀 없는 표현식 실행 spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">TXTL _JoVE.xlsx</a> 참조.</td></tr></tbody></table>

구현을위한 프로토콜 대장균을 바탕으로 tx-tl의 무 세포 발현 시스템

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

이상적인 무 세포 발현 시스템은 이론적으로 시험관 플랫폼 제어. 1이 통제 된 방식으로 단백질과 유전자 회로를 표현뿐만 아니라, 합성 생물학에 대한 프로토 타이핑 환경을 제공하는 데 유용합니다. 2,3에서 생체 세포 환경을 에뮬레이션 할 수 있습니다 후자의 목적을 달성하기 위해, 보존 무 세포 발현 시스템은 내인성 대장균 전사 - 번역 메커니즘은 더 정확하게 T7 RNA 폴리머 라제 전사에 기초하여보다 생체 세포 역학을 반영 할 수있다. 우리는 효율적인 내인성 E.의 준비 및 실행을 서술 유사한 상용 시스템에 대한 98 %의 비용 절감에 T7 기반 시스템과 같은 단백질의 상당 금액을 생산할 수있는 대장균을 기반으로 전사 - 번역 (TX-TL) 무 세포 발현 시스템. 4,5 버퍼와 원유 세포 추출물의 준비가 의 실행뿐만 아니라, 기재된세 관 TX-TL 반응. 전체 프로토콜을 준비하는 데는 약 5 일이 소요됩니다 한 준비에 최대 3000 단일 반응에 대한 충분한 정보를 얻을 수 있습니다. 일단 준비, 각 반응은 데이터 수집 및 분석 설정에서 8 시간에서 걸립니다. E.에 대한 규제와 전사 외인성의 메커니즘 대장균이 같은 락 / TET의 억제 자와 T7 RNA 중합 효소로 보충 할 수있다. 이러한 mRNA와 DNA의 분해 속도와 같은 6 내생의 속성을,도 조정할 수 있습니다. 7 TX-TL의 무 세포 발현 시스템이 시연 한 대형 규모의 회로 조립, 생물학적 현상을 탐구하고, 모두 T7과 내생 발기인에서 단백질의 발현. 6,8 동반자 수학적 모델을 사용할 수 있습니다. 9,10 결과 시스템은 프로토 타입 환경으로 합성 생물학의 고유 한 응용 프로그램을 가지고, 또는 &quot;TX- TL의 생명 브레드. &quot;

우리는 TX-TL 무 세포 발현 시스템을 기반으로 내인성 대장균의 제조 오일 프로토콜을 제시 하였다. 조 질의 세포 추출물 및 버퍼 - - 시약을 생성하기위한 샘플 타임 라인은도 1에서 찾을 수있다. 일단 생성되면, 이들은 1 년까지 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. 시약을 만든 후, 실험 설정 및 실행은보다 8 시간에 수행 할 수 있습니다. 또, TX-TL의 무 세포 발현 시스템의 발현 조건을 최적화. 이러한 버퍼 또는 DNA 솔루션과 같은 다른 사용자가 제공 한 추가는, 미리 독성 교정해야한다. 예를 들어, 처리 플라스미드의 다른 방법으로 인해 염 함량에 다른 표정을 초래할. 우리는 또한 반응 효율에 트리스로-C1 용출 버퍼의 효과 (그림 5)를 테스트했다. 4.9 단계 4.1 참조 원유 세포 추출물 교정의 예는, 표시됩니다그림 4a에서. 일반적으로, 우리의 실험은 원유 세포 추출물이 K-글루타민산 수준 다음의 Mg-글루타민산 염 수준에 가장 민감하다는 것을 보여줍니다. 무 세포 발현 시스템을 설명하기 위해, 우리는 TET의 억압에 따라 음의 피드백 루프. 26 (그림 6)를 건설하고 시험했다. 무 세포 발현 시스템에서,과 및 ATC없이 동일한 회로 실행 표현 8 시간 후 deGFP 기자의 7 배 엔드 포인트의 표정 변화를 보여줍니다. 그들은 "마스터 믹스 준비."에 추가 할 수 있습니다 필요한 경우이 실험은, 세계 유도 또는 억제 자이 필요하지 않지만 <img alt="그림 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg"> 그림 1. 조 질의 세포 추출물, 아미노산 용액, 에너지 용액 제조를위한 타임 라인. 5 일간 timelin 프로토콜의 일반적인 실행을위한 전자 밤새 배양 및 주간 작업 단계에 최적화 된, 위 주어진다. <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg"> 그림 2. 비용 및 원유 세포 추출물을 경쟁의 발현 분석. ) TX-TL의 무 세포 발현 시스템의 노동과 재료 비용의 고장. 2012년 12월의 같은 시약의 비용, 시간 당 $ 14 노동 비용을 기준으로합니다. 나) 기타 상용 시스템 대 TX-TL 세포 표현의 자유의 시스템 비용의 비교. 반응 볼륨이 키트 당. C 다른 상용 시스템 대 TX-TL의 무 세포 발현 시스템 수율) 비교 될 수 있지만 비용은 μL 당 분류됩니다. 단백질 발현 수율은 제조사 기준에 의해 결정./ 50762fig2large.jpg "대상 ="_blank "&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg"> 그림 3. 비드 박동 튜브의 로딩 및 처리. ) 셀 비드 솔루션의 정확한 점도의 데모. 휴대 구슬 솔루션은 얼음에 소요되는 추가 S30A 버퍼의 양, 추가 구슬의 양, 시간 등의 여러 요인에 따라 점도있을 것입니다. B) 비드를 제패 한 튜브의 로딩 빠른 탁상 원심 분리 전에. 원심 분리로드하는 동안 축적 된 거품을 제거합니다. C) 탁상 원심 분리 후 부상 거품. 거품의 크기는 다를 것이다. 그들은 피펫 팁 D를 사용하여 팝 또는 제거 할 수 있습니다) 완전히 채워 비드를 제패 한 관을 씌우는 전에. 메 니스 커스가 비드 박동 t 형성된다우베 및 모자). 전자를 너무 많이 넣다 올바르게로드 필터 장치를 적은 양을 커버 일으킬 정도로 있습니다. 이 올바르게 대를 잘못 처리 비드를 제패 한 튜브. F) 비교를 재사용 할 수 있습니다. 왼쪽의 관은 잘 비트 튜브 - 그것은 작고 잘 묘사 꼭대기 층, 매우 명확 상층 액을 갖추고 있습니다. 좌측 관은 클수록 불투명 층과 제 흐릿한 상등액을 기반으로, 차선이다. 차선 있습니다 튜브는 계속 처리 할 수​​ 없습니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg"> 그림 4. 조 추출물 제제의 속성. ) 원유 세포 추출물에 대한 일반적인 교정 플롯. 조 추출물은이 순서대로, 추가의 Mg-글루타메이트, K-글루타메이트, 및 DTT 농도에 대해 교정된다. 엔드 포인트 fluorescenc은 표시E 8 시간뿐만 아니라, 12 분 이동 평균에 기초하여 단백질 생산의 최대 비율 후. 이러한 플롯에 기초하여, 추가의 Mg-글루타메이트의 허용 범위는 K-글루타메이트가 60-80 ㎜ 인, 4 mm로하고, DTT는 0-3 ㎜이다. 모든 조 추출물이 세 변수에 독립적으로 보정해야합니다. B) 추출물 제제의 변화. 다른 날짜에 준비 두 원유 추출물의 엔드 포인트 형광 표시되고, 오차 막대는 서로 다른 일에 세 개의 독립적 인 실행에서 1 표준 편차이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg"> 그림 5. 발현 효율에 DNA 용액의 효과. 두 개의 서로 다른 정화의) 비교플라스미드를 처리하기위한 방법. pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500의 1 nM의는 QiaPrep 스핀 미니 프렙 키트 (정화 방법 1) 또는 제품, QIAquick PCR 정제 키트와 후 처리하여 제조한다 (정화 방법 2). 8 시간뿐만 아니라, 12 분의 이동 평균에 기초하여 단백질 생산의 최대 속도 후의 끝점 형광 도시된다. 오차 막대는 서로 다른 일에 4 개의 독립적 인 실행에서 1 표준 편차이다. 용출 버퍼의 B) 효과 (트리스로-C1). 트리스로-C1의 다른 농도 pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500의 1 ㎚의 식을 기반으로 세포 표현의 자유 반응에 비교된다. 주어진 농도는 반응 트리스로-C1의 최종 농도이며 사용 용출 완충액은 10 mM 트리스-Cl 인. 오차 막대는 서로 다른 일에 세 개의 독립적 인 실행에서 1 표준 편차이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 그림 6. 음의 피드백 루프의 샘플 TX-TL 실행. a) 샘플 무 세포 실행 반응 셋업. 대 음의 피드백 루프의 "오프"상태, 양성 및 음성 컨트롤. b)는 음의 피드백 루프의 플라스미드지도. C) 대표 결과 "에"테스트합니다. 데이터에서 실험을 반영)와 b), 음성 대조군과 신호에서 제외. 유전자 회로는 삽입에 표시됩니다. 오차 막대는 서로 다른 일에 세 개의 독립적 인 실행에서 1 표준 편차이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 집중 </td><td> 양 </td><td> 살균 </td><td> 주의 사항 </td></tr><tr><td> 클로람페니콜 (CM) </td><td> 에탄올에 34 ㎎ / ㎖ </td><td> 1 ㎖ </td><td> 소독 필터 (0.22 μM) </td><td> 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장 더 큰 볼륨을 만들 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + 센티미터 한천 플레이트 </td><td> 31g / L 2xYT, 40 mM의 인산 칼륨 이염, 22 mM의 인산 칼륨 일 염기성, 34 ㎍ / ㎖의 클로람페니콜 </td><td> 1 판 </td><td> 압력솥 </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P 미디어 </td><td> 31g / L 2xYT, 40 mM의 인산 칼륨 이염, 22 mM의 인산 칼륨 일 염기성 </td><td> 4 L </td><td> 압력솥 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 원유 세포 추출 프로토콜의 1 일 용 시약. <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 집중 강한&gt; </td><td> 양 </td><td> 살균 </td><td> 주의 사항 </td></tr><tr><td> 트리스베이스 </td><td> 2 M </td><td> 250 ㎖의 </td><td> 소독 필터 (0.22 μM) 또는 오토 클레이브 </td><td> 상온에서 저장할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M </td><td> 6 ML </td><td> 소독 필터 (0.22 μM) </td><td> 큰 볼륨을 만들어 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> S30A 버퍼 </td><td> 14 밀리미터 밀리그램 - 글루타민산, 60 mM의 K-글루타민산, 50 MM 트리스, 산도 7.7 </td><td> 2 L </td><td> 압력솥 </td><td> pH가 7.7에 도달하기 위해, 아세트산으로 적정한다. 사용 직전에 2 mM의 최종 농도 DTT를 추가합니다. 4 ℃에서 보관 </td></tr><tr><td> S30B 버퍼 </td><td> 14 밀리미터 밀리그램 - 글루타민산, 60 mM의 K-글루타민산 ~ 5 MM 트리스, 산도 8.2 </td><td> 2 L </td><td> 압력솥 </td><td> pH가 8.2에 도달하기 위해, 2M으로 적정트리스. 사용 직전에 1 mM의 최종 농도 DTT를 추가합니다. 4 ℃에서 보관 </td></tr></tbody></table> 표 2. 원유 세포 추출 프로토콜의 하루 2 용 시약. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> 매 </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 빈 50 ML 팔콘 (G) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 펠렛 50 ML 팔콘 (G) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 펠렛 대용량 (50 ㎖ 펠릿와 팔콘 - 빈 50 ML 팔콘) (G) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 추가 S30A 버퍼 볼륨 (펠렛 질량 * 0.9) (ML) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 추가 할 수있는 구슬의 총 질량 (펠렛 질량 * 5.0) (G) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 3. 원유 세포 추출 프로토콜의 일 3 S30A 버퍼와 구슬의 질량 계산기. <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 집중 </td><td> 양 </td><td> 살균 </td><td> 주의 사항 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH가 8 </td><td> 4 ML </td><td> 없음 </td><td> pH가 8에 도달하기 위해, KOH로 적정한다. </td></tr><tr><td> 염기 혼합 </td><td> 156 mM의 ATP와 GTP, 94 mM의 CTP 및 UTP, pH를 7.5 </td><td> 1.5 ML </td><td> 없음 </td><td> pH가 7.5에 도달하기 위해, KOH로 적정한다. </td></tr><tr><td> tRNA의 </td><td> 50 ㎎ / ㎖ </td><td> 600 μL </td><td> 없음 </td><td></td></tr><tr><td> CoA를 </td><td> 65 mM의 </td><td> 600 μL </td><td> 없음 </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 밀리미터, pH가 7.5 ~ </td><td> 300 μL </td><td> 없음 </td><td> pH가 7.5에 도달하려면 2 M.에서 트리스으로 적정 </td></tr><tr><td> 캠프 </td><td> 650 밀리미터, pH가 8 </td><td> 200 μL </td><td> 없음 </td><td> pH가 8에 도달하려면 2 M.에서 트리스으로 적정 </td></tr><tr><td> 엽산 </td><td> 33.9 밀리미터 </td><td> 300 μL </td><td> 없음 </td><td> 만 300 μL이 필요하지만, 보충의 조리법은 1.15 ㎖를위한 것입니다. </td></tr><tr><td> 스퍼 미딘 </td><td> 1 M </td><td> 150 μL </td><td> 없음 </td><td> 4 ° C에서 보관은 열 37 ° C에서 녹는. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1.4 M, pH를 7.5 </td><td> 3.2 ML </td><td> 없음 </td><td> pH가 7.5에 도달하려면 2 M.에서 트리스으로 적정 </td></tr></tbody></table> 표 4. 에너지 솔루션 프로토콜을 준비하는 시약. 보충 자료 1. 항목의 조리법. 클로람페니콜, 34 ㎎ / ㎖ : 0.51 g의 클로람페니콜을 준비하고 15 ㎖의 에탄올을 추가합니다. 소독 필터 (0.22 μM), 1 ㎖ 튜브, 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는. 2xYT + P + 센티미터 한천 플레이트 : 1.24 g 2xYT, 1 M @ 1.6 ml의 인산 칼륨 용액 40 ㎖에 1 M @ 0.88 ㎖의 칼륨 인산 용액, 0.6 g 한천, 물을 준비합니다. 오토 클레이브. 50 ° C로 냉각시켜 40 μL 센티미터를 추가합니다. 나누어지는 25 100 × 15mm 페트리 접시에 ML, 1 시간 동안 식힌다. 2xYT + P 미디어 : 124g 2xYT, 1 M @ 160 ㎖의 인산 칼륨 용액, 4 L. Aliqu 1 M, 물 @ 88 ㎖를 1 인산 칼륨 용액을 준비2 × 1.88 L 0.24 L. 오토 클레이브 속으로 해주 마. 트리스베이스, 2 개의 M이 : 250 ml로 60.57 g 트리스베이스와 물을 준비합니다. 나중에 사용하기 위해 실온에서 저장을 소독. DTT, 1 M : 15 ml로 2.31 ​​g의 DTT와 물을 준비합니다. 소독 필터 (0.22 μM), 1 ㎖ 튜브, 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는. S30A 버퍼 : 10.88 g의 Mg-글루타민산과 24.39 g의 K-글루타민산, 2M, (산도 7.7), 아세트산 50 ㎖의 트리스를 준비, 물 2 L. 오토 클레이브에, 4 ° C에서 저장, 4 ML 1 M DTT를 추가 사용하기 전에. S30B 버퍼 : 10.88 g의 Mg-글루타민산과 24.39 g의 K-글루타민산, 2 M의 트리스 (산도 8.2)를 준비하고, 물 2 L. 오토 클레이브에, 4 ° C에서 보관, 사용하기 전에 2 ㎖ 1 M DTT를 추가합니다. HEPES : 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (산도 8)를 준비하고, 물 4 ㎖를합니다. tRNA의 600 μL에 30의 tRNA의 MG와 물을 준비합니다. CoA를 600 ㎕의 30 CoA를 (MW 767.53)의 MG와 물을 준비합니다. NAD : 300 μL에 (산도 7.5에) NAD의 34.83 밀리그램 (MW 663.43), 2 M에서 트리스를 추가, 물. (산도 7.5에 대한 해결책을 가지고 2 M에서 트리스의 27 μl를 추가합니다). 캠프 : 200 μL에 42.80 캠프의 MG (MW 329.22), 2 M (산도 8)에서 트리스, 물을 추가합니다. (산도 8에 대한 해결책을 가지고 2 M에서 트리스의 73 μl를 추가합니다). 엽산 (33.9 mM)을 : 고체 엽산 칼슘 염 (MW 511.5)의 20 밀리그램, 1.15 ㎖의 물을 추가합니다. 스퍼 미딘 : 150 μL에 23.55 스퍼 미딘 ㎕의 (MW 145.25)과 물을 준비합니다. 37 ° C에서 간단히 녹여 상온에서 준비 3-PGA : 3.2 ml로 1.03 3-PGA (MW 230.02)의 G, (산도 7.5) 2 M에서 트리스, 물을 추가합니다. (산도 7.5에 대한 해결책을 가지고 2 M에서 트리스의 1.73 ML을 추가합니다). NucleotIDE 믹스 : ATP 칼륨 염 수화물의 145 밀리그램 (MW 619.4), GTP의 나트륨 염 133 MG (MW 567.14), CTP 나트륨 염 수화물의 79.4 MG (MW 563.16), UTP의 삼 나트륨 염 수화물의 82.6 MG (MW 586.12)을 추가 1.5 ㎖의 15 % 희석 (산도 7.5), 물에 KOH. (산도 7.5에 대한 해결책을 가지고 15 %의 희석에 KOH의 353 μl를 추가합니다). 보충 자료 2. 브래드 분석. <ol><li> 4 ° C에서 브래드 에이전트를 제거하고 실온에서 설정합니다. </li><li> 1 ㎎ / ㎖에서 0.1 ㎎ / ㎖에서 50 ㎕의 BSA 표준을 준비합니다. </li><li> 단계 1.47에서 추출의 40 μl를 20 배 희석을 준비합니다. </li><li> 7 큐벳에 800 ㎕의 물을 추가합니다. </li><li> 0 ㎎ / ㎖, 1 ㎎ / ㎖ (10 ㎕를 0.1 ㎎ / ㎖ BSA), 2 ㎎ / ㎖ (20 ㎕를 0.1 ㎎ / ㎖ BSA), 4 ㎎ / ㎖ (4 ㎕를 1 ㎎ / ㎖ BSA)에 대한 표준 큐벳 준비 6 ㎎ / ㎖ (10 ㎕를 1 ㎎ / ㎖ BSA). </li><li> 샘플 2 μL 샘플의 4 μL를위한 실험 큐벳을 준비합니다. </li><li> 각 베트 브래드 포드 제 200 μl를 추가하고 B를 잘 섞는다Y 피펫. 적어도 10 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 단계 6.5에서 큐벳을 사용하여 OD 595 nm에서 표준 곡선을 생성합니다. 표준 곡선을 거절하는 경우에 R 2 &lt;0.95. </li><li> 단계 6.6에서 큐벳을 사용하여 OD 595 nm에서 추출물의 농도를 결정합니다. </li></ol> 보충 자료 3. 교정 스프레드 시트를 버퍼. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">TXTL_e (템플릿) _calibration_JoVE.xlsx를 참조하십시오</a> . 보충 자료 4. 세포 표현의 자유는 스프레드 시트를 실행합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">TXTL _JoVE.xlsx를 참조하십시오</a> .

이 5 일간의 프로토콜은 모든 단계, 장비 및 기반의 효율적인 내생 대장균 처음부터 TX-TL의 무 세포 발현 시스템을 구축 및 실행에 필요한 추가 소프트웨어를 설명합니다. 시약, 프로토콜은 8 셋업 시간 이하의 반응, 수집, 및 프로세스 데이터를 걸린다.

구현을위한 프로토콜 대장균을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

이 절차의 전반적인 목표는 전사 번역 또는 TX tl이라고 하는 대장균 기반 무세포 발현 시스템을 만드는 것입니다. 이는 먼저 TX TL 조세포 추출물, 아미노산 용액 및 에너지 용액의 세 가지 초기 구성 요소를 만들어 수행됩니다. 아미노산 용액과 에너지 용액은 나중에 TX TL 버퍼를 만들기 위해 결합됩니다.두 번째 단계는 조세포 추출물을 보정하여 최적의 마그네슘, 칼륨 및 DTT 농도를 측정하여 최대 발현 수준의 TX TL 반응을 생성하는 것입니다. 다음으로, 보정 결과를 사용하여 버퍼 미처리 세포 추출물과 DNA로 구성된 3개의 튜브 TX TL 시스템을 만듭니다. 마지막 단계는 방금 만든 시약을 사용하여 TX TL 반응을 실행하는 것입니다.궁극적으로 TX TL은 합성 생물학 회로와 기존의 무세포 발현 응용 분야를 시연하는 데 사용됩니다. 이 방법은 생체 내에서 이를 에뮬레이트하는 체외 동일 환경을 제공하여 합성 생물학 분야의 회로를 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 모든 프로토타이핑 단계를 생체 내에서 수행할 필요성을 제거함으로써 합성 생물학 설계의 속도를 높이는 방향으로 확장됩니다.절차를 보조하는 것은 우리 그룹의 연구 조교인 Claire Hayes가 맡을 것입니다. 이 비디오는 촬영에 중요한 프로토콜의 일부 섹션만 진행한다는 점에 유의하시기 바랍니다. 전체 프로토콜은 텍스트 기사에서 사용할 수 있습니다.이 프로토콜의 초기에, 박테리아 세포를 성장시키고 펠릿화하였다. 이제 박테리아 세포는 비드 비터를 사용하여 용해됩니다. 세포 현탁액이 들어 있는 50밀리리터 팔콘 튜브를 모두 얼음 위에 보관하십시오.이 비디오의 목적을 위해 하나의 튜브에 대해서만 비드 비드 장식을 시연합니다. 비드는 3개의 부분 표본으로 Falcon 튜브에 간헐적으로 첨가해야 하며, 각 분취량은 전체 비드의 1/3을 사용해야 합니다. 구슬의 첫 번째 부분 표본을 튜브 소용돌이에 30초 동안 넣고 얼음 위에 놓습니다.같은 방법으로 구슬의 두 번째 부분 표본, 소용돌이를 넣고 얼음 위에 놓습니다. 마지막 부분 표본을 추가하고 볼텍싱을 한 후 비드가 균일하게 분포되었는지 확인하고 세 번째 와류 단계 후에 두꺼운 페이스트를 형성해야 합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.멸균 가위를 사용하여 끝을 잘라 5ml 용량의 피펫 팁을 준비합니다. 3-4mm 개구부를 만들려면 피펫을 2밀리리터로 다이얼합니다. 얼음 위에 20개의 멸균 비드 구슬 튜브를 놓습니다.변형된 피펫을 사용하여 비드 셀 용액의 높은 점도를 확인합니다. 피펫 팁에서 거의 나오지 않을 정도로 점성이 있어야 합니다. 배출하는 동안 Falcon 튜브에서 비드 셀 용액을 제거하고 비드 비딩 튜브로 옮깁니다.그것을 채우고, 3/4을 완전히 회전시키고, 미니 원심 분리기에서 아주 짧게 회전시킵니다. 비드를 재분배하지 않고 기포를 제거하려면 튜브에 비드 세포 용액을 추가하여 오목한 반월판을 형성하는 마무리를 합니다. 다음으로, 비드 비드 튜브 캡 내부에 매우 작은 방울의 비드 셀 용액을 추가합니다.캡의 바깥쪽 입술에 용액이 들어가지 않도록 주의합니다. 그렇지 않으면 비드 비딩 튜브가 충분히 닫히지 않습니다. 평평한 표면의 캡을 두드리고 캡 바닥에 기포가 없는지 확인합니다.비드 박동 튜브의 캡을 씌웁니다. 올바르게 수행되면 캡을 단단히 밀봉해야 합니다. 기포가 보이지 않아야 하며 여기에서 비드 셀 용액이 넘쳐나지 않는 경우 비드 비드를 효율적으로 수행하기 위해 두 사람이 필요합니다.채워진 튜브를 비드 비드 부착을 위해 조수에게 건네는 동안 첫 번째 시연자는 나머지 비드 셀 용액으로 더 많은 비드 비드 튜브를 계속 채웁니다. 채워진 구슬 구슬 튜브를 얼음 위에 올려 놓습니다. 일단 두 개의 채워진 비드 구슬 튜브를 모아 최소 1분 동안 얼음 위에 두었습니다.46 RPM에서 30초 동안 튜브 하나를 비드 비드 비드 작업으로 시작합니다. 얼음 위에 거꾸로 놓고 30초 동안 다른 튜브를 치십시오. 채워진 각 비드 구슬 튜브가 총 1분 동안 두드리도록 구슬 장식과 아이싱을 반복합니다.채워진 모든 비드 비드 튜브가 처리되면 15ml 팔콘 튜브로 필터 장치를 구성합니다. 먼저 새 비드 구슬 캡 평평한 부분을 튜브 바닥까지 추가합니다. 그런 다음 처리된 비드 비딩 튜브에서 캡을 제거하고 완전히 밀봉될 때까지 처리된 비드 비딩 튜브의 끝에 마이크로 크로마토그래피 컬럼을 단단히 누릅니다.마이크로 크로마토그래피 컬럼의 엘루시안 끝을 떼어내고 엘루시안으로 놓습니다. 빈 비드 구슬 튜브로 끝냅니다. 이 복합체를 15ml 매 튜브에 넣습니다.채워진 모든 비드 비팅 튜브에 대한 필터 장치를 구성하고 얼음 위에 보관하십시오. 완전한 원심 분리기가 되면, 여과기 기구 팔콘 관은 구슬에서 추출물과 펠릿을 분리하기 위하여 4 섭씨 온도에 5 분 동안 6, 000 G에 뚜껑을 열었다. 원심분리 후 각 비드 비딩 튜브에서 실행 가능한 추출물이 생성되었는지 확인합니다.적절하게 두들겨 맞은 추출물은 탁하지 않으며 펠릿은 왼쪽의 튜브에서 볼 수 있듯이 두 개의 뚜렷한 층을 갖게 됩니다. 오른쪽 예와 같이 탁한 튜브는 폐기해야 합니다. 비투리드 튜브의 상등액을 개별 1.75ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 가능한 한 적은 펠릿을 취합니다.모든 비드 비딩 튜브가 처리될 때까지 얼음에 보관하십시오. 다음으로, 마이크로 원심분리기 튜브를 스핀다운하고 상층액을 수집합니다. 500 마이크로 리터의 펠릿없는 상등액을 새로운 비드 비딩 튜브로 통합 한 후.캡을 제거한 튜브를 220RPM 및 37°C에서 80분 동안 배양합니다. 이것은 bead beading 과정에서 방출되는 내인성 엑소뉴클레아제를 사용하여 남아 있는 핵산을 소화합니다. 배양이 완료되면 추출물이 탁해 보일 것입니다.1.75 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 추출물을 12, 000 G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 튜브당 최대 1.5 밀리리터까지 통합합니다. 피펫을 사용하여 펠릿이 없는 상등액을 1.75 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 넣어 더 적은 수율을 얻거나 15 밀리리터 팔콘 튜브를 사용하여 얼음에서 더 많은 수율을 얻을 수 있습니다. 튜브의 뚜껑을 덮고 뒤집어서 잘 섞습니다.나중에 단백질 농도를 측정하기 위해 얼음 위에 10마이크로리터의 상등액을 저장하십시오. 생성된 추출물의 총량을 측정하고 S 30 B 버퍼에 2분 동안 담궈 10 분자량 차단 투석 카세트의 필요한 수를 수화합니다. 카세트에 최대 2.5ml의 추출물을 로드합니다.각 비커는 최대 2개의 카세트를 사용할 수 있으며 섭씨 4도에서 3시간 동안 교반하여 투석할 수 있습니다. 투석 후 처리 단계에 대해서는 작성된 기사를 참조하십시오. 기본 전사 번역 반응은 조세포 추출물, 완충액 및 DNA의 세 부분으로 구성됩니다.반응의 부피는 다양할 수 있지만 이 프로토콜은 사전 작성된 템플릿을 사용하여 10마이크로리터 반응을 수행합니다. 여기. 보라색 항목은 사용자 입력 값을 나타내고, 파란색 항목은 마스터 믹스 준비 섹션 및 DNA 준비 섹션을 사용하여 sili 실험을 설계하는 반응에 추가할 추가 시약을 나타냅니다. 일반적으로 상수는 마스터 믹스 준비 섹션에 넣을 수 있고 변수는 DNA 준비 섹션에 넣을 수 있습니다.시료 증발 및 실험 시작 시간 편향을 방지하기 위해 실험당 시료를 최소화합니다. 샘플 설정이 이 표에 나와 있습니다. 각 샘플에 대한 DNA 샘플을 준비하기 위해 ID는 표시된 DNA 물과 사용자가 제공한 항목을 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다.실온에서 완충액 추출물과 얼음 및 와류에 보관하는 글로벌 사용자 제공 품목으로 구성된 마스터 믹스를 준비합니다. 각 항목을 추가한 후 각 DNA 샘플에 적당량의 마스터 믹스를 첨가하고 실온에서 보관합니다. 이를 반응 시작 시간으로 취급합니다.와류는 10, 실내 온도에 30 초 동안 000 G에 각 표본 및 분리기를 어떤 잔여 표본든지 끌어내리고 거품을 감소시키기 위하여 작동한다. 섭씨 29도의 384웰 플레이트에서 반응을 실행합니다. 실행 시간은 실험에 따라 다르지만 일반적으로 8시간 미만으로 지속됩니다.실행이 완료되면 플레이트 리더에서 데이터를 읽을 수 있습니다. 이 논문은 내인성 대장균 기반 전사 번역 또는 TXTL cell-free 발현 시스템의 준비를 위한 5일 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템의 발현 조건은 다양한 플라스미드 처리 방법과 elucian buffer의 효과 테스트를 통해 최적화되었습니다.예를 들어, 플라스미드 처리 방법의 비교에서는 정제 방법 1에서 kaya prep spin mini prep kit만 사용하는 반면, 정제 방법 2에서는 동일한 Mini Prep Kit를 사용하여 플라스미드를 준비한 다음 카약으로 후처리합니다. 빠른 PCR 정제 키트. 이 그래프는 8시간 후의 종말점 형광과 12분 이동을 기반으로 한 단백질 생산의 최대 속도를 보여줍니다. 평균 오차 막대는 서로 다른 날에 4번의 독립적인 실행에서 1 표준 편차입니다.관찰된 발현의 차이는 염분 함량의 차이 때문입니다. 그러나 elucian buffer와 같은 다른 항목은 TXTL에 영향을 미치지 않을 수 있습니다. TS 염화물의 상이한 농도는 플라스미드의 1 ano molar의 발현을 기초로 한 cell-free 발현 반응에서 비교되었다.주어진 농도는 트리스 클로라이드의 최종 농도입니다. 반응에서 사용되는 엘루시안 완충액은 10 밀리몰이며, 트리스 클로라이드 오류 막대는 서로 다른 날에 세 번의 독립적인 실행에서 하나의 표준 편차입니다. 이 그림은 추가 마그네슘 글루타메이트, 글루타민산 칼륨 및 DTT 수치에 대해 보정된 미처리 세포 추출물에 대한 일반적인 검량 플롯을 보여줍니다.8시간 후의 종말점 형광과 12분 이동 평균을 기반으로 한 최대 단백질 생산 속도가 표시됩니다. 모든 조세포 추출물은 이 세 가지 변수에 대해 독립적으로 보정해야 합니다. 일반적으로 결과는 조세포 추출물이 마그네슘 글루타메이트 수치에 가장 민감하고 그 다음으로 글루타민산 칼륨 수치에 민감하다는 것을 나타냅니다.이러한 플롯을 기반으로 추가 마그네슘 글루타메이트의 허용 가능한 범위는 4 밀리몰 글루타민산 칼륨은 60 - 80 밀리몰이고 DTT는 아래쪽에서 0 - 3 밀리몰 공기입니다. 각 조세포 추출물 준비의 최종 효율은 사용자 숙련도와 환경 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적인 수율 변화는 5%에서 10% 사이이지만, 서로 다른 연대에 제조된 두 개의 미가공 추출물의 종말점 형광이 여기에 나와 있습니다.오차 막대는 서로 다른 날에 세 번의 독립적인 실행에서 하나의 표준 편차입니다. cell-free 발현 시스템을 입증하기 위해 Tet 억제를 기반으로 하는 negative feedback loop를 구성하고 TC가 있거나 없는 상태에서 실행된 동일한 회로를 테스트하여 7중 종말점 발현을 보여주었습니다. 8시간 동안 표현 오차 막대가 적용된 후 D-E-G-F-P 리포터의 변경은 서로 다른 날에 3개의 독립적인 실행에서 1개의 표준 편차입니다.유전 회로는 삽입 부분에 표시되어 있습니다. 이 마지막 그림은 경쟁 미처리 세포 추출물의 비용 및 발현 분석을 보여줍니다. 의 파이 차트는 2012년 12월 기준 시약 비용과 시간당 14의 인건비를 기준으로 TX TL cell-free 발현 시스템의 인건비 및 재료 비용을 분류합니다.패널 B는 TX cell-free 발현 시스템 비용을 다른 상용 시스템과 비교합니다. 비용은 마이크로리터당 세분화되지만 반응 부피는 키트마다 다를 수 있습니다. 이 시스템의 재료 비용은 마이크로리터 반응당 약 3센트이며, 이는 유사한 상용 무세포 시스템에 비해 98% 비용 절감입니다.패널 C는 TX TL cell-free 발현 시스템 수율과 다른 상용 시스템의 수율을 비교한 것입니다. 이 시스템은 Lambda 파지 연산자가 있는 Sigma 70 기반 프로모터 또는 T seven 구동 프로모터를 사용하여 밀리리터당 최대 0.75mg의 리포터 단백질을 생산할 수 있습니다. 이러한 비교는 TX TL cell-free 발현 시스템이 T 7 기반 시스템이 유사한 상용 시스템에 엄청난 비용 절감을 추가하는 것과 동일한 양의 단백질을 생산할 수 있음을 나타냅니다.우리는 이 기술이 합성 생물학에서 엔지니어링 프로세스를 단순화하는 길을 열기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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배우세요 대장균 기반 TX-TL 무세포 발현 시스템 구축 방법을 합성생물학 연구에 활용하세요. 이 프로토콜은 단백질 발현 최적화 및 생물학적 회로 테스트를 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공합니다.

구현을위한 프로토콜 대장균을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

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