Name: 의 수집과 분석 애기 장대 사부는 EDTA-촉진 방법을 사용하여 삼출물 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-23T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 학습하세요 EDTA 촉진법을 이용한 Arabidopsis 및 다양한 식물의 플로엠 삼출물 수집 및 분석 방법을. 이 기술은 대사체, 단백질, RNA 분석을 통해 식물 신호전달 및 환경 스트레스 반응 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 NSF-IOS 부여 # 1144391에 SHB에 의해 지원되었다.

1. 식물의 준비 <ol><li> 애기 씨는 주로 토양이나 MS의 접시에 발아 할 수 있습니다. 12 시간 광주 (22 ° C 일, 15 ° C 밤 14)와 함께 성장 챔버 네 개의 주에서 6 주간 식물을 성장. 수초 한 번에 일주일에 두 번. 물에 대한 하단 용지함을 사용, 위로부터 물이 아닌 식물 않는다 트레이 다시 물을 전에 건조 할 수 있습니다. 식물은 수확의 시간에 잘 수화되어 있는지 확인하십시오. </li></ol> 2. 솔루션 및 요리 준비 <ol><li> K 2-EDTA 용액 : 냉장고에 보관 할 수있는 100 밀리미터 K 2-EDTA 용액 원액을합니다. 컬렉션의 날에 1 ~ 다섯 (한 부분 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션, 네 부분으로 물) 20 mM의 K 2-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 얻기 위해 솔루션을 희석. </li><li> 반 K 2-EDTA 용액 20 mm 인 유리 또는 페트리 접시 (직경 7~15cm)를 입력합니다. 만약 다른 처리 (예 대한에서 샘플을 수집충분한 제어 및 염분 스트레스 식물 또는 다른 유전자형), 각 치료를 위해 별도의 요리를 준비합니다. </li><li> 20 mM의 K 2-EDTA 용액 1.4 ml의 1.7 ML 반응 관의 원하는 번호를 입력합니다. 1.4 ml의 반응 관의 동일한 번호를 기입 탈이나 소동 물을 압력 가마로 소독. </li><li> 에 식물을 설정하는 벤치에 종이 타월을 넣어 하나의 새로운 면도날을 장갑에 넣어. </li></ol> 3. 사부 삼출물의 모음 (그림 1의 순서도에 묘사 된) <ol><li> 수확 장미는 장미의 중앙에 잎자루 주변의 기지에 면도날을 절단하여 4~6주 된 식물에서 잎. </li><li> 즉시 2-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) K 20 밀리미터를 포함하는 요리에 잎을 배치합니다. 잎자루의 단면 (그림 2) 용액에 침수되어 있는지 확인합니다. </li><li> 일단 15 잎은 부드럽게 서로 같은 t의 상단에 나뭇잎 스택 (ca. 3-4 식물) 수집 된모자 컷 잎자루가 서로 정렬됩니다. 잎자루 (ca. 1mm)의 기본을 연마 가공하고 즉시 K 2-EDTA 용액 20 mm 인 반응 튜브 중 하나에 잎을 전송합니다. 그들은 약간 롤업하는 경우 잎은 쉬운 맞습니다. 이 세포의 손상, 따라서 잎 셀 내용의 컬렉션에 리드를 일으킬 수 있으므로에 잎을 압박하지 마십시오. </li><li> 더 많은 자료가 필요하면, 부드럽게 젖은 종이 타월로 샘플을 커버. 만약 다른 처리 또는 유전자형에서 샘플 수집을 위해 요리의 새로운 집합을 사용합니다. </li><li> 일단 모든 샘플은 하나 어둠이나 빛의 삼출물을 수집, 반응 관에 배치됩니다. </li><li> 어둠, 선 젖은 종이 타월로 대형 얕은 접시의 바닥 수집합니다. 잎 가득한 반응 접시에 튜브 및 젖은 종이 타월로 커버 하나와 함께 랙을 배치하거나 폭기 슬릿 검은 플라스틱 백에 넣어. 캐비닛의 전체 설치 또는 어두운 방 배치. </li><li> 빛 수집을 위해 젖은 종이 타월로 명확한 플렉시 유리 용기의 바닥을 일렬로. 컨테이너의 잎 가득한 반응 튜브 랙을 배치하고 닫습니다. </li><li> 1 시간 후에 제거는 컨테이너와 반응 관에서 부드럽게 잎 모두 EDTA를 제거하기 위해 증류수 탈이나 소동 물로 씻는다. 이 단계는 세 가지 목적을 수행합니다 : (1) 그것은 세포에 최소화 손상 EDTA를 제거합니다 (2)는 SDS-PAGE 및 크로마토 그래피와 EDTA의 간섭을 제거, (3) 컷에서 축적 된 / 손상된 않은 화합물을 제거 세포. 즉시 멸균 물을 포함하는 준비된 반응 튜브에 전송하고 삼출물의 수집을위한 가습 용 컨테이너로 돌아갑니다. 삼출물이 RNA 추출을 위해 사용해야하는 경우이 시점에서, RNA 분해 효소 억제제를 추가합니다. 옵션 : 단백질 분석이 필요한 경우 단백 분해 효소 억제제를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 의도 수집 시간 후 꺼내 discaRD 잎과 추가 사용 액체 N 2 체관의 삼출물을 동결. 확장 저장이 필요한 경우, -80 샘플 및 저장 ° C.를 냉동 건조 </li><li> 애기 장대의 경우, 대사는 이미 1 시간 동안 삼출물를 수집 한 후 검색 할 수 있습니다. 덜 풍부한 구성 요소의 분석이 예정되어있는 경우 그러나 5-8 시간 동안 컬렉션 좋습니다. 들깨와 같은 큰 식물을 위해, 더 이상 수집 시간 (8 시간)이 권장됩니다. 15 잎에서 수집 한 삼출물은 mRNA의 추출을위한 SDS-PAGE 젤 (단백질), GC-MS (당분과 대사 산물)의 한 차선을 위해 일반적으로 충분하다. 지질 분석을 위해 2-3 샘플 풀링 (30-45 잎에서 삼출물) 추천 선명 결과에 이르게한다. </li></ol> 4. 이후의 분석 (비디오의 경우 우리는 4.4 표시) <ol><li> 단백질 분석을 위해, 15 μL 물 30 μL Lämmli 버퍼를 Resuspend 샘플은, 95 열 ° C 5 분, 신속하게 피를 스핀 다운recipitates 및 SDS-PAGE 젤 (45 μL 로딩 주머니)에 전체 샘플을로드합니다. 단백질 풍부 매우 낮기 때문에 샘플은 콜로이드 쿠 매시 또는 기타 민감한 얼룩 염색을해야한다. </li><li> 설탕과 작은 대사 산물 분석을 위해 문헌 14에 설명 된대로 건조 된 시료에 에이전트를 유도체 추가합니다. </li><li> 발현은 RT-PCR, microarray의 또는 RNA-시퀀서 분석을 사용하여 분석 할 수 있습니다. </li><li> 지질 분석을 위해 즉시 풀 2-3 샘플 및 클로로포름에 대한 파티션을 다음과 같이 흄 후드에서 메탄올 (1:1) : 4 분 동안 각 시료에 메탄올, 몇 초 동안 소용돌이, 원심 분리 : 동일한 클로로포름의 양을 추가 400 X g에서. 테플론 캡과 최고 위상 반복 파티션을 세 번와 유리 튜브의 바닥 (유기) 단계를 수집합니다. N 2의 흐름에 따라 결합 된 유기 단계 건조 (박층 크로마토 그래피 추가 분석에 제출 : TLC 14, 37, 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 : LC-MS 14). </li></ol>

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우리는 공개 아무것도 없어.

사부 삼출물의 EDTA-촉진 컬렉션은 매우 간단합니다, 최소한의 장비를 필요로하고, 대부분의 식물에 적용됩니다. 전반적으로,이 방법은 더 많은 종 사부 삼출물을 분석 할 수있는 능력을 확장합니다. 삼출물이 희석되어 있지만, 그것은 물질의 다량을 확장 할 여러 가지 샘플을 수집하거나 많은 식물에서하기 쉽다. 이는 매우 낮은 풍부하고 간과 될 새로운 화합물의 검출을 할 수 있습니다. 이 방법은 여러 식물 종에 사용이 원고에 나와있는 것들에 대한 설명으로 작동 할 수 있습니다. 새로운 종을 탐구하는 경우 수정해야 할 두 가지 측면 사용되는 나뭇잎과 삼출물의 시간의 번호입니다. 대부분의 경우, 주 5 일 8 시간 삼출물이 적합해야합니다. 새로운 종의 식물이 메서드를 사용하는 방법을 확인하려면, 삼출물 프로토콜 제 4 N에 설명 된대로 수집 이후 분석 중 하나 이상을해야합니다eeds을 수행 할 수 있습니다. 관찰 된 신호의 강도에 따라 수집 볼륨은 최대 크기를 조정해야 할 수도 있습니다. 전자는 사부의 삼출물 덜 풍부하기 때문에 일반적으로, 지질 및 단백질 분석은 설탕과 대사 산물 분석보다 더 많은 자료가 필요합니다. EDTA-촉진 삼출물 컬렉션 잘라 표면뿐만 아니라 EDTA의 잠재적 손상 효과를 포함하기 때문에, 여러 가지 점을 고려 할 수있다 : (1) EDTA와 함께 한 시간 배양 한 후, 잎자루는 철저하게 세척해야합니다. 이 상처 입은 세포뿐만 아니라 세포를 손상 시키거나 추출을 방해 할 수 EDTA 자체에서 얻은 화합물을 제거한다. (2) 긍정적이고 부정적인 컨트롤 얻은 데이터가 체관부 수액에서 파생되도록 포함될 필요하지 손상된 세포 (아래 중요한 단계 참조). (3) 체관부 수액 삼출물 수집하는 동안 활성화 될 수있는 몇 가지 효소를 포함한다. 따라서, 어떤 경우에는 FO를 수집하는 것이 유용 할 수 있습니다시간의 R 다른 양. 방법은 물에 스며 나옴을 포함하기 때문에 (4), 화합물의 절대 정량 할 수 없습니다. 중요한 단계 (. REF 참조 14) 해당 컨트롤의 세포뿐만 아니라 사용을 손상하지 않는 샘플을 처리하는 동안이 메서드의 성공적인 사용의 핵심은주의를 사용하는 것입니다. 한 적절한 컨트롤은 EDTA와 사전 처리없이 사부의 삼출물의 모음입니다. 이 경우 체관 자체를 밀봉하고 더 삼출물을 수집 할 수 없습니다. 상처 입은 세포에서 나오는 모든 오염 물질이 여기에 감지됩니다. 두 번째 컨트롤은 삼출물에있는 설탕의 분석 될 것이다. 애기 장대에서, 자당는 1:4 1시 8분 (REF 8, 14) 사이의 크로스 비율 과당, 체관부 수액에서 주된 대사 산물이어야한다. RNA 추출을위한 RNA 분해 효소 억제제의 사용이 필요합니다. 이전 describ의 또한, 양성 대조군ED 사부 현지화 발현 (UBC9 : 유비퀴틴 결합시키는 효소 9 At4g27960, 8, 14) 예를 들면의 부정적인 제어 엽록체의 mRNA (Rubisco LSU)가 바람직하다. 삼출물이 활성 효소를 포함하고 있기 때문에, 시간 코스 수집 시간의 변화에​​ 단순히 때문이 사부 프로필에서 확인을 변경하는 것이 좋습니다. 경우에 따라서는 단백질 분해 효소 억제제를 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 그러나 연구자는 수집 된 삼출물이 집중 추가 된 화합물은 주로 집중 될 것이라는 될 것을 명심해야합니다. 프로토콜에서 두 번째 중요한 단계는 EDTA 아래 잎자루의 다시합시다입니다. 이 단계는 이중 목적을 제공합니다 : 새로운 따라서 체관부 수액의 자유로운 흐름을 허용하는 플러그의 형성을 방지하면서 첫째, 어떤 밀봉 체 플레이트를 제거합니다. 둘째, 절단 동안 생성 된 목부에서 캐비테이션 거품을 제거하기 때문에 목부 전송 할 수 있습니다. 두 번째 컷의 크기는 좌우사용되는 식물에의. 큰 잎자루를 가진 식물은 애기 장대 같은 식물에서 첫 번째 컷, 위의 몇 밀리미터 (최대 1cm)이어야한다 1-2 MM은 충분하다. 이 방법의 사용은 개발 또는 생명 영향을 신호 수도 사부 삼출물에있는 새로운 화합물의 발견으로 이어질 수 있습니다. 그것은 사부에 대한 접근의 부족으로 인해 식물 과학에서 거의 연구 된 분야였다 장거리 지질 신호,에서 깊이있는 모습 더하라는 메시지가있다.

식물은 불리한 조건을 탈출 이동할 수 없습니다. 결과적으로, 그들은 환경 스트레스를 감지하는 메커니즘을 개발 유도 및 공장 전반에 걸쳐 관련 신호를 전송하고 그에 따라 개발을 조정했습니다. 두 전송 시스템은 물, 영양분 및 기타 (신호) 화합물의 분포 존재한다. 첫 번째는 목부이며, 일반적으로 물을 수송과 미네랄은 식물 전체에 뿌리에 의해 흡수하는. 두 번째는 사부입니다. 사부의 뷰가 RNA에 대한 간단한 동화 교통 시스템에서 도관으로 변경, 단백질, 바이러스, 지질 및 다른 작은 분자. 그것은에 중요한 역할을 동화 양분 교통, 생물 및 비 생물 적 스트레스에 대한 반응뿐만 아니라 식물의 성장과 발전에서와 같이. 그것은 지금 공장 18의 &quot;정보 고속도로&quot;라고합니다. 사부 실질뿐만 아니라, 전문적인 동반자 CE : 사부는 여러 종류의 세포로 구성되어 있습니다LLS 및 체 요소입니다. 체 요소는 장거리 이동 사이트입니다. 방해 세로 흐름을 허용하기 위해 체 요소뿐만 아니라 핵 대부분의 세포 소기관을 누락하고 최상의 제한된 번역 기계 21, 33를 포함하는 것으로 생각되고 있습니다. 그것은 동반자 세포가 단백질과 체관 스트림 여행 다른 화합물을 합성하는 것으로 생각됩니다. 이 화합물은 다음의 원형질을 통해 체 요소에 전송되는 장거리 신호 4,16으로 작동 할 수 있습니다. 화합물의 여러 그룹이 사부의 삼출물에서 찾을 수 있습니다 : <ul><li> 설탕은 종종 광합성의 제품입니다 및 저장을위한 식물의 다른 부분에 &quot;에너지를 운반하는 &#39;분자 나 빌딩 블록으로 운반된다. 그러나, 그들은 또한 부동액이나 화합물을 신호로 작동 할 수 있습니다. </li><li> 단백질은 사부의 삼출물에서 찾을 수 있습니다. 그들은 신진 대사 효소를 포함뿐만 아니라 기능을 신호했다. 한 examp발달 신호 역할을하는 단백질의 르 꽃의 유도뿐만 아니라 식물 계절 잎 절단 신호를 꽃 궤적 T 단백질이다. 6 </li><li> 핵산 발현, 작은​​ 마이크로 RNAs를, 그리고 바이러스의 RNA 형태로 체관 분비물에 존재한다. 그들은 주로 신호 27, 28, 39에 관련된 것으로 나타납니다. 동시에, rRNA의 거의 모든 아미노산 tRNAs를은 조롱박 (42)의 체관부 수액에서 관찰되었다. 그들은 선택적 체 튜브 시스템으로 전송 될 것으로 보인다. tRNAs를가 번역 장치에 아미노산을 전송하는 기능에 필요한 수정 사항을 보여줍니다. 그러나, 오히려 번역에 참여하는 것보다, 그들은이 과정을 억제하기 위해 나타납니다. 또한, 그들은 토카이 닌의 원천 역할을하거나 식물 (42)의 대사 상태를 신호 수 있습니다. </li><li> 지방산, oxylipins 및 기타 지질은 사부 삼출물 3, 13, 14, 23에서 발견되었습니다. JasmoNIC 산, 병원균 감염 22, 29, 31, 32에 대한 응답의 일환으로 체관을 통해 oxylipin 이동합니다. 대부분의 사부 지질의 역할은 아직 불분명하지만, 그들 중 일부는 가능성이 기능 4 신호했다. </li></ul> 식물 체관부와 협력의 과제는 상처를 입기에 자신을 봉인하는 능력에 달려있다. 이 사부의 삼출물을 수집하는 데 사용되는 네 가지 주요 방법이 있습니다, 그러나 그들은 선택 종에서만 작동합니다 : 1) 조롱박으로는 잎자루의 인하를 통해 사부의 삼출물의 합리적인 금액을 얻을 수있다. 손상된 세포의 오염과 초기 드롭이 제거되면, 그것은 순수한 체관부 수액 1, 15의 합리적 많은 양을 얻을 수있다. 그러나 증가 수집 시간, 액체 크로마토 그래피 방법 (미발표)에 대한가 점점 부적합이 삼출물이 두껍게 만들기. 최근 출판물은 종에 따라이 체관부 수액을 eithe에서 파생 된 것으로, 제안그것은 체 요소 (FP)에서 &quot;모바일&quot;체관부 수액을 포함 수행하는 동안 R fascicular (FP) 또는 extrafascicular 사부 (EP)와 그, 그것은 또한 목부 (40)을 포함 다른 세포 유형, 41 오염 경향이있다 . 2) 두 번째 방법은 줄기 나 잎자루 얕은 상처 나 구멍을 통해 체관부 수액을 얻을 수있다. 이 방법은 피나 17, 25, 조롱박 36, 그리고 브라 시카 napus 12에서 성공적으로 사용되었습니다. 여기에 부상 세포의 오염을 최소화하고 매우 순수한 삼출물. 그러나 식물은 매우 선택적으로 구멍을 막 체 요소에 도전하기 때문에 건강하고 잘 급수 할 필요가있다. 목부 혈관이 다친 경우, 모든 삼출물이 목부 스트림으로 그려집니다. 이것은 매우 허약하거나 매우 lignified 잎자루 또는 줄기를 가진 식물에 적합하지 않은 방법을합니다. 3) 진딧물 stylectomy는 진딧물이 체 요소로 자신의 탐침을 삽입 할 수 있습니다N 레이저 진딧물을 제거. 체관부 수액은 나머지 탐침 2, 9, 10, 35, 38을 통해 발산된다. 이론적으로는 진딧물에 의해 감염 될 수있는 공장이 방법을 사용할 수 있습니다. 그러나, 대부분의 온실 또는 성장 챔버 관리자는 병원체의 사용을 지원하지 않습니다. 또한, 진딧물은 침 19, 33과 체관에 여러 단백질을 소개합니다. 이 30 프로그래밍 제한된 전사에 이르게과 체관 구성 26 변경 가능성이 있습니다. 4) 여기에서 설명하는 방법은 체관부 수액 EDTA-촉진 삼출물이다. 이 방법은 체관 (20)의 바다 표범 어업을 방지하기 위해 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 사용합니다. EDTA는 칼슘 2 + 그렇지 않으면 체관을 밀봉하는 과정에 참여하는 것이 이온을 킬레이트. EDTA는 세포 손상 30로 이어질 수 있지만, 몇몇 그룹은 세포의 미세 구조 또는 phloe 20 mm까지이 방법을 사용하고 10 MM에서 EDTA 농도의 부정적인 영향을 관찰 한M 적재 및 운송 5, 24. 어떤 파괴적인 효과뿐만 아니라 크로마토 그래피 및 겔 전기 영동과 EDTA의 간섭을 줄이기 위해 식물은 1 시간 후 물에 이동되고 삼출물 만 후반부는 14 사용됩니다. 따라서, 오히려 EDTA로 스며 나옴보다, 사부 물 (EDTA-촉진 스며 나옴)로 exudated 있습니다. 그것은 사부의 삼출물의 수집을위한 똑 바른 앞으로, 낮은 비용, 낮은 기술 방법입니다. 체관부 수액이 방법은 단백질, 작은 분자, 지질 및 RNA를 분석하는 데 사용할 수 있습니다 얻고 많은 식물에서 성공적으로 사용되었습니다. 실험의 제한된 양의 외떡잎 11에서 수행하고있는 동안,이 메소드는 dicots (들깨 17, 20, 애기 장대 8, 13, 14, 포플러 7)에 더 적합 할 것으로 보인다. 삼출물의 컬렉션 증산을 통해 삼출물의 손실을 피하기 위해 다습 한 환경에서 발생합니다. 식물에 따라 1 ~ 2 시간 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 배양은사부 / 체 요소의 바다 표범 어업을 방지하기에 충분. 이 컬렉션은 다음 물에 발생할 수 있습니다. 이 EDTA 세포의 구조와 안정성에 미치는 부정적인 영향을 방지하는 이점을 갖고있다. 또한 HPLC 또는 SDS-PAGE와 같은 방법으로 EDTA의 간섭을 제거합니다. 이 애기 장대에 적용이 표시됩니다. 큰 식물, EDTA 및 삼출물 컬렉션의 배양은 최대 크기를 조정해야합니다 오히려 1.7 ML 반응 관에 비해 커에 수행됩니다.

<table><tbody><tr><td>K2-EDTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>ED2P-500G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>얕은 유리 또는 플라스틱 페트리 접시 (7-15cm)</td><td>PYREX 또는 Corning</td><td></td><td>깨끗하고 얕은 접시는 모두 작동합니다</td></tr><tr><td>. 클로로포름</td><td>EMD</td><td>CX1054-1</td><td>흄 후드의 용기만 열려</td></tr> 있습니다. <tr><td>메탄올</td><td>J.T.Baker</td><td>9070-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>스크류 캡 튜브</td><td>VWR International</td><td>53283-800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>스크류 캡 튜브</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

의 수집과 분석<em&gt; 애기 장대</em&gt; 사부는 edta-촉진 방법을 사용하여 삼출물

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

식물의 체관의 장거리 수송 (사진)과 생물 또는 비 생물 적 스트레스를 전달하는 신호로 동화 필수적입니다. 그것은 설탕, 아미노산, 단백질, RNA, 지질 및 기타 대사 산물이 포함되어 있습니다. 따라서 구성과 기능 사부의 이러한 분자의 많은 역할과 이해에 큰 관심이 있지만, 식물의 개발과 스트레스의 중요성이 반응은 아직 결정되지 수 있습니다. 사부 분석 한 장벽시 체관부 씰 자체가 상처를 입는 있다는 사실에있다. 그 결과로, 체관부 수액을 얻을 수있는 식물의 수는 제한됩니다. 추가 장비없이 여러 식물 종 체관의 삼출물의 수집을 허용 한 가지 방법은 EDTA-촉진 사부 삼출물 수집이 여기에 설명되어 있습니다. 사용하기 쉬운 반면, 그것은 세포의 상처를 입기에 이르게 손질이 손상된 세포의 내용을 제거하기 위해 수행 할 수있다. 또한, 몇 가지 컨트롤은 삼출물의 순결을 증명하기 위해필요합니다. 오히려 그 내용만을 기준으로 정량화가 발생할 수 있습니다 체관부 수액 (많은 종 불가능합니다)의 직접 수집보다 삼출물 때문이다. 다른 사람을 통해이 방법의 장점은 많은 초본 또는 목본 식물 종 (들깨, 애기 장대, 포플러 등)에 사용되는 최소한의 장비와 훈련을 필요로 할 수 있다는 것입니다. 그것은 단백질, 당, 지질, RNA, 바이러스 및 대사 산물의 후속 분석을 위해 사용할 수있는 삼출물 합리적으로 다량 발생합니다. 그것은이 두 연구뿐만 아니라 교육 실험실에서 사용할 수있을만큼 간단합니다.

그것은 체관부 수액의 복잡성 식물이 최적의 응답 발달과 스트레스 신호를 다양한 전송 방법의 질문에 대한 해답이 될 수 있다는 것을 지난 몇 년 동안 분명되고있다. EDTA-촉진 사부의 삼출물을 사용하면 다른 방법에 적합하지 않습니다 만, 경제적 또는 생리 학적 관심의 대상이 될 수 있습니다 식물의 체관 삼출물을 분석 할 수있는 기회를 제공 할 수 있습니다. 충분히 사부의 수확 사부 지역화 된 단백질을 확인하고 (그림 3) 개발 또는 스트레스에 대한 응답 수준의 변화를 감지하는 삼출물이 방법은 있습니다. 그림 쇼는 단백질이 매우 낮은 풍부이기 때문에, 아직 그 수준은 LC-MS/MS를 사용하여 후속 프로테오믹스 실험이나 서양 얼룩 분석을위한 충분한 높다. 조롱박의 연구 결과는 줄기의 절단 물 잠재적 인 균형의 붕괴와 물 후속 유입에 이르게 및 제안apoplast 41에서 가능한 오염 물질. : 아직 하나에서 8 시간까지 시간을위한 컬렉션 체관 단백질 프로파일 / 작곡 애기 장대에서 (. 만 절대 금액이 Guelette 등 변화), 수집 된 단백질의 양과 발견 단백질의 패턴에 영향을주지 않습니다 것은 종 (Arabidopsis의 사이에 차이가 에서, 들깨, 레인 I 및 NI) 및 치료 (들깨 다른 하루의 길이로 성장, 차선 I 및 NI). 결과 단백질 성 신호를 시각화 할 수있는 식별 및 따랐다. mRNA의 마이크로 RNA를도이 방법으로 사부의 삼출물에서 확인하실 수 있습니다. 그러나 RNA 분해 효소 억제제 치료는 확장 삼출 시간 동안 발현의 저하를 방지 할 필요가있다. 체 요소가 작동 엽록체, Rubisco 작거나 큰 소단위 (각각 적혈구 또는 RbcL,)를 포함하지 않기 때문에 사부 알려진 동안의 mRNA는 부정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다지역화 유비퀴틴 결합시키는 효소와 같은 발현은 양성 대조군 (그림 4)로 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 설탕 또는 작은 대사는 GC-MS 또는 LC-MS를 사용하여 분석 할 수 있습니다. 여기가 사부의 분비물은 거의 모든 당분 경로 12 등의 기능 효소의 큰 숫자를 포함하는 언급해야한다. 따라서, 여러 시간 지점을 사용하여 삼출물를 수집하는 동안 신진 대사 과정을 보여줄 수 있습니다. 예는 그림 5에 표시되어 모든 삼출물에서 자당이 가장 풍부한 대사 산물이며,이는 1 시간 동안 수집 한 후 가장 명백하다. 그러나 다섯 시간 후에 과당 비율 자당가 약간 줄어 듭니다. 같은 삼출물이 다음 4 시간 동안 한 시간 동안 수집 벤치에 남아있는 경우, 비율 과당 자당은 사부의 활성 효소 객실 TEM에서 자당의 저하로 이어질 삼출물 것을 제안, 훨씬 더 큰 범위로 감소온도 (더 피크 해석 14 참조). 이 시스템이 생명력 34 잃을 때까지 사부로드 및 체 요소에 동반자 세포 분자의 수송 삼출 동안 계속할 수있는 결과와 일치한다. 사부의 삼출물의 지질과, 확장, 장거리 지질 신호 식물 과학에 대한 관심이 비교적 최근의 필드입니다. 자신의 소수성 지질로 인해 낮은 농도에서만 존재하고 가용화 다른 분자에 바인딩 할 수 있습니다. 그러나, EDTA-촉진 삼출물 시각화 할 수있는 충분한 자료 수집을 할 수 있습니다 (TLC, 그림 6)과 (LC-MS, 그림 7)를 식별 여러 종의 식물에서 사부 지질합니다. 그림에서와 같이 그것은 여러 가지 지질 종을 식별하고 분리 할 수​​ 있습니다. LC-MS는 서로 다른 지질 종을 식별하고 differe에의 지질 프로파일에서 변경 사항을 모니터링 할 수 있습니다NT 유전자형이나 치료. 이 공장 개발 및 스트레스 반응 중 지질의 역할을 연구 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> 그림 1. 애기 장대 나 들깨의 체관의 삼출물의 컬렉션의 흐름도. 다른 경로는 파란색으로 표시됩니다 다른 최종 제품으로 이어질. RNA, RNA 분해 효소 억제제 (100 U / ㎖, 로슈)의 준비를 위해 사부의 삼출물이 수집되는에 물에 추가됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> 그림 2. 수집 사부의 삼출물에 대한 자료의 설정이온. 설정 프로토콜 단계 3.1-3.4에 필요한 모든 자료를 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . 분자량 마커 (레인 2) : MW; 체관부에있는 그림 3 단백질은 두 개의 서로 다른 식물 종, 애기 장대 (시)와 들깨 (, 다른 날 길이 I와 NI)의 삼출물. 단백질은 20 % 기울기 SDS-PAGE를 이용하여 분리 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> 그림 4. 분석Rubisco 크고 작은 소단위에 대한 발현 (각각 적혈구 및 RbcL)와 유비퀴틴 결합시키는 효소 (UBC)의 존재. 발현은 애기 장대 잎 (L), 잎자루 (P), 그리고 사부의 삼출물 (수소 이온 농도)에서 수집, PCR을 사용하여 시각 전사 특정 성적표를 역으로 수행하십시오. 그림은 Guelette 등으로부터 바뀌 었습니다. 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> 사부의 그림 5. GC-MS 프로파일은 시간의 다른 금액에 대한 수집 삼출물. 참고 어떻게 수집 시간 (B) 5 시간 1 시간 컬렉션 (A)에서 자당 변화의 상대적인 양. 룸에서 &quot;보육&quot;다음에 1 시간 동안 수집 한 후 프로필을 삼출물<html> 4 시간 동안 온도 (RT) (C). 잎 대사 산물 프로파일 (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> 그림 6. 얇은 층 들깨 (왼쪽)와 애기 장대 (오른쪽) 잎과 체관의 삼출물에서 지질을 비교 크로마토 그램. 별표 사부의 분비물에 대한 특정 지질을 나타냅니다. DGDG : digalactosyldiacylglycerol, PG : phosphatidylglycerol; MGDG : monogalactosyldiacyglycerol, 애기 장대 지질를 표시하는 그림의 일부가 Guelette 등에서 수정되었습니다 14.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . NT &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> 그림 7. LC-MS / 마이너스 이온 모드를 사용하여 애기 장대의 체관의 삼출물 (클로로포름 단계)의 지질. 상단에 그래프 (돌연변이)과 하단 (야생 형, B)는 두 개의 서로 다른 유전자형 (화살표로 표시) 사이의 지질 프로파일의 차이를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

체관부 수액의 조성뿐만 아니라 로딩 및 장거리 전송 메커니즘의 지식은 식물의 개발과 스트레스 / 병원균 응답 및 전송 동화의 장거리 신호의 이해를 위해 필수적이다. 이 원고는 EDTA-촉진 방법을 사용하여 체관의 삼출물의 컬렉션을 설명합니다.

의 수집과 분석<em&gt; 애기 장대</em&gt; 사부는 EDTA-촉진 방법을 사용하여 삼출물

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

본 절차의 전체적인 목표는 Arabidopsis 또는 다른 식물로부터 체관 exudate를 수집하여 그 성분을 분석하거나 체관 흐름 내 화합물의 존재를 확인하는 것입니다. 이는 먼저 꽃잎을 절단하고 potassium EDTA에 배양하여 체관 요소의 폐쇄를 방지함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 꽃잎을 철저히 세척하여 후속 분석을 방해하거나 장기간 노출 시 세포를 손상시킬 수 있는 잔류 EDTA를 제거하는 것입니다.다음으로, 흐름 EM 삼출물을 물에 수집합니다. 마지막 단계는 LC-MS/GC-MS, 젤 전기영동 및 박층 크로마토그래피를 통한 후속 분석을 위해 샘플을 준비하는 것입니다. 궁극적으로, EDTA로 촉진된 phem 삼출은 대사물질과 지질, 단백질 또는 RNA와 같은 phem 함량을 분석하고 확인하는 데 사용될 수 있습니다.식물은 불리한 환경 조건에서 벗어날 수 없습니다. 그 결과, 식물은 환경 신호를 식물 전체에 전달하고 발달 과정을 변경하여 대응할 수 있는 매우 효율적이고 빠른 시스템을 필요로 합니다. 이러한 신호 전달 경로 중 하나가 식물 흐름(plant flow)이며, 그 구성 성분을 이해하는 것은 상당히 복잡합니다.우리는 유동물의 내용물을 수집하고 분석하기 위해 EDTA를 이용한 유동 진정법을 사용합니다. 이 방법은 원래 King 등에 의해 Perilla에서 개발되었으나, 다른 종에 대해서도 쉽게 수정하여 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 전, 저희 실험실의 학부생인 Elena와 US가 시연을 맡을 예정입니다.수집 당일까지 12시간 광주기 조건의 생장실에서 Arabidopsis 식물을 4~6주 동안 배양합니다. 이전에 준비한 100 millimolar potassium EDTA 용액을 증류수로 희석하여 최종 농도를 20 millimolar로 맞춥니다. 그다음, 직경 7~15 centimeter의 유리 접시 두 개에 20 millimolar potassium EDTA 용액을 절반 정도 채웁니다.완료되면, 1.7 milliliter 반응 튜브에 20 millimolar potassium EDTA 용액 1.4 milliliters를 채웁니다. 그런 다음 동일한 수의 반응 튜브에 millipore water 1.4 milliliters를 채웁니다. 성장 챔버에서 4~6주 된 식물을 꺼낸 후, 로제트 중심 근처의 꽃잎 기부를 면도날로 잘라 로제트 잎을 수확합니다.잎을 즉시 20 millimolar potassium EDTA가 담긴 디쉬에 넣고, 자른 끝부분이 용액에 잠기게 합니다. 3~4개 식물에서 15장의 잎을 수집하면, 자른 꽃잎 부분이 서로 정렬되도록 잎을 조심스럽게 겹쳐 쌓습니다. 꽃잎의 기부를 다시 자르고 잎을 부드럽게 맙니다.그 다음, 분비물 수집을 위해 20 millimolar potassium EDTA가 들어 있는 반응 튜브 중 하나에 말아놓은 잎을 조심스럽게 넣습니다. 어두운 곳에서 크고 얕은 접시 바닥에 젖은 종이 타월을 깝니다. 잎이 들어 있는 반응 튜브가 꽂힌 랙을 접시에 배치하고, 통풍을 위한 틈이 있는 검은색 플라스틱 봉투에 넣습니다.그 다음, 전체 장치를 삼출물 수집을 위한 캐비닛에 넣습니다. 투명 플렉시글라스 컨테이너 바닥에 젖은 종이 타월을 깝니다. 잎이 들어있는 반응 튜브가 꽂힌 랙을 컨테이너 안에 넣고 닫습니다.컨테이너에서 랙을 제거한 후 1시간 뒤에 반응 튜브에서 잎을 꺼냅니다. 증류수로 잎을 충분히 세척하여 모든 EDTA를 제거합니다. 즉시 잎을 millipore water가 들어 있는 반응 튜브로 옮기고, 습윤 컨테이너에서 랙을 제거한 후 삼출물을 수집하기 위해 다시 습윤 컨테이너에 넣습니다.5~8시간 후, 튜브에서 잎을 꺼낸 다음 액체 질소로 유출물을 급속 냉동시키고 -80 °C 냉동고에 보관합니다. 다음 날 추가 분석을 위해, 지질 분석 준비 단계로 샘플을 해동합니다. 그다지 2~3개의 샘플을 취해 혼합 용액에 동일한 양의 클로로포름과 메탄올을 첨가합니다.혼합물을 몇 초 동안 보텍싱합니다. 다음으로, 샘플을 400 gs에서 4분 동안 원심분리합니다. 완료되면, 상층과 분배 과정을 3회 더 반복한 후 하층의 유기상을 유리 튜브에 수집하고, 수집된 유기상들을 질소 기류 하에서 건조시킨 후 박층 크로마토그래피 및 LCMS 분석을 수행합니다.이 방법을 통해 phem 국소 단백질 및 발달 또는 스트레스에 따른 해당 단백질 수준의 변화를 식별하기에 충분한 양의 phem 삼출물을 수집할 수 있습니다. 경우에 따라 연구자는 단백질 분해를 방지하기 위해 단백질 분해 효소 억제제를 사용할 수 있습니다. 여기서 보여주는 바와 같이, 단백질의 함량은 매우 낮지만, 이후의 단백질체학 실험을 수행하기에는 충분한 수준입니다.LCMS 또는 웨스턴 블롯 분석을 이용한 박과 식물의 결과에 따르면, 줄기 절단은 수분 포텐셜 균형의 붕괴를 초래하며, 이로 인해 하단부로부터 수분 및 잠재적 오염 물질이 유입되는 것으로 나타납니다. 하지만 1시간에서 8시간 사이의 수집 시간은 flow M 단백질 프로파일과 InOpSys의 조성에 영향을 미치지 않습니다. 수집된 단백질의 양과 발견된 단백질 패턴은 종 및 처리 조건에 따라 다르게 나타납니다.결과적으로 단백질 신호를 시각화하고 식별하며 추적할 수 있습니다. 이 방법을 통해 flom exudates에서 mRNA와 microRNA 또한 식별할 수 있습니다. 다만, 연장된 삼출 시간 동안 mRNA의 분해를 방지하기 위해 RNA 억제제 처리가 필요합니다.C 요소는 기능적인 엽록체를 포함하고 있지 않으므로, rubis, small 또는 large subunit mRNA를 음성 대조군으로 사용할 수 있으며, ubiquitin conjugating enzyme와 같이 pH flu m에 국소화된 것으로 알려진 mRNA를 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 당 또는 소분자 대사체는 GCMS 또는 LCMS를 사용하여 분석할 수 있습니다. phem 삼출물에는 거의 전체 당분해 경로를 포함하여 수많은 기능적 효소들이 포함되어 있다는 점을 언급해야 합니다.따라서 여러 시점을 사용하면 삼출물 수집 과정 중의 대사 과정을 밝혀낼 수 있습니다. 모든 삼출물에서 sucrose가 가장 풍부한 대사물질입니다. 이는 1시간 동안 수집한 후에 가장 분명하게 나타납니다.하지만 5시간 후에는 sucrose 대 fructose의 비율이 약간 감소합니다. 동일한 삼출액을 1시간 동안 수집한 후 벤치 위에 4시간 더 방치하면, sucrose 대 fructose의 비율이 훨씬 더 크게 감소합니다. 이는 phem 삼출액 내의 활성 효소가 상온에서 sucrose의 분해를 유도함을 시사합니다.또한, 5시간 동안 지속적으로 수집했을 때 자당 대비 과당 비율의 감소가 매우 적게 나타난 점은, 체관부(phloem)의 적재 및 동반 세포에서 체관 요소로의 분자 수송이 체계의 활력이 상실될 때까지 삼출 과정 중에 계속될 수 있다는 발견과 일치합니다. 체관 삼출액 내의 지질, 그리고 더 나아가 장거리 지질 신호 전달은 식물 과학 분야에서 비교적 최근에 주목받기 시작한 영역입니다. 지질은 소수성 성질로 인해 낮은 농도로만 존재하며, 가용화를 위해 다른 분자와 결합되어 있을 수 있습니다.그럼에도 불구하고 EDTA로 촉진된 삼출을 통해 여러 식물 종에서 유동 및 지질을 시각화하고 식별하는 데 충분한 양의 물질을 수집할 수 있습니다. 여기서 보여주는 바와 같이, 박층 크로마토그래피를 사용하여 여러 지질 종을 분리하는 것이 가능합니다. LCMS를 이용하면 서로 다른 지질 종을 식별하고, 다양한 유전자형 또는 처리 조건에 따른 지질 프로필의 변화를 모니터링할 수 있습니다.이를 통해 식물 발달 및 스트레스 반응 과정에서 지질의 역할을 연구할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 최소 3시간 만에 완료할 수 있습니다. 하지만 대부분의 시료의 경우, 5~8시간의 수집 시간을 권장합니다.이 경우, 이른 아침부터 잎 수확을 시작하는 것이 권장됩니다. 이 절차는 다른 식물에도 적용하여 수정할 수 있으며, 새로운 꽃 화합물을 발견하거나 확인하는 결과로 이어질 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 EDTA를 제거하기 위해 첫 1시간 이후에 PDL을 철저히 관찰해야 하며, 다른 세포의 내용물로 인한 오염을 방지하기 위해 잎을 짜지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.또한, 장갑을 착용하면 피부에서 유입될 수 있는 오염 물질로부터 샘플을 보호할 수 있습니다. 오염을 방지하려면 단백질, RNA 또는 대사체 샘플에 적절한 대조군을 사용하십시오. 권장 대조군은 텍스트 프로토콜에 나열되어 있습니다. 이 방법을 통해 우리는 식물 흐름(plant flow)의 구성에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있었습니다.우리는 바닥의 수성 환경에서는 나타나지 않을 것으로 예상되었던 여러 지질들을 형태 삼출물 내에서 식별할 수 있었습니다. 이를 통해 우리와 다른 연구자들은 원거리 지질 신호 전달이라는 개념을 도입하게 되었으며, 이는 현재 임플란트 연구의 흥미로운 새로운 분야로 발전하였습니다.

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연구

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Biology

생물학

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