Collection and Analysis of <em>Arabidopsis</em> Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Olena Tetyuk; Urs F. Benning; Susanne Hoffmann-Benning

doi:10.3791/51111

JoVE Journal
Biology

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

의 수집과 분석 애기 장대 사부는 EDTA-촉진 방법을 사용하여 삼출물

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October 23, 2013

DOI: 10.3791/51111-v

Olena Tetyuk¹, Urs F. Benning¹, Susanne Hoffmann-Benning¹

¹Biochemistry and Molecular Biology,Michigan State Universtiy

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study outlines a method for collecting phloem exudates from plants, specifically Arabidopsis, using an EDTA-facilitated approach. Understanding the composition of phloem sap is crucial for insights into plant signaling and responses to environmental stress.

Key Study Components

Area of Science

Plant biology
Phloem transport mechanisms
Metabolite analysis

Background

Phloem sap plays a vital role in long-distance signaling in plants.
Efficient transport of nutrients and signals is essential for plant development.
The EDTA-facilitated method allows for effective collection of phloem exudates.
Understanding phloem composition aids in studying plant responses to stress and pathogens.

Purpose of Study

To collect and analyze phloem exudates from Arabidopsis and other plants.
To confirm the presence of metabolites, proteins, and RNAs in the phloem sap.
To investigate the signaling pathways involved in plant responses to environmental conditions.

Methods Used

Incubation of plant petals in potassium EDTA to prevent sealing of the sieve elements.
Collection of phloem exudates into reaction tubes for analysis.
Use of LC-MS, GC-MS, and thin layer chromatography for metabolite analysis.
Freezing and thawing samples for further analysis of proteins and RNAs.

Main Results

Successful collection of phloem exudates sufficient for proteomics and metabolomics studies.
Identification of proteins and metabolites, including sucrose as the most abundant metabolite.
Demonstration of the method's applicability across different plant species.
Insights into the dynamics of phloem composition in response to developmental and stress conditions.

Conclusions

The EDTA-facilitated method is effective for studying phloem exudates.
Phloem sap analysis can reveal important information about plant signaling and metabolism.
This approach can be adapted for various plant species to enhance understanding of phloem functions.

Frequently Asked Questions

What is the significance of phloem sap analysis?

Phloem sap analysis is crucial for understanding plant signaling, nutrient transport, and responses to environmental stress.

How does the EDTA-facilitated method work?

The method involves incubating plant tissues in EDTA to prevent sealing of sieve elements, allowing for the collection of phloem exudates.

What types of compounds can be analyzed from phloem exudates?

Metabolites, proteins, and RNAs can be analyzed from phloem exudates using various analytical techniques.

Can this method be used for other plant species?

Yes, the EDTA-facilitated method can be modified for use with various plant species beyond Arabidopsis.

What are the main challenges in collecting phloem exudates?

Challenges include preventing contamination and degradation of samples during the collection process.

How long should the exudate collection process take?

Exudate collection can range from one to eight hours, depending on the desired volume and analysis.

체관부 수액의 조성뿐만 아니라 로딩 및 장거리 전송 메커니즘의 지식은 식물의 개발과 스트레스 / 병원균 응답 및 전송 동화의 장거리 신호의 이해를 위해 필수적이다. 이 원고는 EDTA-촉진 방법을 사용하여 체관의 삼출물의 컬렉션을 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 애기장대 또는 다른 식물에서 플롬 삼출물을 수집하여 그 함량을 분석하거나 플롬 스트림 내에 화합물의 존재를 확인하는 것입니다. 이것은 먼저 바다 요소의 밀봉을 방지하기 위해 EDTA 칼륨에서 꽃잎을 자르고 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 꽃잎을 철저히 세척하여 후속 분석을 방해하고 장기간 노출되는 동안 세포를 손상시킬 수 있는 남아 있는 EDTA를 제거하는 것입니다.

다음으로, 유동 EM 삼출물을 물로 수집합니다. 마지막 단계는 L-C-M-S-G-C-M-S 겔, 전기영동 및 박층 크로마토그래피에 의한 후속 분석을 위한 샘플을 준비하는 것입니다. 궁극적으로 EDTA 촉진 phem 삼출은 대사 산물 및 지질, 단백질 또는 RNA와 같은 phem 함량을 분석하고 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

식물은 불리한 조건에서 벗어날 수 없습니다. 그 결과, 플랜트 전체에 환경 신호를 전송하고 개발 과정을 변경하여 대응할 수 있는 매우 효율적이고 빠른 시스템이 필요합니다. 이러한 신호 경로 중 하나는 식물의 흐름이며, 이는 식물의 구성을 이해하는 것이 매우 복잡합니다.

우리는 흐름 내용의 수집 및 분석을 위해 EDTA 촉진 흐름 진정제를 사용합니다. 그것은 원래 왕에 의해 Perilla에서 개발되었지만 다른 종을 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 이 절차를 시작하기 전에 제 연구실의 학부생인 Elena와 US입니다.

Grow Arabidopsis는 컬렉션 당일에 12시간 동안 사진 촬영을 하면서 성장실에서 4주에서 6주 동안 계획합니다. 이전에 준비된 100 밀리몰 칼륨 EDTA 용액을 물로 희석하여 20 밀리몰의 최종 농도를 얻었습니다. 다음으로, 직경이 7-15cm인 유리 접시 2개를 20밀리몰 칼륨 EDTA 용액으로 반쯤 채웁니다.

완료되면 1.7ml 반응 튜브에 1.4ml의 20 millimolar 칼륨 EDTA 용액을 채웁니다. 그런 다음 동일한 수의 반응 튜브에 1.4ml의 밀리포어 물을 채웁니다. 생장실에서 4주에서 6주 된 식물을 제거한 후, 장미 중앙에 가까운 꽃잎 밑동에서 면도날로 잘라 장미 잎을 수확합니다.

즉시 20 밀리몰 칼륨 EDTA가 들어있는 접시에 잎을 넣고 peole의 절단 끝을 용액에 담그십시오. 3-4개의 식물에서 15개의 잎을 모으고 나면 자른 꽃잎이 서로 정렬되도록 조심스럽게 겹쳐 쌓습니다. 꽃잎 바닥을 다시 자르고 잎을 부드럽게 굴립니다.

그런 다음 삼출물 수집을 위해 20밀리몰 칼륨 EDTA가 들어 있는 반응 튜브 중 하나에 압연된 잎을 부드럽게 삽입합니다. 어두운 선에서 젖은 종이 타월로 큰 얕은 접시의 바닥. 잎으로 채워진 반응 튜브가 있는 랙을 접시에 놓고 통기용 슬릿이 있는 검은색 비닐 봉지에 넣습니다.

그런 다음 삼출물 수집을 위해 전체 설정을 캐비닛에 넣으십시오. 밝은 선에서 투명한 플렉시 글라스 용기의 바닥을 젖은 종이 타월로 그립니다. 잎이 채워진 반응 튜브가 있는 랙을 용기에 놓고 닫습니다.

용기에서 랙을 제거한 후 1시간 후에 반응 튜브에서 잎을 꺼냅니다. 증류수로 잎을 철저히 씻어 EDTA를 모두 제거합니다. 즉시 잎을 밀리포어 물이 들어 있는 반응 튜브로 옮기고 가습 용기에서 랙을 제거한 후 삼출물을 채취하기 위해 가습 용기에 다시 넣습니다.

5-8시간 후, 튜브에서 잎을 꺼낸 다음 액체 질소에 동결된 유출물을 섭씨 영하 80도의 냉동고에 보관합니다. 다음 날 추가 분석을 위해 지질 분석을 준비하기 위해 샘플을 해동합니다. 그런 다음 2-3개의 샘플을 당겨 결합된 용액에 동일한 양의 클로로포름과 메탄올을 첨가합니다.

몇 초 동안 혼합물을 소용돌이치십시오. 다음으로, 400gs에서 4분 동안 샘플을 원심분리합니다. 완료되면 상상과 분할을 3회 더 반복한 후 유리관에서 하단 유기상을 수집하고 결합된 유기상을 질소 흐름에서 건조하고 박층 크로마토그래피 및 LCMS 분석에 제출합니다.

이 방법을 사용하면 충분한 펨 삼출물을 수확하여 펨 국소 단백질과 발달 또는 스트레스에 대한 반응으로 그 수준의 변화를 식별할 수 있습니다. 경우에 따라 연구자들은 단백질의 분해를 방지하기 위해 proteinase 억제제를 사용하기를 원할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 단백질의 함량은 매우 낮지만 단백질의 수준은 후속 단백질체학 실험을 위해 충분히 높습니다.

LCMS를 사용하거나 웨스턴 블롯 분석을 위해 큐커빗의 발견은 STEM의 절단이 수분 잠재력 균형의 붕괴로 이어지고 이후 알라스트에서 물과 가능한 오염 물질의 유입으로 이어진다는 것을 시사합니다. 그러나 1시간에서 8시간 사이의 시간 동안의 채취는 유동 M 단백질 프로파일 및 구성 InOpSys에 영향을 미치지 않습니다. 수집된 단백질의 양과 발견되는 단백질의 패턴은 종과 처리에 따라 다릅니다.

결과적으로 단백질 신호를 시각화, 식별 및 추적할 수 있습니다.mRNA 및 microRNA는 또한 이 방법으로 플롬 삼출물에서 식별할 수 있습니다. 그러나 MR의 분해를 방지하기 위해서는 RNA 억제제에 의한 치료가 필요합니다. 확장된 삼출 시간 동안의 NA.

C 원소에는 기능적 엽록체가 포함되어 있지 않기 때문에 루비, 작거나 큰 소단위 mRNA를 음성 대조군으로 사용할 수 있으며 유비퀴틴 접합 효소와 같은 알려진 pH 독감 m 국소 mRNA를 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 당 또는 작은 대사 산물은 GCMS 또는 LCMS를 사용하여 분석할 수 있습니다. phem 삼출물은 거의 모든 해당작용 경로를 포함하여 많은 수의 기능성 효소를 함유하고 있다는 점을 언급해야 합니다.

따라서 여러 시점을 사용하면 삼출액 수집 중 대사 과정이 드러날 수 있습니다. 모든 삼출물에서 자당은 가장 풍부한 대사 산물입니다. 이것은 한 시간 동안 수집 한 후에 가장 분명합니다.

그러나 5 시간 후에는 자당 대 과당 비율이 약간 감소합니다. 동일한 삼출물을 1시간 동안 채취한 다음 추가로 4시간 동안 벤치에 방치하면 자당 대 과당 비율이 훨씬 더 크게 감소합니다. phem 삼출물에서의 활성 효소가 실온에서 자당의 분해를 유도한다는 것을 시사한다.

또한, 5시간 동안 연속적으로 채취한 결과 자당 대 과당 비율이 약간 감소하는 것만을 나타낸다는 사실은 동반 세포에서 바다 원소로의 분자 로딩 및 수송이 시스템이 활력을 잃을 때까지 삼출 중에 계속될 수 있다는 발견과 일치합니다. phem 삼출물의 지질과 더 나아가 장거리 지질 신호는 식물 과학에서 상당히 최근에 관심을 갖게 된 분야입니다. 소수성 특성으로 인해 지질은 낮은 농도로만 존재하며 가용화를 위해 다른 분자에 결합될 수 있습니다.

그러나 EDTA를 통한 삼출은 여러 식물 종의 흐름과 지질을 시각화하고 식별할 수 있는 충분한 물질을 수집할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 박층 크로마토그래피를 사용하여 여러 지질 종을 분리할 수 있습니다. LCMS를 사용하면 다양한 지질 종을 식별하고 다양한 유전자형 또는 치료법의 지질 프로필 내 변화를 모니터링할 수 있습니다.

이를 통해 식물 발달 및 스트레스 반응 중 지질의 역할을 연구할 수 있습니다. 일단 숙달되면 이 기술을 수행할 수 있으며 제대로 수행하면 3시간 이내에 수행할 수 있습니다. 그러나 대부분의 샘플의 경우 5-8시간의 수집 시간을 제안합니다.

이 경우 이른 아침에 잎 수확을 시작하는 것이 좋습니다. 이 절차는 다른 식물에 대해 수정될 수 있으며 새로운 유동 화합물의 발견 또는 확인으로 이어질 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 EDTA를 제거하기 위해 첫 번째 시간 후에 PDL을 철저히 관찰하고 다른 세포의 내용물로 인한 오염을 방지하기 위해 잎을 짜지 않도록 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

또한 장갑을 착용하면 피부에서 유입될 수 있는 오염 물질로부터 검체를 보호할 수 있습니다.오염을 방지하려면 단백질 RNA 또는 대사 산물 검체에 적절한 대조군을 사용하십시오. 제안된 컨트롤은 텍스트 프로토콜에 나열되어 있습니다. 이 방법을 통해 우리는 식물 흐름의 구성에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있었습니다.

우리는 삼출물 형태 내에서 여러 지질을 확인할 수 있었는데, 이는 바닥의 수성 환경에서는 예상되지 않았습니다. 이로 인해 당사와 다른 사람들은 장거리 지질 신호전달의 개념을 도입하게 되었으며, 이는 이제 흥미로운 새로운 임플란트 분야 연구로 발전했습니다.