Name: 유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 학습하세요 유도성 프로모터를 이용한 과도 형질도입으로 이온 채널 발현을 정밀 제어하는 방법을. TREX 293 세포에서 신속하고 재현성 높은 실험 결과를 얻을 수 있습니다.

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이 작품은 (AP에) 이스라엘 과학 재단 [보조금 12분의 1,721, 12분의 1,368, 및 16분의 1,444]에 의해 지원되었다. AP는 Brettler 센터와 데이비드 R. 블룸 센터, 약학 대학, 예루살렘의 히브리 대학과 연관되어있다.

1. 벡터의 Repressible 사이트에 관심의 유전자를 결찰 <ol><li> / TO 같은 pcDNA5 / FRT / TO 또는 pcDNA4로 유도 벡터를 얻습니다. </li><li> 실리 DNA 분석 소프트웨어 (4)에 의해 또한 선택한 벡터의 여러 복제 사이트에 등장 유전자의 중간에 잠재적으로 취약 제한 사이트에 대한 관심의 유전자를 분석 할 수 있습니다. </li><li> 사용하여 표준 오버랩 PCR 기법 4 (목적 유전자에서 발견되지 않는) 선택된 두 개의 제한 효소 인식 부위로 관심의 유전자의 개시 코돈 앞에 삽입 제, 및 종결 코돈 이후의 두번째 측면에. </li><li> 벡터 모두 소화 자체를 방지하기 위해 30 분 동안 벡터 반응 한 부 송아지 창자의 포스 파타 아제 (CIP)을 첨가하여 한 시간 동안 효소 &quot;가공 온도에서, (단계 120에서 선택된) 제한 효소로 삽입 결찰. </li><li>1 % 아가 로스 겔상에서 분해 된 DNA를 전기로드 (9)에 의해 절단 된 부분을 분리한다. </li><li> UV 광을 이용하여, 블레이드 벡터 원하는 세그먼트를 함유하는 겔 조각을 절단하여 라이 게이션 될 삽입한다. </li><li> (상용 가능한 DNA 추출 키트를 사용하여) 아가로 오스 겔 조각에서 DNA 세그먼트를 추출하고 260 nm에서 분광 광도계에 의한 최종 농도를 측정한다. </li><li> 실온에서 20 분 동안 T4 리가 아제 효소를 이용하여 유도 선택된 벡터에 목적 유전자를 결찰. 인서트 한 몰비 : 벡터 삽입은 벡터로 결찰 확률을 높이기 위해, 3을 사용한다. 제어를 위해 만 벡터를 포함하는 연결 반응을 준비합니다. </li><li> 세균 변환의 경우, 50 μL 유능한 대장균에 혼자 벡터 및 벡터 + 유전자의 10 NG를 추가합니다. 42 ° C 45 초 인큐베이션 30 분 동안 얼음에서 인큐베이션 튜브. 즉시 다시 배치2 분 동안 얼음에 500 μL LB 배지에 형질 전환 된 박테리아를 옮긴다. 220 rpm으로 교반하면서 37 ℃에서 1 시간 동안 품어. </li><li> 성공적으로 형질 전환 된 박테리아의 선택은 적절한 항생제를 포함하는 제조 된 LB 아가 플레이트 (1.9에 기술 된 바와 같이) 각각의 반응 플레이트 100 μL (예를 들어, 100 μg의 / ㎖ 암피실린 pCDNA4 / TR을 사용하는 경우). </li><li> 37 ° C에서 하룻밤 성장하도록 허용합니다. 플레이트를 단단히 플라스틱 파라핀 필름을 배치하여 최대 2 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 10 μL 팁을 사용하여 개별 식민지를 들어 올리고, 220 rpm으로 교반하면서 37 ° C에서 + 항생제 중 3 mL의 LB에서 하룻밤 성장 할 수 있습니다. 관심의 DNA와 박테리아가 동결 될 수있다 (-20 ° C) 11,000 XG에서 LB와 박테리아를 원심 분리하고 상층 액을 흡입에 의한 단기간의 운용합니다. 장기 보관은 -80 ° C에서 글리세롤 주식과 박테리아를 동결해야합니다. </li><li> throu DNA를 추출GH 미니 사전, 260 nm의 5에서 분광 광도계에 의한 최종 농도를 측정한다. </li><li> 정제 된 구조 (4)를 시퀀싱하여 관심의 유전자를 성공적으로 삽입을 확인합니다. 대안 적으로, 제한 효소 절단 세그먼트를 분리하여 이들의 존재를 평가하기 위해 전기를 사용하여 효소 길이만큼 구조체의 진단 소화 또한이 단부 (4)에 이용 될 수있다. </li></ol> TetR을 표현 2. 배양 세포주 <ol><li> 자신의 게놈 DNA에 통합 구정 리프레 플라스미드를 형질 세포 배양 라인을 얻습니다. 여기서 프로토콜은 예를 들어 pcDNA6 / TR 플라스미드를 품고 인간 배아 신장 293T 세포 (HEK-293T)를 사용하여 기록됩니다. </li><li> 둘 베코의 수정 이글스 중간 (DMEM)와 100mm 조직 배양 접시에 씨앗 세포는 10 % FBS와 보충, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 2 mM의 L- 글루타민, 25 mM의 HEPES, (이하 : 전체 DMEM)의 pH 7.3와 O를 품다 37에서 / N# 176; C, 5 % CO 2. 세포와 모든 작업은 무균 조건에서 생물학적 후드에서 수행해야합니다. </li><li> , 테트 리프레 서 유전자의 발현을 유지 배지를 흡인 5 μg의 / ㎖의 블라스트 보충 된 완전 DMEM으로 교체하기 위하여. 37 ° C와 5 % CO 2에서 세포를 품어. </li><li> 세포가 80에 도달하면 - 90 % 포화 상태, 배지를 흡인하고 부드럽게 (칼슘 및 마그네슘)없이 DPBS 두 번 세포를 씻어 37 ℃로 가온. </li><li> 부드럽게, 기계적 손상을 초래하지 않고 세포를 DMEM 리프트는 0.05 % 트립신을 함유하는 배양액을 부화하기 위해 1.5 분 동안 37 ℃로 가온. </li><li> 전체 DMEM 동량 트립신 작용을 차단. 부드럽게 피펫 아래로 셀을 들어 올려 멸균 튜브로 전송하기 위해서입니다. </li><li> 5 분 동안 200 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 대기음 1 mL의 전체 DMEM로 교체합니다. 더까지 상하 세포 용액을 피펫하지세포 덩어리를 볼 수 있습니다. 개수와 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산한다. </li><li> 씨앗 1-2 × 10 5 μg의 / ML의 블라스트와 12 mL의 전체 DMEM을 포함하는 100mm 조직 배양 접시에 6 셀. 그들은 90 %의 포화 상태에 도달으로 일주일에 두 번 세포를 분할합니다. </li></ol> 3. 세포로 관심의 플라스미드 형질 감염 <ol><li> 0.9 mL의 전체 DMEM로 제조 된 12- 웰 플레이트 웰에 상기 전사 셀 바와 같이 분할 세포의 방법과 동일한 방법을 사용하여, 충분한 50 % 합류 (~ 200,000 세포)를 확인하고, CO 2, 37 ℃에서 밤새 배양 부란기. </li><li> pcDNA4 함께 형질 감염 혼합물을 제조 / 관심의 유전자를 포함하기 위해, 불활성 플라스미드를 최종 부피 100 μL하기 위해 (필요한 경우) 1 μg의 3 μL 지질 형질 감염 시약과 DMEM에 총 DNA 량을 가지고있다. 다른 단백질은 다른 효율 표현으로 사용되는 플라스미드 DNA의 최적 량은 광범위하게 변화한다. 차기rophysiological 실험은 성공적으로 형질 4를 받아야 세포를 시각화하기 위해 형질 전환 칵테일 포유 동물 발현 플라스미드에서 EGFP를 포함한다. </li><li> 30 분 동안 RT에서 형질 전환 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 12 웰 플레이트에 도금 세포에 드롭 현명 형질 전환 혼합물을 피펫 팅에 의해 세포를 형질과 DNA 및 형질 전환 시약의 균일 한 분산을 보장하기 위해 적극적으로 판 바위. 세포를 형질 ~시의 80 % 융합 성이어야한다. </li><li> 37 ° C에서 형질 감염된 세포 O / N을 품어 5 % CO 2. </li><li> 세포가 성공적으로 전기 생리학을 수행하는 경우 다음과 같은 아침 UV 램프에서 EGFP의 형광 신호를 관찰하여 형질 전환 된 것을 확인합니다. </li></ol> 폴리 - D - 라이신 (PDL) 4. 도금 세포 Coverslips는 / 웰스 <ol><li> 70 % 이소 프로필 에탄올 용액으로하여 dousing 12mm 커버 슬립을 소독. 건조하고 하나의 coversl를 배치전기 생리 기록 24 웰 플레이트의 각 웰에 IP를. </li><li> 칼슘 촬상 챔버의 각 커버 슬립 또는 웰 상에 0.2 ㎎ / ㎖ 용액 PDL - 0.1의 용액을 피펫. </li><li> 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 30 분 동안 앉아 할 수 있습니다. </li><li> 각 세척 사이에 흡입, 세포 배양 등급을 두 번 증류수 (DDW)로 3 회 세척한다. 최종 세척 후, 완전히 건조 및 RT에 앉아 할 수 있습니다. </li><li> 전기 생리학의 경우, 37 ° C로 예열 500 μL 전체 DMEM과 각 웰에 포함 된 PDL 코팅 커버 슬립을 입력합니다. </li><li> 전술 한 바와 같이 형질 감염된 세포를 분할하는 방법과 동일한 방법을 수행한다. 전기 생리학 기록 각 PDL 코팅 커버 슬립의 중심까지 트립신 처리 및 차단, 전사 셀 (또는 약 30,000 세포)의 80 μL 다음 세포를 재현 탁 후에. 세포가 적어도 1.5 시간 동안 침전 또는 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 하룻밤 배양 할 수 있습니다. </li><li> 잘 각 PDL 코팅 된 칼슘 이미징의 중심에 세포의 칼슘 이미징 전송 및 장소 20 μL (약 20,000 세포)를 참조하십시오. 세포가 적어도 30 분 동안 정착 및 각 웰에 180 μL에게 전체 DMEM을 추가 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 유도 유전자 발현 <ol><li> 제조업체의 지시에 따라 DDW 1 ㎎ / ㎖의 독시사이클린 스톡 용액을 제조 하였다. 최대 3 주 동안 4 ° C에서 빛으로부터 보호 원액을 유지합니다. 장기 저장을 위해 -20 ℃에서 독시사이클린 원액을 유지한다. </li><li> 전체 DMEM에 신선한 2 μg의 / ㎖ (전기 생리학) 또는 3 μg의 / ㎖ (칼슘 이미징) 독시사이클린 솔루션을 준비하고 37 ℃로 따뜻하게. </li><li> 전기 생리 녹음, 피펫을 위해 각 / ML의 독시 싸이클린 솔루션 2 μg의 500 μL 잘 1 μg의 / ML의 독시 싸이클린의 최종 농도를 확인합니다. 칼슘 이미징 최종 집중하고 있도록 각 웰에 3 μg의 / ㎖의 독시사이클린 용액 100 μL를 추가1 μg의 / ML의 독시 싸이클린의 기. 유도의 시간을 기록합니다. </li><li> 원하는 37 ° C에서 유도 시간의 양을 5 % CO 2 품어. </li></ol> 단백질 발현 6. 캘리브레이션 타임 라인 <ol><li> 칼슘 이미징 5, 10을 통해 단백질 발현을 보정 <ol><li> 링거액 (140 mM의 염화나트륨, 2.5 밀리미터의 KCl, 1.8 mM의 염화칼슘 2, 2 mM의 NaOH로 7.4로 조정 황산, 20 mM의 HEPES, 산도)과 따뜻한 37 °의 C를 준비합니다. </li><li> 링거액에 채널 작용제의 농도를 포화 준비합니다. 세포와 세포 외 용액을 함유하는 칼슘 촬상 챔버에 첨가 될 때 효능 제의 양이 희석되기 때문에, 작용제의 원하는 최종 농도의 양을 두 배로. 이것은 또한 제어 할 각 웰 임계 목욕 액의 양을 만든다. </li><li> D의 비 이온 F-127의 20 % W / V의 용액을 제조MSO. 비이 온성 F-127을 용해 될 때까지 40 ° C의 용액을 가열한다. RT에서 비이 온성 F-127 용액을 저장하고 사용하기 전에 40 ℃로 가온. 비 이온 F-127 등의 Fura-2 수용액 형광 이온 지표 아세 (AM) 에스테르를 분산시키는 데 사용된다. </li><li> 대기음 매체와의 Fura-오전 2시 로딩 솔루션으로 교체 (2 보충 링거액 - 3 μM의 Fura - 오전 2시, 0.02 ㎎ / ㎖ 비 이온 F-127, 10 mM의 D-포도당). </li><li> 어둠 속에서 실온에서 60 분 동안 품어. </li><li> 링거 + 10 mM의 D-포도당 용액과 대기음은 Fura - 오전 2시 솔루션 및 세척 세포는 세포 외 염료를 제거합니다. 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 물론 각 200 μL 링거 + 10 mM의 D-포도당 용액을두고 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 품어. </li><li> 현미경 코 조각 위의 무대에서 챔버를 놓고 홀더로 고정합니다. </li><li> 램프, 카메라와 현미경 켜고 510 nm의 WAV에서 방출을 감지의 Fura-2 필터를 선택elength. </li><li> 원하는 배율을 조정하고 선택한 필드에서 셀을 초점을 맞추고있다. </li><li> 어둠 속에서, 배경 등을 빼고 노출 시간을 설정합니다. </li><li> 340 및 380 nm의 파장에서 흥미로운 그들에 의해의 Fura-2로드 된 세포의 원하는 속도 및 기록 형광 응답에서 설정 사진 샘플링. 380분의 340 신호의 비율은 TRPV1의 활동에 따라서 또한 세포 내 칼슘 이온 농도 표시하고 있습니다. </li><li> TRPV1의 발현 수준을 평가하기 위하여 1 μM의 캡사이신의 최종 포화 농도를 만들기 위해 피펫 200 μL 링거액 2 μM의 캡사이신을 추가한다. </li><li> 유도 시간에 따라 TRPV1 응답을 분석하고 관심있는 단백질 프로토콜을 결정합니다. </li></ol></li><li> 패치 클램프 기술 (4) (11)의 전 세포 구성을 사용하여 이종 시스템에서 단백질 발현 조절. <ol><li> t 준비그 NaOH로 pH를 7.4로 조정 (㎜) 140의 NaCl, 2.3 KCl을 2 황산 5 HEPES, 5 2- (N- 모르 폴리 노) 에탄 설 폰산 (MES)의 용액을 목욕. </li><li> 세포 외 용액 채널 작용제의 농도를 포화 준비한다. </li><li> 4 MΩ - 2의 저항에 내경 1.10 mm의 (ID) 및 화재 - 폴란드어 유리 전극을 당기십시오. </li><li> (MM) (130)의 KCl, 4 염화나트륨의 피펫 솔루션을 준비 황산 2, 0.5 염화칼슘은 2, 1 EGTA, 10 HEPES는 KOH으로 pH 7.2로 조정. 사용 전에 용액을 피펫 필터. 각 실험하기 전에, 하나, 화재 - 광택 유리 피펫 다시 적어도 분 동안 피펫 용액에 끝을 잠수하여 작성하고 같은 피펫 솔루션 가득 주사기와 용융 연신 팁을 사용하여 채워집니다. </li><li> 부드럽게 실온에서 약 2 mL의 목욕 솔루션으로 가득 35mm 플라스틱 페트리 접시에 우물에서 도금 세포 하나 PDL 코팅 커버 슬립을 들어 올립니다. EP에에서 관찰I-형광 현미경. </li><li> epifluorescent 현미경으로 가시화로 제조 된 커버 슬립에, EGFP 양성 세포를 찾아 시각화 분야의 중심으로 이동합니다. </li><li> 미세 조작기의 피펫 홀더에 충전 된 피펫을 부착하고, 세포 피펫 용액의 오염을 피하기 위해 시스템에 양압 소량 주입. 바로 GFP 위로 내려 - 양성 세포를 적절한 저항을 검사. </li><li> 피펫 셀 접촉으로 유리 피펫 및 세포막 사이 GΩ 밀봉을 생성하기 위하여 부압 소량 적용된다. </li><li> 흡입 짧은, 예리한 펄스 피펫은 세포의 세포 내 내용물과 접촉 할 수 있도록, 세포막을 파괴. </li><li> 각각 5 kHz 및 0.5α - 전체 셀 앰프 모드를 전환하고 1로 베셀 필터 출력 게인을 낮 춥니 다. </li><li> 포화에 대한 전류 반응을 녹음전압 램프 또는 간극없는 프로토콜을 이용하여 채널 작용제의 농도. </li><li> 발현 효율이 다른 단백질 사이에서 변경되기 때문에, 다른 길이의 유도 시간을 사용하여 기록을 반복한다. </li></ol></li><li> 단일 채널 녹음 4 이상적 유도 시간을 결정. <ol><li> 피펫 용액으로서, NaOH로 pH를 7.4로 조정 (MM) (150) 나 글루코 네이트, 염화나트륨 (15), EGTA (5), 10 HEPES, 용액을 준비한다. 목욕 솔루션의 단계 6.2.1에서 솔루션을 사용합니다. </li><li> ID 0.86 mm 유리 피펫 (10)의 저항에 불을 연마하여 전체 세포의 절차를 반복 - 12 MΩ 및 MV를 -40 잠재력을 보유 설정합니다. </li><li> 이전에 기술과 멤브레인 파열로 막에 도장을 만듭니다. </li><li> 미세 조작기를 사용하여, 멀리 세포에서 막 패치 피펫을 들어 올립니다. </li><li> 막 패치를 포함하는 피펫에 바로 옆에 재관류 시스템을 배치합니다. </li><li> 낮은 t각각 5 kHz 및 10α - 그는 2 필터와 출력 게인을 베셀. </li><li> 패치가 상기 응답에 따라 하나 이상의 채널을 포함하는 경우, 막에 패치 작용제의 농도를 포화 평가 관류. </li><li> 성공적으로 셀에인가되는 유도 시간에 대해 기록 된 단일 채널 패치의 수를 분석한다. 원하는 결과에 따라 유도 시간을 조정한다. </li></ol></li></ol>

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형질 발현 일관성과 안정성을 향상시키기 위해 여러 가지 변형 단백질 발현 연구에 널리 사용되는 프로토콜이다. 일시적 형질 전환 시약은 쉽고 간단한 관심 세포 단백질은 형질 감염 시간 내지 밤새 시간 이내에 분석 할 수있는 프로토콜을 사용하도록 제안한다. 분석의 모드는 전기 생리학 2의 단일 채널 녹음 등의 단백질 발현의 일관된 수준을 필요로하는 경우 불행하게도이 방법은 예측할 수 없습니다. 대안 적으로, 테트라 사이클린 repressible 발현 시스템에서 안정적인 세포주 관심 12 단백질의 발현 수준을 조절하는 방법을 제공하도록 개발되었다. 이 방법은 독시사이클린과 같은 테트라 사이클린 유도 보조제의 도입과 함께 배양 된 모든 셀의 일관된 발현을 제공한다. 이 단백질 수준의 일관되고 정확한 제어 할 수 있지만, t단백질 8의 다양한 연구 때 그가 안정한 세포주를 확립에 이동 시간과 노력이 불편하고 ...

이종 시스템을 발현하는 세포의 기능 (1)의 다수의 연구에 가장 널리 사용되는 기술 중 하나이다. 낮은 내인성 단백질 프로파일, 최소한의 유지 보수 요구 사항, 안정적인 성장, 외국 DNA를 가지고 표현하는 능력은 인간 배아 신장 (HEK293) 및 생물학 연구 2, 3과 거의 필수 중국어 햄스터 난소 (CHO)와 같은 세포 라인을 만들었습니다. 이종 시스템을 사용하는 연구 분야는 막 단백질, 세포 내 신호 및 효소 활성을 포함한다. 세포 내로 외래 DNA의 형질 전환에 따라, 분석의 많은 다른 형태의 전기 생리학, 비율 적 칼슘 이미징, 웨스턴 블롯 등 4, 5를 포함하여 수행 될 수있다. 이종 발현 시스템에 대한 잠재적 인 응용 프로그램의 다양한에 많은 differe 인해NT 시약 및 산물이 세포 및 자질 6을 이용하도록 개발되었다. 일시적 또는 영구적으로 외래 단백질을 연구하는 세포로 외국 DNA를 통합 DNA 전달 시스템 생물학 연구를위한 가장 인기있는 유용한 도구 중 하나가되고있다. 구체적으로는, 세포에 일시적으로 형질 DNA 널리 비교적 짧은 시간 및 재료를 필요로하는 단순 직진 처리로서 사용된다. 또한, 형질 감염을 겪는 세포들의 성공률 7 높다. 이 기술은 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 마커 유전자와 결합 및 칼슘 이미징 및 전기 생리학 (5)와 같은 다양한 기술을 사용할 수있는 경우 매우 안정하다. 불행하게도하지만, 일시적으로 숙주 세포에 DNA를 발현하는 것은 셀 당 발현 수준이 신뢰할 그 이상으로, 몇 가지 주요 함정이 함께 제공됩니다. 플라스미드 DNA의 카피 수는 U 촬영셀 당 p는 따라서 개별 실험의 표현은 크게 2 다를 수 있습니다, 제어 할 수없는 것입니다. 어느 생리적 조건을 복제하려고하거나 정확한 데이터 수집 기술을 수행 할 때 이러한 문제가 현저해진다. 단일 보장 관심의 유전자와 같은 테트라 사이클린 리프레 발현 시스템과 같은 유도 성 프로모터의 엄격한 제어하에 세포의 게놈 내로 삽입 될 수있는, 안정된 형질 감염 프로토콜이 설계되어 전술 한 합병증에 대한 해결책으로서, 플라스미드의 카피가 각 세포의 게놈에 통합 만 독시사이클린의 존재 하에서, 예를 들면, 전사기구의 유도 후 발현된다. 이 불일치 단백질 발현 수준 장애를 해결하지만,이 방법은 일시적 형질 빠르고 비교적 간단한 프로토콜의 편의를 잃는다. 안정적인 세포주를 수립하는 것은 whic 적어도 몇 주 소요H 하나는 단백질 발현을 유지하고 벡터의 통합을 위해 선택 솜씨 세포 콜로니를 성장 특정 항생제에 의해 설정된 사멸 곡선을 보정한다. 전반적으로이 낮은 성공률 8 훨씬 많은 시간과 노력이 필요. 여기서는 어떤 유도 세포주에서의 발현 수준을 제어하기위한 간단하고 효과적인 방법을 제공하는 대중적인 형질 전환 방법 중 모두의 장점을 그리는 중간 프로토콜을 소개한다. 유도 TET 시스템 셀을 유지하면서, 우리는 일시적 동성 리프레 시스템과 결합 할 수있는 벡터에 라이 게이션 관심 우리 유전자 일시적 수용체 전위 양이온 채널 아과의 V 부재 (1) (TRPV1)를 형질. 이러한 방식으로, 유전자를 발현하기 시작하지 않고 세포 내로 도입 될 수있다. 독시사이클린 만의 첨가로 유전자 단백질 EXPR의 레벨을 보정 할 수 있도록 허락 표현하기 시작 않는다생리적 조건에서 관찰되는 기술 또는 레벨에 따라 ession. 우리 프로토콜은 또한 안정적으로 발현하는 세포주를 생성과 관련된 긴 합병증을 피할 수있다. 우리는에서 칼슘 이미징에서 TRPV1 활성화의 변화 수준을 보여주는 것으로 시작되지 않은 유도 유도하는 방법과 세포 내 칼슘 농도의 증가는 상관 관계가 4 시간을 통해. 그런 다음 유도 시간이 증가함에 따라 증가하는 전류를 나타내는 패치 클램프 기술의 전체 셀 구성 프로토콜 중복. 마지막으로, 단일 채널 전기 생리학 기록의 예를 제시하고, 단백질의 각각의 단위에 기초하여 정확한 데이터 수집을 찾을 때이 기술은 발현 조절에 특히 유용하다 보여준다. 따라서 실험 제공 MO과 조건을 제어하는 ​​방법을 제공하고, 긴 세포 배양 합병증을 피하면서 우리 프로토콜을 통해, 우리는 이종 시스템에서 단백질 발현을 조절하기위한 편리한 방법을 제공한다복제 결과를 다시.

<table><tbody><tr><td>pcDNA&무역; 4/TO 포유류 발현 벡터</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102020</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&trade; 5/TO 포유류 발현 벡터</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V103320</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick PCR 정제 키트</td><td>Invitrogen</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>Swift&trade; &nbsp; MaxPro 열 순환기</td><td>Esco&nbsp;</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>제한 효소</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ER0501</td><td></td></tr><tr><td>아가로스&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PureLink 퀵 젤 추출 키트</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>One Shot&reg; TOP10 화학적 역량 E. coli</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>C404006&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>암피실린(나트륨), USP 등급</td><td>Gold Bio</td><td>A-301-5</td><td></td></tr><tr><td>미생물학용 트립톤</td><td>Merck</td><td>6.19305E+13</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD 전세계</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>SIF6000R 인큐베이션 셰이커</td><td>LAB COMPANION</td><td>45H118</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin&reg; 플라스미드</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>MS 300V 전원 공급 장치</td><td>주요 과학</td><td>MP-300V</td><td></td></tr><tr><td>Owl&trade; 이지캐스트&트레이드; B1A 미니 겔 전기영동 시스템</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>T-REx&trade;-293 세포주</td><td>Invitrogen</td><td>R710-07</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x), 액체 (고포도당)</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF&reg;</td><td>NEB</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>ApaI</td><td>NEB</td><td>R0114S</td><td></td></tr><tr><td>컷스마트&reg; 버퍼</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&trade; 6/TR&nbsp; 포유류 발현 벡터</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102520</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), 적격, EU 승인, 남미 원산지</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanyl-L-Glutamine (안정 글루타민) (200 mM)</td><td>생물학 산업</td><td>03-022-1B</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&trade; 150i CO2 인큐베이터</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>51026406</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage&trade; 클래스 II 생물 안전 캐비닛</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidine S 염산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS) 변형, 염화칼슘 및 염화마그네슘 없음</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA(0.05%), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Double Neubauer Ruled Metallized Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 환원 혈청 매체</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TransIT&reg;- LT1 트랜스펙션 시약</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립, #1 두께, 12mm 지름의 라운드</td><td>니텔 유리</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>BioCoat&trade; Poly-D-Lysine (PDL)</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>물, 세포 배양 등급</td><td>생물학 산업</td><td>03-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>독시사이클린 하이클레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM 에스테르</td><td>Biotium</td><td>BTM-50034</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&reg; F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 Well</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>(E)-Capsaicin</td><td>Tocris</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX70 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4 파장 스위처</td><td>Sutter Instruments</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>EXi Blue 형광 현미경 카메라</td><td>QImaging</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>MetaFluor 형광 비율 이미징 소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>얇은 벽 붕규산 튜브</td><td>셔터 기기</td><td>B150-110-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>표준 벽 붕규산 튜브</td><td>셔터 기기</td><td>B150-86-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 무수</td><td>시그마 알드리치</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>P1000 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MF-900 Microforge</td><td>NARISHIGE</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>ValveBank 관류 시스템</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata&reg; 1440A 저잡음 데이터 수집 시스템</td><td>분자 장치</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B 증폭기</td><td>분자 장치</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.6 소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td></td></tr></tbody></table>

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

형질는 셀에 외국 핵산의 전달, 단백질 연구에 강력한 도구입니다. 이 방법으로, 이온 채널은 전기 생리 학적 분석, 생화학 적 특성화 돌연변이 연구 및 세포 과정에 미치는 영향을 조사 할 수있다. 과도 형질은 단백질이 일 몇 시간 내에 분석을 위해 사용할 수있는 간단한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 비교적 간단하고 시간 효율적인 프로토콜을 제공하지만, 중요한 요소 중 하나가 분석하기에 적합한 생리 학적 관련성 레벨 또는 레벨 관심의 유전자의 발현을 교정한다. 이를 위해, 관심의 유전자의 발현을 조절하는 능력을 제공하는 여러 접근 방식이 등장했다. 여러 안정 세포 형질 감염 프로토콜 영구적 테트라 사이클린 조절 transcrip의 조절하에 세포의 게놈으로 관심의 유전자를 도입하는 방법을 제공한다적인 활성화. 이 기술은 안정적인 발현 수준을 생산하고 있지만, 관심있는 각각의 유전자는 살인 곡선의 교정, 세포 콜로니의 선택, 전체 더 많은 자원을 포함하여 숙련 된 작업의 몇 주를 필요로한다. 여기에서는, 이온 채널 분석에 필수적인 제어 된 방식으로 단백질을 발현 할 수있는 효율적인 방법으로 유도 시스템의 일시적 수용체 전위 양이온 채널 아과의 V 부재 (1) (TRPV1) 유전자의 일시적인 형질 감염을 사용하는 프로토콜을 제시한다. 우리는이 기술을 이용하여, 우리는 하나의 형질 전환과 데이터 수집의 각 유형에 필요한 제어 채널 레벨 칼슘 이미징, 전체 셀 및 단일 채널 분석을 수행 할 수 있다는 것을 보여준다. 전반적으로, 이는 이온 채널 구조 및 기능을 연구하기 위해 사용될 수있는 복제 기술을 제공한다.

신속하게 유도 표현 모델을 생성하기 위해 테트라 사이클린 리프레 서 단백질 (TR)을 표현하는 HEK293 세포를 사용했다 (예를 들면, T-REX-293) 및 CMV 프로모터 및 다중 클로닝 부위 사이의 테트라 사이클린 오퍼레이터 서열 (TETO)을 함유 벡터 (예를 들어, pcDNA4 / TO). TREX-293 세포로 형질 전환 된 경우 TR은 Teto의 결합으로, pcDNA4 / TO에 대한 관심의 유전자의 발현이 억제된다. 배지에 독시사이클린 추가 따라서 형질 전환 단백질의 발현을 허용 TR-TETO 상호 작용을 방지한다. 래트 TRPV1 (rTRPV1)의 발현을 조절하려면 먼저, 상술 한 프로토콜을 이용하여 벡터에 / A pcDNA4이 채널의 유전자를 삽입했다. 다음으로, T-REX-293 세포는 프로토콜의 지점 3의 단계에 따라 플라스미드 /를 rTRPV1- pcDNA4로 형질했다. 형질 감염 후, rTRPV1 식 (독시사이...

이종 발현 시스템을 통해 공부하는 이온 채널은 생물 의학 연구의 핵심 기술이되고있다. 이 논문에서는, 유도 성 프로모터의 조절하에 일시적인 형질 감염을 수행함으로써 엄격하게 제어 이온 채널 표현을 달성하는 시간 효율적인 방법을 제안한다.

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

본 절차의 전반적인 목표는 장시간의 세포 배양으로 인한 복잡한 문제를 피하면서 이종 시스템에서 이온 채널 발현을 제어할 수 있는 편리한 방법을 제공하는 것입니다. 이를 통해 실험 간의 조건을 제어하고 더욱 재현성 있는 결과를 생성할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 방법은 이온 채널 분야의 연구를 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다.약리학에서 채널 특성을 분석하는 것과 같은 사례가 있습니다. 기존 방법들은 복잡하거나 단백질 발현이 일관되지 않은 경우가 많기 때문입니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 짧은 시간 내에 개별 실험에 맞게 최적화된 매우 다양한 단백질의 조절된 발현 수준을 달성할 수 있다는 점입니다.본 절차를 시작하려면, 50% 밀도를 형성할 수 있도록 웰당 0.9 mL의 완전 DMEM이 준비된 12-웰 플레이트에 TREX 293 세포를 옮깁니다. 그리고 CO2 배양기에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로 DMEM, 여기에 표시된 표적 유전자 TRPV1, 불활성 플라스미드 및 지질 transfection 시약으로 구성된 transfection 혼합물을 준비합니다.전기생리학 실험을 위해, 형질전환이 성공적으로 이루어진 세포를 시각화할 수 있도록 포유류 발현 플라스미드에 포함된 EGFP를 형질전환 칵테일에 추가합니다. 형질전환 혼합물을 상온에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 12-웰 플레이트에 배양된 세포 위에 형질전환 혼합물을 파이펫으로 한 방울씩 떨어뜨려 세포를 형질전환시킵니다.DNA와 트랜스펙션 시약이 균일하게 분산되도록 플레이트를 세게 흔들어 줍니다. 그 후, 트랜스펙션된 세포를 27 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 전기생리학 실험을 수행하는 경우 UV 램프 아래에서 EGFP의 형광 신호를 관찰하여 세포가 성공적으로 트랜스펙션되었는지 확인합니다.전기생리학 실험을 수행하는 경우, 12-웰 플레이트에서 세포를 500 µL의 완전 DMEM이 담긴 PDL 코팅 커버슬립으로 옮깁니다. 칼슘 이미징을 수행하는 경우, 약 20,000개의 세포를 PDL 코팅 칼슘 이미징 챔버에 분주합니다. 본 절차에서는 이중 증류수에 1 mg/mL 농도로 doxycycline 스톡 솔루션을 준비합니다.스톡 용액을 4°C에서 빛을 차단하여 최대 3주 동안 보관하십시오. 장기 보관 시에는 doxycycline 스톡 용액을 -20°C에서 보관하십시오. 그다음, 전체 DMEM에 신선한 doxycycline 용액을 조제하십시오.그리고 37 °C로 가온합니다. 전기생리학적 기록의 경우, 각 웰에 2 µg/mL 농도의 doxycycline 용액 500 µL를 피펫으로 분주하여 doxycycline의 최종 농도가 1 µg/mL가 되도록 합니다. 칼슘 이미징의 경우, 각 웰에 3 µg/mL 농도의 doxycycline 용액 100 µL를 첨가하여 doxycycline의 최종 농도가 1 µg/mL가 되도록 합니다.샘플을 37 °C, 5% CO2 조건에서 원하는 유도 시간 동안 배양하십시오. 칼슘 이미징을 통해 단백질 발현을 보정하려면, Ringer's solution을 준비하여 37 °C로 가온하십시오. 수용액 내의 Fura-2와 같은 형광 이온 지표인 AM esters의 분산을 돕기 위해, DMSO에 비이온성 F-127 용액을 준비하십시오.비이온성 F-127이 녹을 때까지 용액을 27 °C로 가열하십시오. 그 다음 비이온성 F-127 용액을 상온에서 보관하고, 사용 전에 다시 37 °C로 가온하십시오. 이후 Ringer's solution에 2~3 µM Fura-2 AM, 0.2 mg/mL 비이온성 F-127 및 10 mM D-glucose를 첨가하여 Fura-2 AM 로딩 용액을 준비하십시오.그런 다음 챔버 내 세포에서 배지를 흡입하여 제거하고 Fura-2 AM 로딩 용액으로 교체합니다. 세포를 상온의 암소에서 60분 동안 배양합니다. 이후 Fura-2 AM 용액을 흡입하여 제거합니다.그리고 Ringer's 및 10 millimolar D-glucose 용액으로 세포를 세척하여 세포 외 염료를 제거합니다. 각각에 200 microliters의 Ringer's 및 10 millimolar D-glucose 용액을 남깁니다. 그리고 암실 상태의 상온에서 30분 동안 배양합니다.30분 후, 챔버를 현미경 노즈피스 위 스테이지에 놓고 홀더로 고정합니다. 그런 다음, 최종 희망 농도에 맞춰 TRPV1 특이적 작용제인 capsaisin의 작동 농도를 계산하여 준비합니다. 다음으로 램프, 카메라 및 현미경의 전원을 켜고, 510 nanometer 파장에서의 방출을 검출하기 위해 Fura-2 필터를 선택합니다.현미경 조절 나사를 사용하여 원하는 배율로 조정하고 선택된 시야의 세포에 초점을 맞춥니다. 암실 상태에서 배경광을 제거하고 노출 시간을 설정합니다. 원하는 속도로 이미지 샘플링을 설정합니다.그다음, 340 nm 및 380 nm 파장으로 흥분시켜 Fura-2가 로딩된 세포의 형광 반응을 기록하기 시작합니다. 340 nm와 380 nm 신호의 비율은 세포 내 칼슘 농도의 지표이며, 따라서 TRPV1 활성의 지표가 됩니다. 이어서, TRPV1의 발현 수준을 평가하고 TRPV1 반응을 분석하기 위해, Ringer's solution 200 µL에 포함된 2 µM 캡사이신을 첨가하여 캡사이신의 최종 포화 농도를 1 µM로 만듭니다.단일 채널 기록을 위한 최적의 유도 시간을 결정하려면, 먼저 배스(bath) 용액과 피펫 용액을 준비하십시오. 그다음 저항이 10~12 MΩ이 되도록 화염 연마(fire-polish)한 유리 피펫을 준비하십시오. 대상 세포의 막에 씰(seal)을 형성하여 whole-cell 패치 클램프를 수행하십시오.그 후, 유지 전위를 -40 mV로 설정합니다. 그리고 음압을 가하여 막을 파열시킵니다. 그런 다음, 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 막 패치가 붙은 피펫을 세포에서 들어 올립니다.그런 다음 perfusion 시스템을 막 패치가 들어 있는 피펫 바로 옆에 배치합니다. Bessel 필터와 출력 이득을 각각 2~5 kHz 및 10 amps로 낮춥니다. 그 후, 포화 농도의 효능제를 막 패치에 perfusion 합니다.그런 다음, 세포에 적용한 유도 시간 대비 성공적으로 기록된 단일 채널 패치의 수를 분석하고, 원하는 결과에 따라 유도 시간을 조정합니다. 여기에는 capsaicin 처리 전후로 RTRPV1을 일시적으로 발현하는 TREX 293 세포의 의사 색상 이미지가 나와 있습니다. 또한, 여기에는 처리 및 형질전환된 TREX 293 세포에서 시간에 따른 세포 내 칼슘 농도의 상응하는 변화가 나타나 있습니다.각 그래프는 50개 세포의 평균값을 나타냅니다. TRPV1 기록에서 단일 채널 패치의 성공률은 유도 시간에 따라 달라집니다. 다음은 2시간 및 4시간 동안 유도한 후 RTRPV1을 일시적으로 발현하는 TREX 293 세포의 패치 전류 흔적입니다.이 그래프는 명시된 유도 시간 후 패치 내의 채널 수를 나타냅니다. 이 기술을 적절하게 수행하면, 형질전환 후 12시간 이내에 발현이 제어된 단백질의 분석이 가능합니다. 이 절차를 시도할 때는 서로 다른 단백질에 대해 형질전환 농도와 유도 시간을 표준화하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.이 영상을 시청한 후, 여러분은 선택한 이온에 대해 시간 효율적인 방식으로 조절 가능한 발현 시스템을 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

controllable-ion-channel-expression-through-inducible-transient

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

우리는 이온 채널의 기능에 대한 단일 지점에서 돌연변이의 효과를 연구하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

고효율을위한 신뢰할 수있는...

표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

출처: Berens, C. 외. 유도성 발현 시스템을 적용하여 박테리아 병원성 인자가 세포 내 신호 전달에 미치는 간섭을 연구합니다. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 박테리아 효과 단백질 CaeB가 숙주 세포자사멸 연쇄 반응을 방해하는 위치를 식별하기 위해 유도 발현 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 CaeB 발현 세포를 테트라사이클린 반응 시스템으로 형질전환하여 프로세포자사멸 유전자 발현을 유도하는 과정을 개괄하며, 이를 통해 연쇄 반응 내 교란 지점을 식별합니다.

박테리아 효과 단백질을 발현하는 세포로의 유도성 유전자 발현 시스템과의 형질전환

이 동영상은 관심 유전자와 조절 플라스미드를 포함하는 플라스미드로 transfection하여 배양된 세포에서 유전자 발현을 조절하는 방법을 설명합니다. 이 플라스미드의 발현은 테트라사이클린 또는 그 합성 유사체에 의해 제어될 수 있으므로 이 시스템은 조절 가능한 유전자 발현을 연구하는 데 유용한 모델입니다.

유도성 Tet-Off 조절 시스템: Tetracycline-Off 시스템을 사용하여 배양된 세포의 유전자 발현을 조절하는 In vitro 방법

여기에 설명된 방법은 anti-apoptotic bacterial effector 단백질의 활성을 해부하기 위해 정의된 단계에서 apoptotic signaling cascade를 유도하는 데 사용됩니다. 이 방법은 또한 pro-apoptotic 또는 독성 단백질의 유도성 발현 또는 다른 신호 경로와의 간섭을 해부하는 데 사용할 수 있습니다.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

속됨 부정맥은 종종 하나 이상의 이온 채널의 표면에 전달 변경 돌연변이에 의해 야기된다. 여기서는 TSA-201 세포에서 발현 된 재조합 이온 채널의 상대적 총 세포 표면 단백질 발현의 정량 분석을 제공하기 위해 유세포 적응.

유동 세포 계측법을 사용하여 재조합 이온 채널의 상대 셀 표면 및 전체 식의 결정

Nonlytic 곤충 세포 발현 시스템은 생산 세포 트래 피킹 / 제이션, 및 재조합 단백질의 기능 분석을 위해 충분히 활용된다. 여기서 우리는 상업적으로 이용 가능한 나비목 세포주에서 발현 벡터 및 후속 과도 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 내 형광 마커 단백질과 Bemisia의 담배가 루이의 아쿠아 포린의 공동 제이션 또한 제공된다.

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

여기, 선물이 transgene 식 tebufenozide 치료에 의해 pEUI(+) 단일 유전자 스위치를 사용 하 여 변조에 대 한 프로토콜.

Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한

여기 선물이 있는 어떤 단백질 수 수 조건부로 비활성화 역 그것의 지배적인 부정적인 돌연변이 버전 overexpressing에 의해 지배 부정적인 유도할 수 있는 시스템을 개발 하는 프로토콜.

유도할 수 있는 고 가역 지배-네거티브 (DN) 단백질 억제

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포유류 유전자 발현을 제어하기 위한 광유도 시스템의 신속한 최적화

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