유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

이 절차의 전반적인 목표는 이종 시스템에서 이온 채널 발현을 제어하는 편리한 방법을 제공하는 동시에 장시간의 세포 배양 합병증을 방지하는 것입니다. 따라서 실험 간의 조건을 제어하고 더 많은 반복 가능한 결과를 생성할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 방법은 이온 채널 분야의 연구를 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다.

약리학에서 채널 특성을 특성화하는 것과 같은. 현재 방법은 복잡하거나 일관되지 않은 단백질 발현을 보여주기 때문입니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 짧은 시간 내에 개별 실험에 맞게 조정된 다양한 단백질의 제어된 발현 수준을 달성할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 TREX 293 세포를 50% 농도를 생성하기 위해 웰당 0.9ml의 전체 DMEM으로 준비된 12웰 플레이트로 이동합니다. 그리고 CO2 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다. 다음으로, 여기에 나타난 관심 유전자인 DMEM, 불활성 플라스미드인 TRPV1 및 지질 형질주입 시약으로 구성된 형질주입 혼합물을 제조한다.

전기생리학적 실험의 경우, transfection을 성공적으로 수행하는 세포를 시각화하기 위해 transfection cocktail의 포유류 발현 플라스미드에 EGFP를 포함시킵니다. transfection 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음, transfection 혼합물을 12웰 플레이트의 도금된 세포에 적가하여 세포를 transfection합니다.

DNA와 transfection 시약의 균일한 분산을 보장하기 위해 플레이트를 세게 흔듭니다. 그 후, 형질주입된 세포를 섭씨 27도에서 밤새 배양합니다. 다음날 아침, 전기생리학을 수행하는 경우 UV 램프 아래에서 EGFP의 형광 신호를 관찰하여 세포가 성공적으로 transfection되었는지 확인합니다.

전기생리학을 수행하는 경우, 12웰 플레이트에서 PDL 코팅된 커버로 세포를 옮기면 500마이크로리터의 전체 DMEM이 미끄러집니다. 칼슘 이미징을 수행하는 경우, PDL에 코팅된 칼슘 이미징 챔버에 약 20, 000개의 세포를 발견하십시오. 이 절차에서는 이중 증류수에 1밀리리터당 1밀리그램의 독시사이클린 원액을 준비합니다.

최대 3주 동안 섭씨 4도의 빛으로부터 스톡 용액을 보호하십시오. 장기 보관을 위해 독시사이클린 원액을 섭씨 영하 20도로 유지하십시오. 다음으로, 전체 DMEM에서 새로운 독시사이클린 용액을 준비합니다.

그리고 섭씨 37도까지 데우십시오. 전기생리학적 기록을 위해 500마이크로리터의 독시사이클린 용액을 밀리리터당 2마이크로그램으로 각 웰에 피펫팅하여 밀리리터당 1마이크로그램의 독시사이클린의 최종 농도를 만듭니다. 칼슘 이미징을 위해 밀리리터당 3마이크로그램의 독시사이클린 용액 100마이크로리터를 각 웰에 추가하여 밀리리터당 1마이크로그램의 독시사이클린의 최종 농도를 만듭니다.

섭씨 37도에서 유도를 위해 원하는 시간 동안 샘플을 배양하고 CO2 5%를 이산화시킵니다. 칼슘 이미징을 통해 단백질 발현을 보정하려면 Ringer's solution을 준비하고 섭씨 37도로 가열합니다. AM 에스테르의 분산을 돕기 위해 수성 용해체의 Fura-2와 같은 형광 이온 지시자는 DMSO에서 비이온성 F-127 용액을 준비합니다.

비이온성 F-127이 용해될 때까지 용액을 섭씨 27도까지 가열합니다. 그런 다음 비이온성 F-127 용액을 실온에 보관하고 사용하기 전에 다시 섭씨 37도로 가열합니다. 그 후, 2-3 마이크로몰 Fura-2 AM, 02 밀리리터 비이온 F-127 및 10 밀리몰 D-포도당을 보충한 Ringer의 용액에서 Fura-2 AM 로딩 용액을 준비합니다.

그런 다음 챔버의 세포에서 배지를 흡인하고 Fura-2 AM 로딩 용액으로 교체합니다. 어두운 곳에서 실온에서 60분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 Fura-2 AM 용액을 흡입합니다.

그리고 Ringer's와 10밀리몰 D-포도당 용액으로 세포를 세척하여 여분의 세포 염료를 제거합니다. 각각 200마이크로리터의 Ringer's와 10밀리몰의 D-포도당 용액을 남겨둡니다. 그리고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.

30분 후 챔버를 s에 놓습니다.tage 현미경 노즈 피스 위의 홀더로 고정합니다. 그런 다음 원하는 최종 농도에 따라 TRPV1 특이적 작용제 캡사이신의 작업 농도를 계산하고 준비합니다. 그런 다음 램프, 카메라 및 현미경을 켜고 Fura-2 필터를 선택하여 510나노미터 파장의 방출을 감지합니다.

원하는 배율을 조정하고 현미경 손잡이를 사용하여 이러한 매개변수를 조작하여 선택한 필드에 있는 세포의 초점을 맞춥니다. 어두운 곳에서는 배경 조명을 빼고 노출 시간을 설정합니다. 원하는 속도로 사진 샘플링을 설정합니다.

그런 다음 Fura-2 로딩 세포를 340나노미터 및 380나노미터 파장에서 여기하여 형광 반응을 기록하는 것으로 시작합니다. 340 대 380 신호의 비율은 세포 내 칼슘 농도에 대한 지표이며, 따라서 TRPV1 활성에 대한 지표이기도 합니다. 그 후, TRPV1의 발현 수준을 평가하고 TRPV1 반응을 분석하기 위해 200마이크로리터의 Ringer's solution에 2개의 마이크로몰 캡사이신을 첨가하여 1마이크로몰 캡사이신의 최종 포화 농도를 생성합니다.

단일 채널 기록을 위한 이상적인 유도 시간을 결정하려면 먼저 수조와 피펫 용액을 준비하십시오. 그런 다음 10-12 메가 옴의 저항으로 화염 연마 된 유리 피펫을 준비하십시오. 대상 세포의 멤브레인에 seal을 만들어 전체 세포 패치 클램프를 수행합니다.

그런 다음 유지 전위를 음의 40밀리볼트로 설정합니다. 그리고 음압을 가하여 멤브레인을 파열시킵니다. 그런 다음 미세 조작기를 사용하여 메브레인 패치가 있는 피펫을 세포에서 들어 올립니다.

그런 다음 멤브레인 패치가 포함된 피펫 바로 옆에 profusion 시스템을 배치합니다. 베셀 필터와 출력 게인을 각각 2-5 킬라허츠와 10 암페어로 낮춥니다. 그 후, 작용제의 포화 농도를 멤브레인 패치에 풍부하게 뿌립니다.

그런 다음 셀에 적용된 유도 시간에 대해 성공적으로 기록된 단일 채널 패치의 수를 분석하고 원하는 결과에 따라 유도 시간을 조정합니다. 다음은 캡사이신 적용 전과 후의 RTRPV1을 일시적으로 발현하는 TREX 293 세포의 유사 컬러 이미지입니다. 다음은 처리되고 transfection된 TREX 293 세포에서 시간에 따른 세포 내 칼슘 수치의 해당 변화입니다.

각 그래프는 평균 50개의 셀을 나타냅니다. TRPV1 녹음에서 단일 채널 패치의 성공률은 유도 시간에 따라 다릅니다. 다음은 유도 2시간 및 4시간 후 RTRPV1을 일시적으로 발현하는 TREX 293 세포의 패치의 현재 흔적입니다.

그리고 이 플롯은 표시된 유도 시간 이후의 패치에 있는 채널의 수를 설명합니다. 이 기술은 적절하게 수행될 경우 transfection 후 12시간 이내에 발현이 제어된 단백질을 분석할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 서로 다른 단백질에 대한 transfection 농도와 유도 시간을 표준화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 선택한 이온에 대해 시간 효율적인 방식으로 제어 가능한 발현 시스템을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.