Name: 시공간 변동 분광법에 의한 밀매된 세포하 나노구조체의 구조적 및 동적 특성 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 배우세요 iMSD 분석을 활용한 살아있는 세포 내 거대세포소체의 구조적 및 동적 특성 변화를 조사하는 방법입니다. 이 기술은 암과 당뇨병 등 병리 상태에서 세포하 나노구조체의 변화를 정량적으로 선별하는 데 활용됩니다.

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이 작업은 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램 (보조금 계약 866127 없음, 프로젝트 CAPTUR3D)에 따라 유럽 연구위원회 (ERC)로부터 자금을 지원받았습니다.

1. 시료 준비
<ol><li>현미경 실험 전에, 현미경 검사에 적합한 접시에서 세포를 계대 배양합니다.<ol>
<li>컨플루언트 HeLa 또는 INS 1E(인슐린종β세포형) 세포의 10 cm 조직 배양 처리된 접시를 0.01 M 1x PBS로 2회 세척하고, 0.05% 트립신-EDTA(1x) 1 mL를 첨가하고, 이를 37°C, 가습, 5%CO2 배양기에 5분 동안 둔다.</li>
		<li>9 mL의 완전한 DMEM (HeLa 세포용) 또는 RPMI 1640 (INS-1E 세포의 경우) 배지를 첨가하여 분리된 세포를 재현탁시키고, 최종 10 mL를 원심분리 튜브에 수집하였다.</li>
		<li>배지 1 mL의 최종 부피로 각35 mm x 10 mm 디쉬에 약 2 × 10 5 세포를 시드한다. 세포를 37°C 및 5% CO2에서24시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>리소좀을 형광으로 표시하려면 LysoTracker Red DND-99를 사용하십시오.<ol>
<li>원액을 예열 배지 1 mL에 희석하여 70 nM의 최종 염료 농도로 한다.</li>
		<li>접시의 배지를 신선한 LysoTracker 함유 배지로 교체하십시오. 세포를 5% CO2 분위기에서 37°C에서 20분 동안 LysoTracker 함유 배지에서 인큐베이션하고, 실험 전에 신선한 배지로2 회 세척한다.</li>
		<li>마크로피노좀을 형광 표지하려면 70-kDa 플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란을 사용하십시오. 계대배양된 세포를 0.01 M 1x 인산완충식염수(PBS)로 3회 세척하고, 덱스트란 함유 배지(1mg/mL)로 교체하고, 37°C에서 30분 동안 배양한다. 현미경 실험을 진행하기 전에 세포를 신선한 배지로 세 번 씻으십시오.</li>
		<li>INS-1E 세포에서 ISGs를 형광 표지하기 위해, 제조자의 프로토콜에 따라 트랜스펙션 시약( 표 물질 참조) 및 C-펩티드 강화 녹색 형광 단백질(EGFP) 플라스미드13 을 사용하여 세포를 형질감염시키고, 실험 전에 5% CO2 분위기에서24 시간 동안 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 데이터 수집
<ol><li>현미경이 원하는 온도와 분위기에서 평형을 이루도록하려면 실험 최소 2 시간 전에 현미경 인큐베이터 제어 시스템을 켜십시오. 참고: 각 인수는 타임랩스 시리즈입니다.</li>
	<li>60x, 1.2 NA(Numerical Aperture) 수침 목표가 장착된 반전 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.</li>
	<li>EGFP (형질감염된 세포) 및 플루오레세인 표지된 마크로피노좀의 여기 동안 488nm 아르곤 레이저를 사용하십시오. 표준 광승수 튜브 검출기를 사용하여 500 및 600 nm 사이의 형광 방출을 수집하십시오.</li>
	<li>543nm HeNe 레이저를 사용하여 Lysotracker를 여기시키고 555 nm와 655 nm 사이의 형광 방출을 수집하십시오.</li>
	<li>감지 핀홀의 지름을 1 Airy 크기로 설정합니다. 각 획득에 대해 일련의 1000개의 순차 프레임을 수집합니다. 129ms의 프레임 시간 동안 픽셀 유지 시간을 2μs/픽셀로 설정합니다. 참고: 각 프레임은 256 x 256 픽셀(16비트/픽셀)로 구성되었으며 물리적 치수는 69nm/픽셀이며 대략 17μm x 17μm의 영역에 해당합니다.</li>
</ol>3. iMSD 계산
참고: 계산을 올바르게 실행하려면 숫자 계산 및 스크립트 프로그래밍이 가능한 소프트웨어를 사용하십시오. 특정 스크립트(즉, 'iMSD.m' 스크립트 파일의 경우 지원 파일 1 참조)는 처리할 이미지 시리즈를 포함하는 동일한 디렉토리에 있어야 합니다. 시리즈의 각 이미지는 별개의 '.tif'파일로 저장되어야 합니다.
<ol><li>인수에 사용되는 도구 매개 변수를 올바르게 초기화하려면 소프트웨어 텍스트 편집기로 iMSD.m을 열고 다음과 같이 첫 번째 섹션을 수정합니다.<ol>
<li>N을 시계열 내의 프레임 수로 설정한다(예를 들어, 이 프로토콜에서 1000).</li>
		<li>세트 px_size: 픽셀 크기, μm로 표현됨(예를 들어, 이 프로토콜에서 0,069).</li>
		<li>set f: 초 단위로 표현되는 각 프레임의 시간적 해상도(예를 들어, 이 프로토콜에서 0,129).</li>
		<li>배경 보정을 위해 필터: 이진 입력 설정, 원시 이미지를 처리하기 위해 값을 '0'으로 설정하거나, 값을 '1'로 설정하여 임계값 기반 배경 뺄셈을 수행합니다.</li>
		<li>설정 av_toll : 배경 보정을위한 임계 값; 강도가 이 값보다 낮은 픽셀은 Filter=1인 경우 0으로 설정됩니다.</li>
		<li>비트를 강도 샘플링을 결정하는 정수 숫자로 설정한다(예를 들어, 8비트, 16비트).</li>
	</ol>
</li>
	<li>편집한 iMSD.m 스크립트 파일을 저장하고 실행합니다.</li>
	<li>스크립트 실행을 확인합니다. 참고: 계산 처리 상태는 명령 창에서 확인할 수 있습니다. 치명적인 문제가 발생하면 프로세스가 중단되고 오류 유형 및 관련 줄 코드를 표시하는 경고 메시지가 표시됩니다. 그렇지 않으면 3.3.1-3.3.3단계를 수행합니다.<ol>
<li>이미지 스택을 가져오고 배경을 뺍니다(필요한 경우).</li>
		<li>푸리에 방법을 사용하여 시공간 상관 함수 G(ξ,η,τ)를 계산합니다.</li>
		<li>시공간 상관 함수를 2D 가우시안 함수에 맞춥니다. 참고: 프로세스가 끝나면 σ2(τ) 피팅 프로시저의 출력 값이 명령 창에 표시됩니다: 피팅의 평균, 오류 및 해당 양호(R2)가 보고됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그래픽 출력을 확인합니다. 참고: iMSD 곡선과 해당 피팅 곡선은 세 개의 개별 패널에 표시되며, 각각 사용되는 다른 유형의 피팅 방정식(브라운 확산, 변칙적 확산 또는 제한된 확산)에 대해 표시됩니다. 각 곡선에 대해R2 값이 그래프 범례에 보고됩니다.</li>
	<li>텍스트 출력을 확인합니다. 참고: 프로세스가 끝나면 원래 타임랩스 '.xls' 파일의 이름과 동일한 이름으로 '.tif' 파일이 만들어집니다. 첫 번째 시트에는 각 시간 지연에 대해 계산된 ξ, η, τ 및 σ2의 값이 포함됩니다. 입력 파라미터 및 주 계산된 출력 값은 제2 시트, 즉 확산 계수, 변칙 계수 및 y축 σ20 절편에 보고된다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

iMSD의 특성과 장점은 유사한 정보를 검색하는 데 사용할 수 있는 기술과 비교할 때 분명합니다. 구조 정보를 위해, 바람직한 선택은 투과 전자 현미경 (TEM) 분석이다. 이 방법에 의해, 분자 분해능 및 심지어 그 이상에서의 초구조적 세부 사항들이 심지어 세포내 나노구조체에 대해서도 검색될 수 있다. 그럼에도 불구하고, TEM의 독특한 공간 분해능은 시간적 차원의 정보를 희생시키면서 달성되며, 이는 여기서 흥미로울 만하다. 이를 보완하기 위해, 최근 라이브 셀 이미징 기술의 발전이 특히 중요합니다. 여기에는 향상된 성능(예를 들어, 밝기 및 광안정성)을 갖는 새로운 형광 마커, 최적화된 라벨링 절차, 및 보다 민감한 검출기가 포함된다. 또한, 분석 툴은 구조적(예를 들어, 로컬 이미지 상관 분광법의 페이저 기반 분석에 의한 '크기', PLICS 23, Number&Brightness analysis(24)에 의한 응집/올리고머화) 및 동적(예를 들어, 단일 입자 추적에 의한 확산 법칙, 즉 (SPT)25,26,27,28 모두를 다루기 위해 이용가능하다. ) 아세포 스케일에 대한 파라미터. SPT 메서드는 개체 궤적 및 해당 MSD에 직접 액세스할 수 있습니다. 그러나, 단점은 낮은 밀도의 프로브 및 매우 밝은 라벨 및 통계적 기준을 만족시키기 위해 측정될 많은 단일 물체 궤적에 대한 필요성이다. 측정의 시간적 분해능과 관련하여, 무기물, 광감성 프로브(예를 들어, 양자점 또는 금속 나노입자)는 SPT 성능을 증가시킬 수 있지만 복잡한 생산 및 라벨링 절차를 희생한다.
이러한 표준과 비교하여 여기에 설명 된 iMSD 방법은 몇 가지 주요 이점을 보여줍니다. 첫째, 이러한 접근법은 유전적으로 코딩된 형광 단백질과 같은 비교적 희미한 형광 태그와 함께 사용될 수 있다(예를 들어, ISGs에 적용). 따라서, SPT와 비교하여, 요구되는 광자의 양이 적기 때문에(동일한 라벨을 사용하여) 더 높은 시간적 분해능이 달성된다(동일한 라벨 사용). 둘째, iMSD 방법은 시간 분해능에 의해서만 제한되지만 회절은 제한되지 않는다. 실제로, 회절-제한된 광학 셋업이 사용되었음에도 불구하고, STICS(29)를 사용하여 분자 흐름에 대해 이미 입증된 바와 같이, 회절 한계 미만에서도 평균 분자 변위가 측정될 수 있다. 변위 측정의 실제 분해능은 상관 함수가 얼마나 정확하게 (신호 대 잡음의 관점에서) 측정 될 수 있는지에 달려 있으며, 따라서 회절에 의해 제한되지 않는 이유를 설명합니다. 따라서, 측정될 수 있는 최소 변위가 관심 대상의 확산성 및 이미징 셋업의 시간적 해상도에 의존한다는 것이 명백하게 보인다.
이와 관련하여, 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 마크로피노좀 또는 인슐린 과립과 같은 세포하 나노구조체에 적용하는 것이 최적이라는 것을 고려하는 것이 중요하다: 이용 가능한 주사 속도는 관심 대상의 역학보다 상당히 높다. 이러한 경우, 획득 동안 물체의 이동은 무시할 수 있으며, 상관 함수는 가우시안 함수에 의해 근사화될 수 있다. 마지막으로, iMSD 접근 방식은 래스터 스캔 또는 광역 카메라 기반 이미징을 기반으로 하는 광범위한 상용 광학 현미경 설정에 쉽게 적용할 수 있으며, 시스템 보정이 필요하지 않습니다(입자 크기의 정확한 추정을 달성해야 하는 경우에만 필요함). 메서드가 작동하기 위한 중요한 매개 변수는 적절한 공간 샘플링입니다. 일반적으로 피팅 알고리즘의 만족스러운 수렴에 도달하려면 이미징을위한 관심 영역의 최소 크기가 관심 대상 최대 변위보다 적어도 3 배 커야합니다.
결론적으로, iMSD 방법은 빠른 수집을 위해 장착 된 현미경 만 있으면됩니다. 관심있는 구조는 임의의 유전적으로 인코딩된 또는 유기 형광단에 태깅될 수 있고, 따라서 다중 채널 이미징을 가능하게 한다. 가까운 장래에 교차 iMSD 분석이 세포 내 나노 구조의 하위 집단을 선택하고 세포 내에서 상호 작용과 공동 확산을 밝히는 데 사용될 것으로 예상되며, 후자는 세포 생물 물리학에서 뜨거운 주제입니다. iMSD 분석에 의해 어떤 세부 사항이 손실된다면, 이것은 확실히 동적 세포 내 나노 구조 내의 많은 양의 분자 정보와 관련이 있습니다. 이러한 정보는 필연적으로 열악한 시간 분해능으로 인해 측정 중에 평균화됩니다. 그러나 이론적으로는 충분한 획득 속도를 달성할 수 있다면 분자 정보를 검색할 수 있는 가능성으로 인해 기술적 한계가 없다8. 검출기 속도/감도 및 이미징 기술의 지속적인 개선으로 인해 전체 세포 하부 구획 및 분자 구성 요소에 대한 정보가 단일 데이터 세트에서 추출될 것으로 예상됩니다.

세포하 나노구조체(예를 들어, 내시/분비 소포, 소기관)는 세포-신호전달 조절1에서 중추적인 역할을 한다. 그들의 구조적 (예를 들어, 크기) 및/또는 동적 (예를 들어, 확산성) 특성의 적절한 튜닝은 세포 가 내부 또는 외부 자극 2,3,4에 어떻게 반응하는지를 결정한다. 이 증거에 기초하여, 이러한 특성의 변화가 많은 병리학 적 조건에서 발견된다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 예는 암 2,3에서 잘못 조절된 엔도사이토시스의 역할, 제2형 당뇨병 상태5에 노출된 β-세포에서 ISGs의 수준에서 발견되는 구조적 및 동적 변화, 글로보이드-세포 백혈구 이영양증 또는 갈락토실세라미드 지질증에서의 리소좀 구조 및 수송 특성의 잘못된 조절, 및 신경 퇴행성 장애 (예를 들어, 알츠하이머병)7에서 엔도-리소좀 경로에서의 기능장애를 포괄한다.
이러한 맥락에서, 연구자들은 최근 표준 광학 현미경 방법의 성능이 공간 및 시간적 샘플링 분해능을 적절하게 튜닝함으로써 향상될 수 있음을 입증하였다8. 이것은 차례로 관련성의 생물학적 과정에 대한 더 많은 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 실제로, 이것은 시공간 변동 분석의 알고리즘에 의해 가능해지는데, 이는 관심있는 생물학적 대상에 대한 예비 지식과 단일 물체 궤적의 추출에 대한 예비 지식이 필요없이 광학 현미경 이미지의 표준 스택에서 직접 확산 물체의 평균 구조 및 동적 특성을 동시에 추출합니다. 이 모든 정보는 iMSD 추적9 (iMSD 추적 파생 및 분석에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1에 제공됨)라는 방법의 단일 출력으로 묶여 있습니다.
결과 실험 프로토콜은 몇 가지 단계로 구성됩니다. 첫째, 관심 영역의 이미징은 높은 시간 해상도로 수행됩니다. 그런 다음, 평균 공간적-시간적 상관 함수들이 이미지들의 스택으로부터 계산된다. 마지막으로, 일련의 상관 함수의 가우시안 피팅에 의해, 평균 '확산 법칙'은 이미징으로부터 직접 얻어지고 물체 확산 모드를 인식하기 위해 분석된다. 이 방법의 잠재력은 분자에서 나노 입자, 심지어 전체 세포 소기관 / 구조 9,10,11,12,13,14,15에 이르기까지 다양한 생물학적 개체에 대해 이미 입증되었습니다.
이 논문은 마크로 피노솜에 대한 iMSD 적용을보고하여 평균 (즉, 전체 인구 수준에서) 구조적 및 동적 특성의 관점에서 본질적이고 돌이킬 수없는 시간 진화 특성을 강조합니다. 또한, 이들 내시성 소포는 '정지 상태', 즉 과립의 전체 집단의 평균 구조적/동적 특성이 임의의 시점에서 일정하게 유지되는 상태에서의 아세포 구조에 대한 기준으로서 ISGs와 비교된다. Macropinocytosis는 원형질막의 광범위한 재구성 (또는 주름 형성)에 의해 시작된 일련의 사건을 정의하여 외부 거대 피노사이틱 구조를 형성하고 그 후 내재화된다16. 형성된 초기 단계의 마크로피노좀은 파고솜과 매우 유사하다. 동시에, 그들은 특징적으로 큰 크기, 형태 학적 이질성 및 단백질 코트 구조의 부족으로 인해 다른 형태의 내시성 소포와 구별 될 수 있습니다.
생화학 적 분석은 내면화시 마크로 피노솜이 다른 내세포 경로의 단백질 마커로 점진적으로 풍부 해지고, 차례로 인신 매매17 동안 그들의 정체성이 지속적으로 변화하고 있음을 시사한다. 엔도솜 경로의 공지된 마커에 대한 항체를 사용하여, 마크로피노좀이 점진적으로 고전적인 엔도솜 특징을 채택한다는 것이 입증되었다: 그들은 크기가 감소하거나, 후기 내분비 구조 (예를 들어, 리소좀)로 발전하거나, 결국 특정 분자 마커의 막 매개 검색 (예를 들어, 넥신 분류)을 통해 그들의 동일성을 잃는다.18,19 . 전반적인 시나리오는 세포 내의 모든 단일 거대 피노솜이 원형질막에서 최종 세포 내 운명으로 밀매되는 동안 구조적, 역동적 (뿐만 아니라 분자적) 정체성을 돌이킬 수 없게 변화시킨다는 것입니다. 결과적으로, 거대 피노솜의 전체 집단의 구조적/동적/분자적 특성 또한 동일한 시간적 경로를 따라 변화하고 있다. 관찰된 개체의 전체 집단의 평균 특성에 본질적으로 민감하기 때문에, iMSD 방법은 주요 평균 파라미터, 즉 국소 확산성 및 변칙 계수(동적 특성) 및 그들의 세포내 밀매의 임의의 단계에서 마크로피노좀의 평균 크기(구조적 특성)의 정량화에 의해 '진화하는 자연'을 정량적으로 묘사한다.
비교를 위해, 유사한 측정이 잘 알려진 세포내 막-밀폐된 구조인 ISG에 대해, β-세포의 모델에서 수행되었다. 마크로피노좀과 마찬가지로, 트랜스골지 네트워크(TGN)에서의 그들의 기원으로부터 원형질막에서의 그들의 엑소사이토시스에 이르기까지, ISGs의 구조적 및 동적 특성의 조절은 ISG 기능(20)의 적절한 실행에 중추적이다. 그러나 마크로피노솜과는 달리, ISG는 ISG 수명의 모든 기능적/구조적/분자적 단계가 세포 내에 동시에 존재하고 각각은 ISG의 특정 하위 집단으로 표현되는 '정지 상태'에 살고 있다. 즉, 모든 단일 과립이 생물 발생에서 분비로 돌이킬 수 없게 진화하지만, 과립 전체 집단의 평균 구조 / 동적 특성은 언제든지 일정하게 유지 될 것으로 예상됩니다 (예를 들어 포도당, 콜레스테롤 및 사이토 카인13과 같은 외부 자극에 의해 고정 상태 조건이 변경되지 않는 한). 이것은 iMSD 분석에 의해 확인된다.

<table><tbody><tr><td>100x 페니실린-스트렙토마이신-글루타민</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>세포 배지 보충제</td></tr><tr><td>C-펩타이드-EGFP</td><td></td><td></td><td>플라스미드</td></tr><tr><td>DMEM 고포도당</td><td>Gibco</td><td>31053028</td><td>세포 배지(HeLa)</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>세포 배지 보충제</td></tr><tr><td>플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란 70 kDa</td><td>시그마 알드리치</td><td>46945-100MG-F</td><td>시약</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td>세포주</td></tr><tr><td>리포펙타민 2000</td><td>TermoFisher</td><td></td><td>11668019 Trasfection 시약</td></tr><tr><td>Lysotracker Red DND-99</td><td>Gibco</td><td>L7528</td><td>시약</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWork</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>현미경에 적합한 세포 접시</td><td>Willco</td><td>GWSt-3522</td><td>페트리 접시</td></tr><tr><td>올림푸스 FV1000</td>, <td>올림푸스 일본</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr>, <tr><td>RPMI 1640</td>, <td>Gibco</td><td>11835063</td><td>세포 배지(INS-1E)</td></tr></tbody></table>

시공간 변동 분광법에 의한 밀매된 세포하 나노구조체의 구조적 및 동적 특성 조사

Probing Structural and Dynamic Properties of Trafficking Subcellular Nanostructures by Spatiotemporal Fluctuation Spectroscopy

이미징 유래 평균 제곱 변위 (iMSD)는 용질 및 생체 분자의 endo / exocytotic trafficking에 관여하는 소포와 같은 세포 이하 나노 구조의 구조적 및 동적 특성을 해결하는 데 사용됩니다. iMSD는 표준 타임랩스 이미징에 의존하고, 모든 광학 설정과 호환되며, 궤적을 추출하기 위해 단일 오브젝트에 머무를 필요가 없습니다. 각각의 iMSD 트레이스로부터, 평균 구조 및 동적 파라미터(즉, 크기, 국소 확산도, 변칙 계수)의 고유한 삼중항이 계산되고 조합되어 연구중인 나노구조체의 "iMSD 시그니처"를 구축한다. 
이 접근법의 효능은 매크로 피노솜의 모범적 인 사례로 여기에서 입증됩니다. 이 소포는 시간에 따라 진화하여 평균 크기, 수 및 동적 특성이 세포 내 밀매의 초기 단계에서 후기 단계로 넘어갑니다. 대조군으로서, 인슐린 분비 과립 (ISGs)은 개체의 전체 집단의 평균 구조적 및 동적 특성이 시간에 불변하는 정지 상태에 사는 아세포 구조에 대한 참조로 사용됩니다. iMSD 분석은 이러한 독특한 특징을 정량적으로 강조하고 생리 학적 및 병리학 적 상태 모두에서 하위 세포 수준에서 유사한 응용 프로그램에 대한 길을 열어줍니다.

이 방법의 일반적인 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. 샘플 준비(그림 1A)부터 세포내 나노구조체의 시간 경과 이미징(그림 1B), 일련의 시공간 상관 함수 계산을 위한 변동 분석(그림 1C), 연구 중인 개체의 평균 구조적/동적 특성 도출을 위한 피팅(그림 1D)에 이르기까지 프로토콜 섹션에 제시된 주요 단계를 요약합니다.
중요한 파라미터는 관심 있는 세포하 개체를 이미징하기 위해 채택된 시간 분해능입니다. 이 실험 값은 관심 대상의 최소 평균 변위가 측정되는 시간 임계값을 설정합니다. 그러나, 바람직한 조건은 캡처된 프레임 내에서 관심 대상이 '움직이지 않음'으로 나타나는 이미징의 시간 해상도를 설정하는 것이며, 즉, 평균적으로 이미징 속도로 인해 변형되지 않는 특징적인 크기를 디스플레이한다. 이것은 관심있는 대상이 막 밀폐 된 아세포 구조 또는 소기관 (이 경우와 같이)인 경우 기술적으로 가능합니다. 전형적으로, 하위세포 구조는 세포질 내의 단리된 단일 분자의 것보다 몇 배 더 낮은 국부적 확산 계수(D,μm2/s, 표 1 참조)를 나타낸다(예를 들어, GFP21). 검증은 관심있는 소기관을 인위적으로 고정화함으로써(예를 들어, 화학적 고정에 의해) 수행될 수 있다. 실제로, 이러한 조건은 사용된 실험 조건(예를 들어, 여기 파장, 픽셀 크기, 목표) 하에서 실제 소기관 크기를 결정하기 위한 참조로서 작용할 수 있다.
여기서, 리소좀이 이 절차를 위한 시험 소기관으로서 사용되었지만, 결과는 표적 구조로부터 독립적으로 유효하다. 도 2A는 적절한 시간 해상도(즉, 전형적으로 100ms/프레임 미만; 예를 들어, 도 2B의 예에서 65ms/프레임)에서 라이브 셀들 상에서 수행되는 획득과 함께 고정된(즉, 움직이지 않는) 리소좀의 이미지를 도시하고, 도 2C의 예에서 매우 낮은 시간 해상도(예를 들어, 10s/프레임)에서 의도적으로 수행된 획득을 도시한다. ). 각 조건에 대해, 확산 물체의 크기는 다음과 같이 추출된다: i) 스폿의 강도 프로파일은 ImageJ 소프트웨어의 라인 툴에 의해 도출된다; ii) 강도 프로파일은 반값(FWHM) 값에서 전폭을 계산하기 위해 가우시안 함수에 의해 플롯되고 보간되며, 차례로 스폿 직경의 추정치로 사용된다(그림 2D). 도 2E의 플롯에서 예상되고 도시된 바와 같이, 매우 높은 시간 분해능(즉, 65ms/프레임)에서의 획득은 위에서 설명된 표준 툴을 사용하거나 iMSD y축 절편을 추출함으로써 고정된 샘플에서 수득된 것에 근접한 구조의 평균 크기를 산출한다. 대신, 느린 속도에서의 획득은 이미징 중 자연 구조 역학으로 인해 구조물의 겉보기 크기의 증가를 산출합니다. 차선책의 실험 조건 하에서, 추출된 구조적/동적 정보는 연구 중인 개체의 본질적인 특성을 충실하게 반영하지 못한다.
주요 실험 파라미터가 선택되면, 표적 세포내 구조에 대한 데이터 세트가 생성될 수 있다. 마크로피노좀의 경우, 세포를 70 kDa 덱스트란으로 20분 인큐베이션한 후, 표지된 세포내 구조의 시계열을 처리 후 30분에서 약 180분까지 상이한 시점에서 획득하였다. 흥미롭게도, 마크로피노좀의 구조적 및 동적 특성의 점진적인 변화가 인신매매 중에 검출된다(도 3; 마크로피노좀에 대한 σ02,Dm, α 및 N의 분포는 왼쪽의 플롯에 보고된다). 캐피노솜의 국소 확산도(Dm)의 명백한 변화는 인신매매 중에 검출되지 않지만, 특성 크기(σ02)와 전체 운동 모드(α)는 모두 시간이 지남에 따라 진화합니다.
특히 주목할 점은, 마크로피노좀의 평균 크기의 감소가 인신매매 동안에 관찰되며(도 3A, 왼쪽), 그들의 운동의 서브확산적 성질의 수반되는 증가(즉, α값의 감소로 표시됨, 도 3C, 왼쪽 패널). 추가적으로, 마크로피노좀의 수는 각각의 획득으로부터 추출되었다: 도 3D, 왼쪽 패널에 보고된 결과는, 시간에 따른 마크로피노좀의 수의 증가를 명백히 드러낸다. 이러한 모든 결과는 덱스트란-표지된 마크로피노좀이 원형질막에서 분리된, 큰 막 밀폐된 소포(세포골격 성분을 따라 이동하기에 유능함)로서 기원하도록 되어 있지만, 작고 무작위로 확산되는 구조의 큰 집단으로 이루어진 엔도-리소좀 경로와 점진적으로 소통하기로되어 있기 때문에 기대치와 잘 일치한다.
위에서 예상한 바와 같이, 마크로피노좀에 대한 결과는 ISG에서 수행된 유사한 측정치와 대조적이다(그림 3, 오른쪽 열). 인슐린 과립은 마크로피노좀에 대해 관찰된 동일한 시간 창에서 iMSD 유래 구조적/동적 파라미터(및 세포 내의 평균 수)의 시간 진화 추세를 나타내지 않는다. 또한, σ02, Dm 및 α의 특성 값은 리소좀의 특성 값과 상당히 다르며 다시 참조로 사용됩니다. 이 결과는 위에서 예상한 바와 같이, 과립이 언제든지 ISG의 전체 집단의 평균 구조적/동적 특성이 변하지 않는 '정지 상태'에서 조사된다는 생각을 확인시켜준다(즉, 고정 상태 조건이 변화하지 않는 한, 예를 들어, 외부 자극으로 인해 일정하게 유지됨).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62790/62790fig01.jpg"> 그림 1: 실험 워크플로우 . (A) 공초점 실험 전에 24시간(형질감염 실험의 경우 48시간) 세포를 현미경 적용에 적합한 세포 접시에 플레이팅하였다. 이어서, 세포를 표지 방법(프로토콜 참조)에 따라 적절하게 처리하여 목적하는 세포질 소기관을 염색하였다. (B) 전형적인 공초점 획득은 살아있는 세포의 세포질 부분의 이미지 스택 (time-lapse)으로 구성되며, 표지 된 소기관 역학의 시간 진화를 기술한다. (C) 타임랩스 무비는 맞춤형 Matlab 스크립트로 분석되며, 먼저 시공간 이미지 상관 함수와 가우시안 피팅을 계산하여 iMSD 곡선(D)을 플로팅하고 이미지화된 소기관의 구조적 역학 파라미터를 설명하는 관련 추출된 피팅 파라미터를 계산합니다. 약어: iMSD = 이미징 유래 평균 제곱 변위; STICS = 시공간 이미지 상관 분광법; α = 변칙적 확산 계수; Dm = 국소 확산도; σ2(τ) = 분산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62790/62790fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62790/62790fig02.jpg"> 도 2: 적절한 실험 파라미터 . (A) 고정된 샘플에서 염색된 리소좀의 예시적인 이미지. 스케일 바 = 2 μm. (B) 살아있는 세포에서 염색된 리소좀의 이미지 스택의 첫 번째 프레임으로서, 적절한 파라미터로 획득하였다. 시간 해상도 : 65ms / 프레임. 스케일 바 = 2 μm. (C) 저속으로 획득된 살아있는 세포에서 염색된 리소좀의 이미지 스택의 첫 번째 프레임: 이미징 동안 소기관 운동으로 인한 겉보기 리소좀 크기의 인공적인 변형이 가시화된다. 시간 해상도: 10초/프레임. 스케일 바 = 2 μm. (D) (A), (B) 및 (C)의 청색 ROI에서 이미지화된 리소좀에 대한 크기 계산의 예. 파란색 선을 따른 강도 프로파일에는 FWHM, 즉 스폿 크기의 추정치를 검색하기 위해 가우시안 함수가 장착되었습니다. FWHM 값은 각 피팅에 대해 보고됩니다. (E) 모든 이미지화된 리소좀(검정 사각형, 평균값 및 표준 편차)에 대해 패널(D)에 기술된 이미지 분석에 의해 얻어진 크기 값의 그래픽 표현, 청색 ROI(파란색 삼각형) 내에 둘러싸인 리소좀에 대해, iMSD 분석(적색 원)에 의해 검색됨. 이 수치는 22에서 나온 것입니다. 약어: ROI = 관심 지역; FWHM = 절반 최대값에서 전체 너비; iMSD = 이미징 유래 평균 제곱 변위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62790/62790fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62790/62790fig03.jpg"> 그림 3: 표지된 소기관의 시간적 진화 . (A) iMSD 추출된 크기 값의 플롯 대 후속 획득의 시간 진행은 10분 시간 창에서 수행된 획득에서 측정된 값의 평균으로 표시됩니다. 왼쪽에, 마크로피노좀의 평균 크기(검은 원)의 점진적 감소와 오른쪽에, 리소좀에 비해 인슐린 분비 과립(검은 사각형)의 시간-불변 크기(검은색 사각형)가 평균 크기 값(더 두꺼운 빨간색 선)± 표준 편차(파선 빨간색 선)로 표시된다. (b) 및 (C) iMSD 분석에 의해 추출된 마크로피노좀(왼쪽) 및 인슐린 과립(오른쪽)에 대한Dm 과 α계수의 시간 진행. (d) 각각의 획득된 타임랩스 필름의 첫 번째 프레임에서 측정된 라벨링된 마크로피노좀 및 인슐린 과립의 수의 시간-진화. 약어: iMSD = 이미징 유래 평균 제곱 변위; α = 변칙적 확산 계수; Dm = 국소 확산도, N = 숫자. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62790/62790fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">세포소기관</td>
			<td colspan="2">라벨</td>
			<td>세포주</td>
			<td>크기(nm)</td>
			<td>Dm (× 10-3 μm2/s)</td>
			<td>α</td>
			<td>N</td>
			<td>참고문헌</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">초기 엔도솜 (EE)</td>
			<td colspan="2">셀라이트 초기 엔도솜 GFP</td>
			<td>헬러</td>
			<td>395±74</td>
			<td>3.0±2.4</td>
			<td>1.02±0.20</td>
			<td>40</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">후기 엔도솜 (LE)</td>
			<td colspan="2">셀라이트 후기 엔도솜 GFP</td>
			<td>헬러</td>
			<td>693±102</td>
			<td>15.4±10.6</td>
			<td>0.57±0.16</td>
			<td>58</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">리소솜 (LY)</td>
			<td colspan="2">리소 트래커 DND-99</td>
			<td>헬러</td>
			<td>471±76년</td>
			<td>15.3±9.0</td>
			<td>0.49±0.13</td>
			<td>143</td>
			<td>10, 14</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">카베올라 (CAV)</td>
			<td colspan="2">카베올린-EGFP</td>
			<td>헬러</td>
			<td>405±49분</td>
			<td>3.1±1.8</td>
			<td>1.00±0.22</td>
			<td>15</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">클라트린 코팅 베시클 (CCV)</td>
			<td colspan="2">트랜스페린-알렉사 488</td>
			<td>헬러</td>
			<td>513±62분</td>
			<td>16.2±9.9</td>
			<td>0.48±0.17</td>
			<td>33</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">인슐린 과립 (IG)</td>
			<td colspan="2">C-펩티드-EGFP</td>
			<td>INS-1E</td>
			<td>335±56</td>
			<td>3.0±1.7</td>
			<td>0.70±0.14</td>
			<td>107</td>
			<td>11</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">초기 마크로티노솜 (EMCR)</td>
			<td colspan="2">플루오레세인-덱스트란 70 kDa</td>
			<td>헬러</td>
			<td>979±423년</td>
			<td>8.3±9</td>
			<td>0.79±0.27</td>
			<td>36</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">중급 마크로티노솜 (IMCR)</td>
			<td colspan="2">플루오레세인-덱스트란 70 kDa</td>
			<td>헬러</td>
			<td>702±180</td>
			<td>13.7±19.9</td>
			<td>0.60±0.38</td>
			<td>29</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">후기 마크로티노솜 (LMCR)</td>
			<td colspan="2">플루오레세인-덱스트란 70 kDa</td>
			<td>헬러</td>
			<td>592±127</td>
			<td>5.8±4.7</td>
			<td>0.39±0.21</td>
			<td>21</td>
			<td>10</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 구조적 및 동적 iMSD 추출된 파라미터. 표는 상이한 소기관에 대해 측정된크기, Dm, 및 α계수의 값을 보여주고, 표지 전략, 사용된 세포주 및 분석된 획득 수를 특정한다. 값은 평균 ± 표준 편차로 보고됩니다. 약어: iMSD = 이미징 유래 평균 제곱 변위; α = 변칙적 확산 계수; Dm = 국소 확산도, N = 숫자; GFP = 녹색 형광 단백질; EGFP = 강화된 녹색 형광 단백질.
보충 파일 1: iMSD 추적 파생 및 분석에 대한 세부 정보. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62790/Supplementary%20File%201%20-%20iMSD%20calculation.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
지원 파일 1 :<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62790/Supplementary%20File%202%20-%20MatLAB%20script.m" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이미징 유래 평균 제곱 변위 (iMSD) 분석은 구조 및 동적 특성 측면에서 고유 한 시간 진화 특성을 강조하기 위해 매크로 피노솜에 적용됩니다. 그런 다음 Macropinosomes는 시간 불변의 평균 구조 / 동적 특성을 가진 세포 하부 구조에 대한 참조로서 인슐린 분비 과립 (ISGs)과 비교됩니다.

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) is used to address the structural and dynamic properties of subcellular nanostructures, such as vesicles ...

Imaging the Right Mean Square Displacement Method'는 살아있는 샘플에서 표적 생물학적 물체의 구조와 동적 평균 특성을 동시에 추출 할 수 있습니다. 오른쪽 평균 제곱 변위를 이미징하는 것은 빠르고 견고한 절차로, 단일 물체 궤적을 추출할 필요가 없으며 복잡한 라벨링이 필요하지 않습니다. 표준 광학 설정과 형광 라벨이 붙은 관심 대상만 있으면 됩니다.이 방법은 암, 당뇨병 또는 신경 퇴행성 장애와 같은 여러 병리학 적 조건에서 세포 내 구조의 수준에서 발견되는 구조적 및 동적 변화의 대규모, 정량적 스크리닝에 대한 길을 열어줍니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Fabio Azzarello가 될 것입니다. 세포를 계대 배양하기 시작하려면, 먼저 컨플루언트 헬라 세포의 10 센티미터 조직 배양 처리 접시를 0.01 몰 PBS로 두 번 세척하였다.그런 다음 0.05 % 트립신-EDTA 1 밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 접시를 5 분 동안 5 % 이산화탄소로 인큐베이션하십시오. 분리된 세포를 9밀리리터의 완전한 DMEM 배지에 재현탁시키고 원심분리 튜브에 트립신으로 총 배지 10밀리리터를 수집한다. 1 밀리리터의 최종 배지 부피로 각 35 밀리미터 x 10 밀리미터 접시에 대략 0.2 백만 개의 세포를 시드한 다음, 세포를 인큐베이션한다.관심있는 아세포 구조에 따라, 특정 표지 방법이 요구되며, 일단 표지 용액이 준비되면, 세포를 0.01 몰 PBS로 두 번 세척한다. PBS를 염료 시약 함유 배지로 교체 한 후 제조업체의 권장 사항에 따라 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 접시를 배양하십시오. 배양이 끝나면 실험 전에 신선한 배지로 세포를 두 번 세척하십시오.시간 경과 된 시리즈 수집을 수행하기 전에 현미경 인큐베이터 제어 시스템을 켜고 현미경이 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %에서 약 두 시간 동안 평형을 이루도록하십시오. 형질감염된 세포에서 EGFP의 여기를 위해 488 나노미터 아르곤 레이저를 사용하고, 플루오레씬-표지된 마크로피네좀을, 표준 사진 승수 튜브 검출기를 사용하여 500 내지 600 나노미터 사이의 형광 방출을 수집한다. 543 나노미터 헬륨 네온 레이저를 사용하여 형광 염료를 여기시키고, 555 내지 655 나노미터 사이의 방출을 수집한다.감지 핀홀의 지름을 하나의 Eri 크기로 설정합니다. 그리고 각 획득에 대해 일련의 1000 개의 순차 프레임을 수집하십시오. 프레임 시간 동안 픽셀 유지 시간을 픽셀당 2마이크로초로 설정합니다.획득을 위한 도구 매개 변수를 올바르게 초기화하려면 iMSD를 엽니다. M과 소프트웨어 텍스트 편집기. N'as 에 대한 값을 시계열의 프레임 수로, 픽셀 크기를 마이크로미터 단위로, f'를 시간 해상도(초)로 입력하여 매개변수를 설정합니다.또한, 필터 배경 보정 입력을 0으로 설정하거나, 원시 이미지를 처리하거나, 또는 하나를 설정하여, 임계값 기반 배경 뺄셈을 수행한다. 다음으로, 배경 보정을 위해 AV 통행료 임계값을 설정합니다. 필터 값이 하나로 설정되면 임계값보다 낮은 강도의 픽셀이 0으로 설정됩니다.다음으로, 비트를 강도 샘플링을 결정하는 정수 숫자로 설정합니다. 편집한 iMSD를 저장하고 실행합니다. M 스크립트 파일.명령 창에서 스크립트 실행을 확인하고 문제가 발생하면 중단된 경고 메시지가 표시됩니다. 스크립트 실행이 성공적으로 완료되면 이미지 스택을 가져오고 필요한 경우 배경을 뺍니다. 그런 다음 푸리에 방법을 사용하여 스파시오-시간 상관 함수를 계산합니다.시공간-시간적 상관 함수를 2D 가우시안 함수와 맞춥니다. 그런 다음 IMSD 곡선과 해당 피팅 곡선을 사용하여 그래픽 출력을 확인하고 사용된 피팅 방정식의 여러 유형에 대해 세 개의 개별 패널에 표시합니다. R-제곱 값은 그래프 범례에 제공됩니다.그런 다음 텍스트 출력을 확인하십시오. 시험 소기관으로서 리소좀의 이미지 획득은, 적절한 시간적 해상도 및 매우 낮은 시간적 해상도로 살아있는 세포에서 수행되었다. 소기관 운동으로 인한 리소좀의 인공적인 변형은 저해상도 이미지에서 볼 수 있었다.스팟의 강도 프로파일은 이미지 분석 소프트웨어에서 라인 툴을 사용하여 도출되었다. 이어서, 스폿 직경 추정을 수행하여, 가우시안 함수에 의해 강도를 플로팅하고 보간하였다. 고속에서의 획득은, 고정된 샘플에 근접한 대등한 평균 구조 크기를 산출하였다.대신, 느린 속도로 획득하여, 이미징 동안 자연적인 구조 역학으로 인해 구조 크기를 증가시켰다. Macropinesomes의 구조적 및 동적 특성은 인신 매매 중에 관찰되었습니다. 관찰 결과 Macropinosomes의 평균 크기가 감소한 것으로 나타났습니다.하위 확산 운동의 수반되는 증가는 감소된 알파'값으로 표시되었다. 각각의 획득에 대해, 시간에 따른 마크로피네좀의 수의 증가가 관찰되었다. 대조적으로, ISGs에 대해 수행 된 유사한 측정은 Macropinesomes와 비교하여 이러한 후자의 소기관의 매우 다른 행동을 시사했습니다.사실, 인슐린 과립은 변하지 않은, 평균 구조적, 또는 역동적 인 특성을 보여 주며, 이는 고정 된 상태에서 조사되었음을 암시합니다. 이 방법은 두 개의 별개의 아세포 소기관이 다르게 라벨링되는 경우 이중 색상 모드에서 쉽게 적용 할 수 있습니다. 이 경우 상호 상관 관계 분석은 세포 내의 두 개체의 잠재적 인 동적 상호 작용을 강조합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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