측정 공간적 칼슘 ^{2 +} 신호

이 절차의 전반적인 목적은 세포 및 전체 식물 수준 모두에서 칼슘 신호를 모니터링하는 방법을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 MS 한천 플레이트에서 묘목을 성장시키거나 이미징 챔버 내에서 직접 성장시킴으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 묘목을 접착 필름으로 옮기거나 이미징 챔버에 보관하는 것입니다.

다음으로 칼슘 신호를 유도하기 위해 묘목에 가해지는 자극. 궁극적으로, 라이프스타일 발광 또는 형광 이미징은 서로 다른 자극에 대한 전체 묘목 또는 세포질 핵 칼슘 반응을 각각 보여주는 데 사용됩니다. 단일 식물이 발생하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 필름 접착 묘목 분석이 간단하고 민감하며 견고하다는 것입니다.

따라서 이 기술은 칼슘 신호 반응이 변경된 돌연변이에 대한 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있습니다. 또한 평면 기반 칼슘 이미징과 비교하여 GFP 기반 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용하면 복잡한 현미경 설정 및 계산을 피할 수 있습니다. 이 방법은 애기장대에서 스트레스 반응 중 칼슘 신호에 대한 통찰력을 제공하지만 다른 식물 모델의 개발 또는 방어 중과 같은 다른 상황에서도 사용할 수 있습니다.

이 방법을 보여주는 것은 빛날 것입니다. 우리 연구실의 한 학생이 이 절차를 시작하기 위해 0.01%Triton 100을 함유한 10% 표백제 용액으로 콰인을 발현하는 토끼 옵시스 식물의 씨앗을 살균하고 최대 강도 MS 1%자당과 1.2%한천이 들어 있는 정사각형 접시에 씨앗을 파종합니다. 다음으로, 플레이트를 이틀 동안 섭씨 4도의 층화 후 성장 챔버에 수직으로 놓습니다.

그런 다음 묘목을 필름에 옮깁니다. 접시에서 자라는 7-10일 된 묘목 위에 접착 필름을 놓습니다. 묘목이 필름에 부착되도록 손으로 필름을 부드럽게 밀어 넣습니다.

그런 다음 묘목이 필름에 부착되지 않도록 필름을 부드럽게 벗겨냅니다. 다음으로, A 접착 묘목을 물에 15 밀리리터 2 마이크로 그램 HCTZ가 들어있는 사각형 플레이트에 배치하여 보조 인자로 묘목을 배양합니다. 묘목을 실온에서 4시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.

발광 이미징을 준비하기 위해 HCTZ 용액에서 필름을 꺼내 가운데를 잘라 두 조각을 만듭니다. 묘목이 위를 향하도록 두 개의 필름 조각을 두 개의 다른 접시에 놓습니다. 그런 다음 플레이트를 5분 동안 어둠 속에 두어 어둠 속에서 발광 이미지를 획득합니다.

발광 이미징 시스템의 스테이지에 두 개의 플레이트를 나란히 놓습니다. 20ml의 자극 용액을 플레이트에 동시에 추가하는 즉시 이미지를 획득합니다. 발광 이미지를 분석하려면 모든 발광 이미지에 대해 동일한 표시 범위를 선택하고, ROI를 자르고, 이미지를 jpeg 파일로 생성합니다.

또는 이미지를 SPE 형식 파일로 내보내고 이미지 J 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다. ROI의 평균 회색 값을 계산하기 위한 측정값을 설정하고 동일한 크기의 ROI 영역을 선택합니다. 그런 다음 평균 회색 값을 측정하고 데이터를 막대 그래프로 표시합니다.

컨포칼 이미징을 위해 묘목을 준비합니다. 사례 12를 발현하는 opsis 식물의 씨앗을 0.01% Triton을 함유한 10% 표백제로 살균합니다. 따라서 무균 씨앗은 최대 강도의 MS 염, 1 % 자당 및 1.2 % 한천을 함유 한 접시에 있습니다.

그런 다음 플레이트를 2일 동안 섭씨 4도에서 성층화 후 성장 챔버에 수직으로 놓습니다. 그 동안, 슬라이드와 커버 슬립이 있는 이미징 챔버를 조립합니다. 슬라이드 위에 물에 적신 솜 조각을 놓습니다.

그런 다음 플레이트에서 하나 또는 두 개의 5일 된 묘목을 슬라이드 중앙으로 옮깁니다. 그런 다음 커버 슬립의 각 모서리에 작은 점토 조각을 붙이고 묘목 위에 커버 슬립을 올려 커버 슬립과 슬라이드 사이에 틈을 만듭니다. 그런 다음 폴리에틸렌 튜브의 한쪽 끝을 1ml 주사기에 연결하고 튜브의 다른 쪽 끝을 챔버 바로 옆에 놓습니다.

테이프로 튜브를 제자리에 고정하여 플렉시글라스 챔버가 있는 이미징 챔버를 조립합니다. 두 개의 폴리에틸렌 튜브 주위에 실리콘 그리스의 얇은 층을 펴고 코팅된 튜브를 플렉시 유리 챔버의 각 측면에 있는 채널로 누릅니다. 그런 다음 튜브 홈이 포함된 챔버 표면에 실리콘 그리스의 얇은 층을 펴고 그리스에 커버 슬립을 놓아 챔버 개구부의 한쪽 면을 밀봉합니다.

다음으로, 접시에서 5 일 된 묘목을 챔버로 옮기고 묘목 위에 물에 적신 면봉 조각을 놓습니다. 챔버의 다른 표면에 실리콘 그리스를 펴고 상단의 다른 덮개 슬립을 눌러 밀봉합니다. 그런 다음 튜브 중 하나의 끝을 1ml 주사기에 연결하고 다른 튜브의 끝을 열어 둡니다.

챔버 커버 유리가 있는 이미징 챔버를 준비하려면 먼저 챔버 커버 유리를 70% 에탄올로 멸균하고 0.6ml 또는 0.2밀리리터의 최대 강도 MS로 건조될 때까지 후드에 그대로 둡니다. 2개의 우물 약실 8개의 우물 약실의 각 우물에 각각 1%sucrose와 0.5%fighter 젤을 포함하는 매체. 그런 다음 씨앗을 살균하고 투명한 젤의 얇은 층이 들어있는 챔버 덮개 유리에 직접 뿌리고 5 일 동안 수직으로 자라게하십시오. 이미지 획득용.

컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 획득하기 직전에 200마이크로리터의 150밀리몰 염화나트륨, 얼음물 또는 1밀리몰의 과산화수소 용액을 챔버에 천천히 주입하여 응력 자극을 가합니다. 자극 용액을 도포한 직후 이미지를 캡처합니다. 20배 침수 렌즈가 있는 도립 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용합니다.

각각 4 88 나노미터 및 500 - 550 나노미터의 여기 및 방출 파장과 5 12 x 5 12의 AIX 해상도 또는 Nikon 요소를 사용한 이미지 분석을 사용하여 4초 간격으로 이미지의 시계열을 수집합니다. ROI는 관심 있는 각 셀 주위에 그려집니다. 각 ROI 내의 총 강도는 시간 측정 대화 상자를 사용하여 시간 경과에 따라 측정됩니다.

그런 다음 총 강도 측정값을 내보내고 표시된 데이터 그래프로 처리합니다. 다음은 10일 묘목의 공간적 시간적 칼슘 반응을 비교한 것입니다. 여기서 다양한 응력 자극은 발광의 시계열, 400 밀리몰 만니톨 및 400 밀리 몰 올레, 1 밀리몰 구리 클로라이드, 75 밀리몰 염화나트륨 및 75 밀리몰 염화나트륨, 1 밀리몰 구리 클로라이드 및 1 밀리몰 과산화수소 또는 1 밀리몰 과산화물 및 1 밀리몰 구리 클로라이드.

상부 및 하부 패널은 각각 처음 40초 및 두 번째 40초 동안 획득된 발광 이미지입니다. 그리고 다음은 여기에 세포질 및 핵 칼슘 진동으로 표시된 표시된 응력 자극에 대한 묘목의 평균 발광 강도를 보여주는 막대 차트입니다. 염분 스트레스에 대한 반응으로, 컨포칼 이미지는 사례 12가 사례 12를 발현하는 형질전환 식물의 뿌리 세포와 핵 및 잎 세포에서 발현됨을 보여줍니다.

이 이미지는 엽록체의 빨간색, 자가형광 및 사례 12의 녹색 형광의 이미지로 나타납니다. 이 두 플롯은 뿌리 세포의 핵인 세포질(cytosol)에서 염 스트레스에 의한 칼슘 진동을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 잘 자란 묘목을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 세포 수준과 전체 식물 수준 모두에서 다이나스를 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.