정상과 병에 걸린 미국에서 혈병 구조를 조사하기위한 실험 및 이미징 기술

이 절차의 전반적인 목표는 당뇨병과 겸상 적혈구 빈혈에서 발생하는 비정상적인 혈전 구조의 형태학적 차이를 조사하는 것입니다. 이는 겸상 적혈구 환자의 혈액 샘플에 대한 컨포칼 현미경 검사로 당화 혈전 구조를 이미징하여 수행됩니다. 적혈구를 포함하는 피브린 혈전은 실시간 컨포칼로 이미지화됩니다.

그런 다음 현미경 분석을 수행하여 정상 및 당화 혈전 구조에 대한 섬유소 용해 속도를 평가할 수 있습니다. 궁극적으로 이 실시간 분석은 비정상적인 혈전 구조가 발생하는 질병 상태에 대한 반응으로 발생하는 형태학적 차이를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 당뇨병 또는 겸상 적혈구 질환 환자에서 피브린 응고 구조가 어떻게 다른지와 같은 혈전증 및 지혈 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

컨포칼 현미경으로 모의 당뇨병 혈전을 평가하기 위해, 먼저 인간 피브리노겐과 피브리노겐 접합체를 혼합한 온난화 용액이 포도당 trics 염화나트륨 용액에 혼합될 때 인간 피브리노겐 및 10% 형광 표지된 인간 피브리노겐 접합체를 해동하고 섭씨 37도의 수조에서 48시간 동안 빛으로부터 보호된 용액을 배양합니다. 배양이 거의 끝날 무렵, 비액체 기반 접착제를 사용하여 유리 현미경 슬라이드의 양면에 얇은 접착제를 부착하여 챔버를 만든 다음 피브리노겐 용액과 실온 인자 13 및 트롬빈을 혼합하여 최종 부피 50마이크로리터까지 만들고 즉시 30마이크로리터의 피브린 용액을 현미경 슬라이드 챔버로 옮깁니다. 이제 접착제 위에 15mm 두께의 22 x 22mm 유리 커버 슬립을 놓고 접착제가 응고와 상호 작용하지 않도록 주의하면서 챔버의 열린 면을 투명 접착제로 밀봉합니다.

피브린 혈전이 섭씨 21-23도에서 2시간 동안 중합되도록 합니다. 그런 다음 40 x 대물렌즈와 488 나노미터 아르곤 레이저를 사용하여 혈전의 컨포칼 현미경 이미지를 획득하여 겸상 적혈구 환자의 혈전을 평가합니다. 먼저 적혈구 샘플을 무혈청 세포 배양 배지에서 밀리리터당 100만 개의 세포로 희석하고, 부드러운 피펫팅으로 세포를 5마이크로리터의 적절한 세포 표지 용액과 혼합합니다.

섭씨 37도에서 20분 후, 세포가 원심분리기에 있는 동안 갓 준비한 피브리노겐 용액 인자 13과 트롬빈을 혼합하여 방금 설명한 대로 섭씨 37도 매체에서 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 10마이크로리터의 표지된 적혈구를 피브린 용액으로 옮기고 즉시 30마이크로리터의 세포 용액을 접착 챔버에 분배합니다. 유리 현미경 슬라이드에서 피브린이 2시간 후 섭씨 21-23도에서 중합되도록 하고, 488나노미터 및 633나노미터 파장의 여기 레이저를 사용하여 혈전의 컨포칼 이미지를 획득하여 각각 형광 표지된 피브린과 적혈구를 여기시킵니다.

섬유소 용해 속도와 당화 혈전 구조를 평가하기 위해 먼저 이번에 시연된 것처럼 당화 혈전을 준비합니다. 그러나 피브린 응고 용액을 접착 챔버에 분배한 후에는 챔버의 끝을 밀봉하지 마십시오. 대신, 혈전이 섭씨 21도에서 23도까지 250ml의 물이 들어 있는 밀폐된 인클로저에서 중합되도록 하여 탈수를 방지하십시오.

1시간 30분 후, 방금 시연한 대로 컨포칼 현미경으로 혈전 이미지를 획득합니다. 그런 다음 25마이크로리터의 플라스민을 챔버의 열린 끝단에 피펫으로 넣고 플라스민이 모세관 작용에 의해 혈전 전체로 분산되도록 합니다. 마지막으로 컨포칼 현미경 소프트웨어의 시계열 기능을 열고 획득 모드를 클릭한 다음 시계열을 선택합니다.

그런 다음 사이클 수와 기록 시간 간격을 선택하여 정상 및 당화 혈전의 플라스민 유도 응고 용해 분석의 실시간 비디오 영상을 캡처하면 혈전 중합 중에 인자 13을 추가하거나 추가하지 않은 경우 모두 당화 응고가 정상 혈전보다 더 조밀하고 공극이 더 작다는 것을 알 수 있습니다. 실제로, UN 당화혈전(glycated clots)에서는 피브린 농도가 낮은데, 이는 당화혈전(glycated clots)에서 관찰된 것보다 밀도가 낮은 구조를 생성하며, 당화혈전(glycated clots)은 더 높은 피브린 농도를 가지고 있습니다. 겸상 적혈구 환자의 피브린 혈전은 적혈구를 포함하고 있으며, 이러한 환자의 피브리노겐 농도가 증가하기 때문에 건강한 피브린 혈전보다 더 밀도가 높은 구조를 보입니다.

또한, 겸상 적혈구 환자의 적혈구가 응집체와 성별, 즉 섬유소 네트워크에 얽힌 적혈구 덩어리를 형성하는 자연스러운 경향으로 인해 정상 환자에서 관찰되는 것과 형태가 현저히 다른 비정상적인 응고 구조가 형성됩니다. 마지막으로, 정상 혈전과 당화 혈전의 섬유소 용해 속도를 분석한 결과, 충분한 플라스민이 없을 경우 시뮬레이션된 당뇨병 혈전이 피브린을 생성하는 능력이 현저히 손상되었음을 알 수 있습니다. 이 연구는 혈전증 및 지혈 분야의 연구자들, 특히 겸상 적혈구 질환 및 당뇨병의 결과로 동반 질환이 발생하는 환자를 위한 길을 닦는 데 도움이 될 것입니다.