플라스미드 벡터를 생성 깁슨 어셈블리를 사용하여 인간의 신장 요인-1α의 발기인의 규정에 따라 FLAG-태그 단백질을 표현

이 절차의 전반적인 목표는 Gibson 어셈블리 접근 방식을 사용하여 여러 DNA 소스의 짧은 세그먼트와 긴 세그먼트를 결합하는 크고 복잡한 DNA 구조를 만드는 것입니다. 먼저 플라스미드의 완전한 뉴클레오티드 염기서열을 계산적으로 설계한 다음 중첩되는 프라이머 세트를 설계합니다. 다음 조립 반응을 위한 DNA 템플릿은 PCR에 의해 증폭됩니다.

다음으로, PCR 산물의 정제를 수행한다. 마지막 단계는 생성된 플라스미드의 조립 반응 변형 및 플라스미드 클론 검증입니다. 궁극적으로, Gibson 어셈블리 반응은 human elongation factor one alpha promoter의 transcriptional regulation 하에서 야생형 및 돌연변이 CSTF 64 단백질의 플래그 태그 버전을 포함하는 병렬 플라스미드에서 개발하기 위해 사용됩니다.

기존 DNA Corning과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 순차적인 Corning 단계 없이 유사한 설계, 야생형 및 돌연변이 플라스미드를 병렬로 생성할 수 있다는 것입니다. 최종 플라스미드를 나타내기 위해 연속 뉴클레오티드 염기서열을 설계합니다. 이제 PCR 순서에서 템플릿으로 사용될 실제 플라스미드 및 DNA 단편을 나열하십시오.단일 또는 다중 합성 이중 가닥 DNA 단편으로 태그 및 프로모터의 다양한 조합과 같이 쉽게 구할 수 없는 DNA 단편

다음으로, 최종 작제물의 연속 뉴클레오티드 서열을 PCR에 적합한 DNA 단편으로 분할한다. 단편이 사용 가능한 플라스미드 및 합성 DNA 단편과 일치하는지 확인합니다. 200개의 뉴클레오티드보다 작은 DNA 단편은 피하십시오.

primer generation 도구에 액세스하려면 change Gibson assembly settings(Gibson 어셈블리 설정 변경) 팝업 창에서 set preferences(기본 설정 지정) 메뉴를 선택합니다. change pres 탭을 선택한 다음 build construct 메뉴를 선택하여 primer generation tool에 split DNA fragments를 5 prime에서 three prime end까지 순차적으로 삽입합니다. enter vector 또는 insert fragment 창을 열고 벡터 DNA의 5개 프라임 끝을 나타내는 첫 번째 DNA 단편을 fast A 형식으로 붙여넣고 이 DNA 단편의 이름을 지정합니다.

DNA 단편을 얻기 위한 적절한 방법을 선택하십시오. 그런 다음 계속 탭을 클릭합니다. 최종 구조체의 접합부에 추가 뉴클레오티드 또는 제한 부위를 추가해야 하는 경우, 정방향 또는 역방향 프라이머 스페이서 영역의 어셈블리 창에 대한 추가 및 삽입 단편을 엽니다.

여분의 뉴클레오티드 또는 제한 부위를 DNA 단편 중 하나에만 입력합니다. 그런 다음 완료 탭을 클릭합니다. 구문이 완료될 때까지 모든 조각에 대해 반복합니다.

view primers(프라이머 보기) 메뉴를 선택하고 primer sequence를 검토합니다. 또한 모든 구성물, 벡터, 백본 및 삽입물 또는 다른 DNA 단편에 대해 반복합니다. PCR 프라이머를 물 또는 te buffer에서 10마이크로몰로 희석합니다.

그런 다음 PCR에 대한 모든 DNA 템플릿과 단일 가닥 합성 DNA를 물 중 마이크로리터당 1나노그램으로 희석합니다. 각 프라이머의 10마이크로몰 2.5마이크로리터를 결합하여 실온에서 PCR 반응을 조립합니다. 1 마이크로 리터 템플릿 당 1 나노 그램의 DNA 단편 25 마이크로 리터의 뜨거운.

DNA 중합효소와 19마이크로리터의 물 교정을 시작합니다. 부드럽게 튕겨 튜브를 혼합하고 간단한 원심분리로 액체 방울을 수집합니다. 사용된 DNA 중합효소에 대한 권장 사항에 따라 유사한 크기의 DNA 단편을 별도의 튜브에서 동시에 증폭합니다.

25-28회의 PCR 사이클을 수행하거나 충분한 DNA 수율을 생성하는 사이클 수를 결정합니다. 표준 AROS 겔 전기영동을 사용하여 5마이크로리터의 PCR을 분리합니다. PCR 산물을 나타내는 단일 DNA 밴드가 보이는지 확인합니다.

필요한 경우 DNA 분자량 표준을 사용하여 DNA 단편의 크기와 상대적인 양을 결정하고 PCR을 반복하여 충분한 양의 DNA 단편을 얻습니다. DPN 1로 사전 분해된 PCR을 1.5ml 튜브로 옮기고 각 튜브에 81마이크로리터의 DNA 정제 마그네틱 비드를 추가합니다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다.

튜브를 자기 수집기에 2분 동안 놓습니다. 이제 맑은 액체를 버리십시오. 200마이크로리터의 80% 에탄올로 30초 동안 두 번 세척합니다.

그런 다음 건조된 비드를 10 밀리몰 트리스 하이드로클로라이드 pH 8.0 10 마이크로리터에 재현탁 2분 후 잠시 회전시킨 다음 튜브를 자기 수집기에 2분 동안 놓습니다. 8.5-10마이크로리터의 투명 용액을 제거하고 사전 라벨링된 새 튜브에 넣습니다. UV 분광법으로 DNA 단편의 농도를 측정합니다.

벡터 골격을 나타내는 DNA 단편 또는 선택적 마커를 운반하는 DNA 단편을 최소 100나노그램 사용합니다. 삽입물로 사용될 DNA 단편에 대한 3배 몰 초과를 계산합니다. PCR 튜브에 계산된 양의 DNA 단편을 혼합합니다.

그런 다음 볼륨을 10마이크로리터로 조정합니다. Gibson 어셈블리 마스터 믹스 10마이크로리터를 추가합니다. PCR 열 순환기에서 섭씨 50도에서 반응을 배양합니다.

조립 제품이 무능한 대장균의 변형을 진행하거나 필요할 때까지 제품을 섭씨 영하 20도에서 동결합니다. 화학적 또는 전기 적격성 셀에 수반되는 형질전환 절차를 따르십시오. 일반적으로 형질전환 반응당 2마이크로리터의 조립 반응을 사용합니다.

마지막으로, 특이적 또는 표준형 프라이머를 이용한 DNA 염기서열분석으로 DNA 클로닝 성공을 확인합니다. 정확성을 위해 염기서열분석 데이터를 분석합니다. 이 실험은 절단 자극 인자 단백질 64 및 돌연변이 CSTF 64를 복제하도록 설계되었습니다.

단백질은 HE F1 알파 프로모터의 발현 조절에 따라 3개의 x 플래그 태그에 융합되었습니다. HE F1 알파와 3 x 플래그 태그를 포함하는 플라스미드는 사용할 수 없었습니다. 그러나, 다음과 같은 플라스미드를 이용할 수 있었다.

PC DNA, 3.1 M 히스, HF, 플라스미드를 함유 한 알파 1 개 및 마우스 CSTF 64 플라스미드. 구조체에 대한 전체 염기서열은 뉴클레오티드 및 텍스트 편집 응용 프로그램을 사용하여 조립되었습니다. 그 후, 염기서열을 이용 가능한 플라스미드 DNA에 해당하는 4개의 편리한 조각으로 분할했습니다.

조립 반응을 위한 4개의 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켰습니다. 개별 클론으로부터 생성된 플라스미드를 증폭하고 PC DNA 벡터로의 적절한 조립을 위해 제한 효소 분해에 의해 분석한 다음, Select 클론을 염기서열분석에 의해 검증하였다. 플라스미드 및 1차 설계를 포함한 조립 기술을 마스터하면 1차 및 합성 DNA 합성 및 전달 시간을 제외하고 5일 이내에 후속 PCR 및 통신 검증을 수행할 수 있습니다.