고화질 푸리에 병리학 개선으로 인체 조직 섹션의 적외선 (FT-IR) 분광 이미징 변환

Fourier Transform Infrared(FT-IR) 분광 이미징은 세포 및 조직의 생화학적 데이터 세트를 얻을 수 있는 빠르고 라벨이 없는 접근 방식입니다. 여기에서는 질병 진단을 개선하기 위해 조직 절편의 고해상도 FT-IR 이미지를 얻는 방법을 보여줍니다.

이 절차의 전반적인 목표는 조직 샘플의 고화질 적외선 이미지를 얻는 것입니다. 이는 먼저 조직 샘플을 적외선 호환 슬라이드로 절단하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 적절한 대물렌즈를 설치하여 고화질 이미징 장치를 설정하는 것입니다.

다음으로, 기질의 배경을 수집하고 조직 샘플을 스캔합니다. 마지막 단계는 데이터 처리 및 시각화에 적합한 소프트웨어를 사용하는 것입니다. 궁극적으로, 고화질 적외선 이미징은 교란되지 않는 방식으로 생물학적 조직으로부터 생화학적 정보를 시각화하고 획득하는 데 사용됩니다.

광학 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 염료나 프로브를 사용하지 않고도 조직의 고유한 생화학을 연구할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 당뇨병성 신병증의 재발을 예측하고 HEPA 자동차 골형성을 통한 간 질환의 진행을 분류하는 것과 같은 현장 병리학에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 전통적인 조직 병리학에서 사용할 수 없는 방대한 양의 생화학적 정보를 제공한다는 점을 감안할 때 질병 진단 및 예후로 확장됩니다.

이 방법은 진단에 사용할 수 있습니다. 또한 상처 치유 과정의 변화를 추적하고 위장관 및 뇌의 줄기 세포와 같은 주요 조직 특징을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 공식 및 고정 파라핀 내장 조직의 첫 번째 섹션은 마이크로톰을 사용하여 IR 호환 슬라이드에 4마이크로미터 두께로 차단됩니다.

이것에 따라. 건조한 공기를 사용하여 FTIR 현미경 및 분광계를 퍼지하여 시스템에서 대기의 수분을 제거합니다. 그런 다음 액체 질소를 사용하여 현미경에서 초점면 어레이 검출기와 내부 수은 카드뮴 텔루라이드 검출기를 모두 냉각하고, 가시광선이 켜져 있는지 확인한 후 FTIR 이미징을 위해 현미경 스테이지에 샘플 슬라이드를 장착하고, 샘플 캡처 프로그램을 사용하여 샘플에 초점을 맞춥니다.

그런 다음 번들 소프트웨어 패키지를 열고 수집을 클릭합니다. 진단을 클릭하고 선 분광계를 선택합니다. 그런 다음 이미징 설정을 클릭하여 시스템을 보정합니다.

Optics 탭에서 왼쪽과 같이 detector를 ground microscope detector로 선택한 다음 optics mode에서 투과율을 선택합니다. 설정을 클릭하면 lancer control에서 전송 모드를 위한 lancer 제어 창이 열립니다. 스테이지 제어 조이스틱을 사용하여 원시를 클릭하고 FTIR Interferogram 이미지의 실시간 보기가 슬라이드의 깨끗한 영역으로 이동하는 것을 지켜보십시오.

이 시점에서 적분 시간을 약 8, 000 카운트로 조정하고 하단 콘덴서 대물렌즈를 조정합니다. 카운트 수를 최대로 늘리려면 랜서 컨트롤에서 오른쪽 하단 이미지의 모양을 관찰하여 모양이 가우시안이고 상대적으로 균일한지 확인하십시오. 통합 시간을 조정한 후 다시 스테이지를 이동하여 구조가 있는 조직 조각, 가급적이면 조직의 가장자리를 찾습니다.

그런 다음 이미지의 초점을 완벽하게 만듭니다. 스테이지 제어 조이스틱을 사용하여 슬라이드의 깨끗한 곳으로 이동합니다. 선택 후 보정 버튼을 누릅니다.

좋아요, 두 번 광학 탭에서 detector equals MCT를 선택하고 microscope detector equals right를 선택합니다. 그런 다음 설정을 클릭합니다. FTIR 간섭도가 화면에 시각화되면 find center burst and okay를 클릭합니다.

Optics 탭에서 detector equals ground microscope detector equals left를 다시 선택합니다. 그런 다음 설정을 선택합니다. 이미지가 Lancer Control의 깨끗한 영역에 여전히 있는지 확인한 후 보정을 다시 클릭하고 확인을 클릭합니다.

배경 FTIR 이미지를 수집하려면 electronics(전자) 탭으로 이동하여 일반적으로 4cm 또는 8cm의 적절한 스펙트럼 해상도를 선택합니다. 티슈의 경우 배경 탭으로 이동하여 스캔에 128을 입력하여 coad합니다. 새 파일 단추를 선택하고 배경 파일을 적절한 폴더에 배치합니다.

배경을 클릭하고 스캔이 완료될 때까지 기다린 후 파일을 저장할 위치를 확인합니다. 배경의 영역, FTIR 이미지를 클릭하고 스펙트럼을 확인합니다. 이 시점에서 설정을 클릭하고 lancer control에서 라이브 IR 보기를 사용합니다.

관심 영역을 찾으려면 electronics(전자) 탭으로 이동하여 코드화할 스캔 수를 입력합니다. 그런 다음 스캔을 클릭합니다.고해상도 분석을 위해 FTIR 현미경을 준비하려면 15 x 대물렌즈 대신 고배율 대물렌즈를 나사로 고정합니다. 이 시점에서 이미지 처리 및 분석 소프트웨어를 열고 IR 데이터 파일을 로드합니다.

스펙트럼 도구를 선택하여 IR 데이터에 baseline correction 알고리즘을 적용하고 아래로 스크롤하여 absorbent spectra를 클릭합니다. 팝업 메뉴가 나타나면 기준선 보정을 선택합니다. absorbent spectra 메뉴 옵션에서 normalized spectra를 선택하여 스펙트럼 정규화를 수행합니다.

그런 다음 이미지 내에 수집된 모든 IR 주파수 목록을 관찰합니다. 특정 생체 분자에 해당하는 주파수를 클릭하여 선택한 주파수에서 조직의 이미지를 관찰하여 다양한 생체 분자 구성 요소를 시각화할 수 있는 이미지를 생성합니다. 스펙트럼 도구를 클릭한 다음 피크 높이 비율을 선택합니다.

IR 이미지와 함께 명시야 이미지를 캡처하는 별도의 전체 슬라이드 이미저 시스템을 사용하여 해당 인접한 염색 조직 섹션을 스캔합니다. 가시 이미지 프로그램으로 염색된 조직의 디지털 이미지를 불러옵니다. 그런 다음 관심 영역에서 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Z 프로필을 선택하여 선택한 픽셀에서 스펙트럼 정보를 제공합니다.

이미지의 특정 픽셀을 표시하려면 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 ROI 도구를 선택합니다. 레이블을 지정할 클래스(예: Meum 및 Bowman의 캡슐 클래스)를 만듭니다. 그런 다음 ROI 유형 포인트를 선택하고 픽셀을 선택할 클래스를 선택하고 IR 이미지에 적절한 픽셀을 그립니다.

평균 ROI 툴을 사용하여 각 클래스의 평균 스펙트럼을 도출합니다. 마지막으로, 플로팅을 통해 도출된 스펙트럼을 비교합니다. 그래프 작성 소프트웨어에서 FT IR 이미징을 사용하면 IR 주파수에 따라 다른 대비를 제공할 수 있는 조직의 IR 이미지를 유도할 수 있습니다.

모든 픽셀은 세포 유형 또는 질병 상태의 생화학적 특성에 대한 정보를 제공할 수 있는 서로 다른 생체 분자에 해당하는 서로 다른 피크가 있는 전체 스펙트럼으로 구성됩니다. FTIR 기기는 불투명 조리개를 사용하는 단일 포인트 매핑 모드에서 측정하는 것에서 투과 모드의 수집 대물렌즈와 결합된 조명 대물렌즈 또는 반사 모드에서 조명과 수집을 모두 수행하는 단일 대물렌즈를 사용하는 CASA 그레인 대물렌즈를 사용하는 이미징 모드로 발전했습니다. 조직 이미징을 위한 공간 해상도의 발전은 이제 세포 유형과 조직 구조를 식별할 수 있기 때문에 매우 중요해졌습니다.

이 경우, 신장 사구체 기능 단위가 간 조직 코어에서 관찰되었습니다. 간세포와 침윤 섬유증 영역을 시각화하는 것이 가능하며, 이는 이형성증과 비이형성 간경변의 두 가지 뚜렷한 영역을 나눕니다. 증가된 공간 해상도는 조직학적 변화가 뚜렷하기 전에 질병에 의해 화학적으로 변형될 수 있는 특정 구조적 특징을 격리할 수 있습니다.

Bowman's capsule, meum, glomerular basement membrane 및 tubular basement membrane과 같은 신장 사구체 구조의 생화학적 변화는 FTIR 이미징을 통해 확인할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 절차를 따르기 전에 스캔하기 전에 슬라이드를 완전히 제거하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 기존 면역화학 분석과 같은 다른 방법은 생화학적 서명과 조직 형태를 상관시키기 위해 동일한 조직 절편에서 수행할 수 있습니다.

우리의 첫 번째 개발인 이 기술은 조직 이미징 분야의 연구자들이 조직 내 작은 세포 유형과 구조의 생체 분자 상태를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 조직 샘플의 고화질 FTR 이미지를 얻고 기본 스펙트럼 분석을 수행하는 방법을 기본적으로 이해하게 될 것입니다. 액체 질소로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 극저온 안전 장갑 및 안전 고글과 같은 안전 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.