질량 분석은 동결 건조 분말에서 단백질의 구조와 상호 작용을 연구하는 접근

이 절차의 전반적인 목표는 질량 분석법과 결합된 수소 중수소 교환 및 측쇄 용해 표지를 방출하여 고해상도로 단백질의 구조를 모니터링하는 것입니다. 이것은 먼저 동결 건조, 다른 부형제의 존재 하에있는 단백질에 의해 달성됩니다. 고체 상태 수소 중수소 교환에서 동결 건조된 단백질은 제어된 상대 습도 및 온도 하에서 밀봉된 건조액의 중수소 산화물 증기에 노출됩니다.

용해성 표지를 위해, 단백질은 부형제와 광반응성 대리인으로 동결건조됩니다. 그런 다음 바이알에 UV 광선을 조사하여 약제를 단백질에 공유 결합합니다. 각 방법에 대해 샘플은 온전한 단백질과 펩타이드 수준의 분해능 모두에서 질량 분석기를 사용하여 재구성되고 분석됩니다.

이 두 가지 방법은 상호 보완적인 정보를 제공합니다. 단백질 구조가 많이 유지되는 제형은 중수소 흡수가 감소하고 용해 표지가 증가한 반면, 교란 구조를 가진 제형은 중수소 흡수가 증가하고 용해 표지가 감소한 것을 보여줍니다. 수소 중수소 교환 및 질량 분석 분석과 결합된 광 교차 연결과 같은 화학적 라벨링은 최근 활발한 지지체의 단백질 구조 및 상호 작용을 연구하기 위해 조정되었습니다.

CD 및 FDIR 분광법과 같은 기존 방법에 비해 이러한 기술의 주요 장점은 단백질 구조와 환경을 고체 상태에서 고해상도로 프로브할 수 있다는 것입니다. 시작하려면 건조제의 하단 구획에 200ml의 중수소 산화물을 넣고 400g의 탄산칼륨을 첨가하여 포화 용액을 만들려면 도자기 건조판을 내부에 놓고 건조제를 밀폐합니다. 섭씨 5도에서 평형을 이루어 43%에 가까운 안정적인 상대 습도에 도달하도록 한 다음, 동결건조된 단백질이 들어 있는 뚜껑이 없는 바이알을 건조제의 상단 구획에 놓고 건조제를 밀봉하고 섭씨 5도에서 배양합니다.

샘플을 수집하기 위해 수소 중수소 교환 반응을 시작하려면 건조제에서 바이알을 제거한 직후 바이알을 덮은 다음 바이알과 액체 질소를 급속 동결하여 반응을 소멸시킵니다. 질량 분광 분석이 이루어질 때까지 바이알을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 고분해능 질량 분석법을 사용하여 시료를 분석하여 후방 교환을 최소화합니다.

냉장 상자 안의 액체 크로마토그래피 시스템은 어떻게 작동하나요? 기기를 먼저 설정하려면 샘플 루프와 단백질 트랩을 탈염 및 용리 공정을 제어하는 밸브에 연결합니다. 다음으로, 저농도 튜닝 믹스를 질량 분석기에 주입하고 질량 대 전하 비율 범위를 200 대 3, 200으로 설정하여 시스템을 보정합니다.

그런 다음 냉장 시스템을 약 섭씨 0도의 안정적인 작동 온도로 냉각합니다. 물에 0.2%포름산과 5%메탄올을 함유한 담금질 완충액을 준비하고 얼음에 식힙니다. 샘플을 액체 질소로 옮긴 후 바이알을 조심스럽게 제거하고 2ml의 담금질 완충액을 첨가하여 샘플을 재구성합니다.

다음으로 적절한 HPLC 및 질량 분석법을 로드합니다. 여기에서 샘플을 분석하려면 단백질 트랩에서 20피코몰의 미오글로빈을 5%아세틸니트릴과 0.1%포름산으로 1.7분 동안 탈염합니다. 그런 다음 3.3분 구배에 걸쳐 단백질을 용리하여 80%의 아세토 니트릴과 0.1%의 포름산으로 증가시킵니다.

샘플을 주입하고 200 대 3, 200 질량 대 전하 비율 범위에서 질량 스펙트럼을 수집합니다. 원형(intact) 단백질의 질량을 기준으로 측정하려면 과도하게 평가된 단백질 샘플과 함께 동일한 방법을 사용하십시오. 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 스펙트럼을 디콘볼루션하여 단백질 질량을 얻습니다.미오글로빈 시료 분석의 경우 질량 범위를 15에서 18로, 킬로달톤의 질량 분해능을 1 Dalton으로, 피크 카이트를 90%로 설정합니다.펩타이드 분석의 경우 온전한 단백질과 동일한 프로토콜을 사용하여 샘플을 준비합니다.

샘플을 분석할 준비가 되면 고정된 pepin 컬럼과 분석 컬럼을 밸브에 연결하고 단백질 트랩을 펩타이드 트랩으로 교체합니다. 펩티드에 대한 시스템을 보정하는 것은 손상되지 않은 단백질에 대해 수행되었지만 질량 대 전하 비율 범위를 100에서 1700으로 설정하면 냉장 시스템을 약 0도의 안정적인 작동 온도로 냉각합니다. 시스템이 보정되면 적절한 HPLC 및 질량 분석 방법을 프로그래밍합니다.

여기에서 물 중 0.1% 포름산이 포함된 Pepin 컬럼의 미오글로빈 20피코몰을 10% 아세틸 니트릴 및 0.1% 포름산으로 펩타이드 트랩의 펩타이드를 1.7분 동안 포획 및 탈염하고 60% 아세틸 니트릴 및 0.1% 포름산으로 증가하는 구배로 4분 내에 펩타이드를 용출하는 방법을 프로그래밍합니다. 다음으로, 샘플을 주입하고 100 - 1700의 질량 대 전하 비율 범위에서 질량 스펙트럼을 수집합니다. 탠덤 질량 분석법으로 연대가 측정되지 않은 펩타이드 샘플을 분석하여 펩틱 단편을 식별합니다.

그런 다음 실험적으로 결정된 단편을 소프트웨어가 생성한 예측 질량으로 교차 확인합니다. 다음으로, 질량 컷오프를 10ppm으로 설정하여 일치하는 펩타이드에 대해 오류가 높은 질량을 제거합니다. 펩타이드 서열 전하 상태와 머무름 시간을 기록하십시오.

컴파일된 펩타이드 데이터를 사용하여 펩틱 단편당 통합된 평균 듀테로 수를 계산합니다.먼저 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 부형제 및 루신으로 단백질을 동결 건조합니다. 샘플을 준비한 후 365나노미터 UV 램프가 포함된 UV 가교제를 켭니다. 램프를 5분 동안 데우십시오.

램프가 따뜻해지면 램프를 끄고 제형이 들어 있는 뚜껑이 없는 바이알을 가교제 챔버 내부에 놓습니다. 샘플에 UV 광을 40분 동안 조사하고 조사 후 캡 캡을 사용하여 포토 류신이 없는 샘플을 대조군으로 포함하고 질량 분광 분석이 완료될 때까지 바이알을 섭씨 음의 20도에서 보관합니다. 질량 분석 등급의 증류수를 첨가하여 분석을 위한 시료를 준비하여 2마이크로몰의 최종 단백질 농도를 산출합니다.

다음으로, 온전한 중수소화 단백질과 동일한 질량 분석법을 사용하여 샘플을 분석합니다. 그러나 냉장 lc 시스템을 사용하지 마십시오. 표지되지 않은 단백질 샘플에 대한 질량 분석 데이터를 획득하여 단백질의 기본 질량을 측정합니다.

펩타이드 수준 분석을 위해 DERATED 샘플에 대한 데이터 분석을 수행합니다. 먼저, 온전한 단백질로 고체 상태 광지방 표지를 수행하고 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 다음으로, 100 millimolar ammonium bicarbonate buffer로 샘플을 재구성하여 10 micromolar의 최종 단백질 농도를 산출합니다.

샘플을 트립신과 단백질의 10:1 몰비로 혼합하고 이 혼합물을 섭씨 60도에서 16시간 동안 배양합니다. 그 동안 샘플 루프, 펩타이드 트랩 및 분석 컬럼을 HPLC 시스템 밸브에 연결합니다. 단백질을 소화한 후 물에 0.1%포름산을 첨가하여 반응을 억제하여 2마이크로몰의 최종 단백질 농도를 생성합니다.

다음으로 HPLC 및 질량 분석 방법으로 시스템을 프로그래밍합니다. 여기에서 펩타이드 트랩에 소화된 미오글로빈 20피코몰을 1.5분 동안 5% 아세토 니트릴과 0.1% 포름산으로 주입 및 탈염하고, 22분에 걸쳐 기울기를 55% 아세틸 니트릴로 증가시켜 펩타이드를 용리하고, 100에서 1700 질량 대 전하 비율 범위의 질량 스펙트럼을 수집합니다. 펩티드의 이론적인 질량을 산출하기 위하여 온라인 공구를 이용하십시오.

온전한 단백질 분석에서 이전에 얻은 사진 류신의 수를 사용한 사진 류신 부가물. 놓친 분열을 4개 이상 포함합니다. Excel에서 펩타이드 사진 류신 부가물에 대한 대량 목록을 만듭니다.

다음으로, 오류가 낮은 질량을 식별하기 위해 컷오프 포인트를 설정하여 이론적 질량 목록을 실험적으로 관찰된 질량과 일치시킵니다. 수소 중수소 교환 중에 단백질이 풀리면 수소를 중수소 단백질로 대체할 수 있으며, 중수소 단백질은 구조를 유지하여 중수소 교환에 덜 취약합니다. 탈로스 함유 및 소르비톨 함유 미오글로빈 제형에 대해 고체 상태 수소 중수소 교환 질량 분석을 수행했을 때, 소르비톨 함유 제형은 46% 더 큰 중수소 흡수를 보여주었으며, 이는 소르비톨의 미오글로빈 구조가 용해 과정 중에 더 교란된다는 것을 시사합니다.

사진: 류신, 접근 가능한 아미노산, 곁사슬에 대한 가교. 미오글로빈 제형을 함유하는 소르비톨 및 TLO의 고체 상태 광 용해 질량 분석 분석은 TLO 제형에서 다른 제품보다 더 많은 광암 흡수를 보여주었습니다. 이는 곁사슬이 TLO 제형에서 접근 가능한 상태로 남아 있음을 시사합니다.

수소 중수소 교환 및 용해성 라벨링은 모두 상업적으로 이용 가능한 영역과 쉽게 구할 수 있는 MS 기기를 사용하여 주어진 제형에 대해 고체 상태의 단백질을 특성화합니다. 시료 준비부터 데이터 분석 완료까지 총 시간 기록은 2주 미만입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 단백질 구조에 대한 고해상도 정보를 얻는 방법과 안정적인 동결건조 단백질 제형의 설계에서 단백질 구조의 중요성에 대해 잘 이해하게 될 것입니다.