주사 전자 현미경으로 간 사인 내피 세포의 분석 및 그들의 Fenestrations위한 표준화 된 방법

이 실험 절차의 전반적인 목표는 간 정현내피를 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 간을 적출하여 고정액으로 관류합니다. 그 다음, 전자 현미경 관찰 준비를 위해 간을 블록 형태로 절단하고 탈수 처리합니다.

그런 다음 간 샘플을 스퍼터 코팅하여 전자 현미경으로 관찰합니다. 마지막으로, 전자 현미경 사진을 분석하여 창냄(fenestration)의 직경과 빈도, 그리고 공극률(percent porosity)을 계산합니다. 최종적으로, 전자 현미경을 통해 다양한 조건에서 간 sinusoidal 내피세포의 변화를 확인합니다.

이 방법은 간 혈관 내피의 미세 구조와 형태에 대한 통찰을 제공합니다. 동일한 방식으로 신장과 뇌를 검사하는 데에도 사용할 수 있습니다. 동물 사용과 관련된 모든 절차는 지역 법규에 따라 수행되었습니다. 본 연구는 시드니 지역 보건구(Sydney Local Health District) 동물 복지 위원회의 승인을 받았습니다.

허용된 절차는 프로젝트 라이선스 문서에 기술되어 있으며, 항상 동물의 복지를 보장하는 가이드라인을 따릅니다. 본 실험은 비생존 수술입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 고정액을 준비한 후, 관류 완충액과 고정액을 35 to 37 °C로 가온합니다.

케타민과 자일라진을 복강 내에 단일 투여하여 동물을 마취시킨 후, 뒷다리 회수 반응과 꼬리 꼬집기로 진정 수준을 평가합니다. 다음으로, 뭉툭한 가위를 사용하여 동물의 복부에 Y자 절개를 넣어 간과 문맥을 노출시킵니다. 그런 다음 문맥의 간 근위측과 원위측에 매우 느슨하게 두 개의 봉합사를 묶습니다.

적절한 크기의 IV 캐뉼라로 문맥에 캐뉼라를 삽입합니다. 그런 다음 봉합사를 조여 캐뉼라를 고정합니다. 이제 37 °C로 데운 PBS 5~20 mL를 사용하여 10 cm H2O의 압력으로 관류를 시작합니다.

간에 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하십시오. 공기 방울은 아티팩트를 유발하고 공기압을 과도하게 높여 간을 손상시킬 수 있습니다. 완충액이 간에서 자유롭게 배출될 수 있도록 복강 및 흉강 정맥을 절단하십시오. 이를 통해 높은 배압과 간, 정현혈관 및 내피세포 또는 LCC의 손상을 방지할 수 있습니다. 간에서 혈액이 모두 제거되면 PBS를 전자현미경(EM) 고정액으로 교체하고, 간이 단단해지고 매우 창백해질 때까지 관류하십시오.

약 5분 동안 기다립니다. 그 후 메스를 사용하여 간을 1~2 立方밀리미터(cubic millimeter) 크기의 블록으로 절단합니다. 고정액을 사용하여 후고정합니다.

조직을 4°C에서 24~72시간 동안 고정합니다. 그 다음 조직을 0.1 M sodium Cate 완충액으로 옮겨 4°C에서 최대 12개월 동안 보관하여 주사 전자 현미경(SEM) 관찰을 위한 시료를 준비합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 시료를 탈수시킨 후, 해부 현미경 하에서 금속 SEM 스텁의 바닥면에 라벨을 붙이고 스텁 상단에 양면 탄소 테이프를 부착하며, 시료를 관찰하여 SEM 관찰에 가장 적합한 sinusoidal 표면을 확인합니다.

레이스(Lace)의 선택된 표면이 스터브의 카본 테이프 표면을 향하도록 놓은 뒤, 스터브에 단단히 부착합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 스퍼터 코팅과 SEM을 수행한 후, Image J에서 이미지를 열고 사진에 내장된 스케일 바를 사용하여 스케일을 설정합니다. Image J의 폴리곤 도구를 사용하여 창내피세포(LSEC)의 창(fenestrae)이 있는 영역과 없는 영역을 모두 포함한 전체 평면 영역을 따라 외곽선을 그립니다. 이때 창을 가릴 수 있는 세포 표면의 큰 파편들은 제외합니다. 창의 직경을 측정하려면 라인 도구를 선택하여 각 창의 가장 긴 직경을 가로지르는 선을 긋습니다.

M을 눌러 선을 측정하고, D를 눌러 사진에 선을 영구적으로 그립니다. 이 선은 창(fenestration)의 직경으로 정의되며, 이제 Image J의 결과 상자에서 확인할 수 있습니다. 250 nanometers보다 큰 LSEC 세포질 내의 큰 구멍인 gap과 창(fenestration)을 모두 측정하십시오. 원형이 아닌 gap의 경우, 그 둘레를 따라 추적하고 Image J를 사용하여 면적을 계산한 뒤, Image J 결과 상자의 데이터를 Excel 스프레드시트로 옮겨 면적을 산출하십시오.

추가 분석을 위해, 창냄(fenestration) 계산을 수행할 때 다음 공식을 사용하십시오. 평균 창냄 직경은 모든 창냄 직경의 평균값과 같습니다. 창냄 면적은 pi r²이며, 여기서 R은 개별 창냄 직경으로부터 계산됩니다.

공극률 백분율은 σπR²를 분석된 총 면적(µm²)으로 나눈 값에 100을 곱하여 계산하며, 이때 간극(gap)의 합산 면적은 계산에서 제외합니다. 출판물에 데이터를 제시할 때는 창공(fenestration) 직경을 포함하고, 창공을 정의하기 위해 경계 직경을 사용했다는 설명과 함께 창공 빈도 및 공극률을 기재하십시오. 또한 분석에 간극이 포함되었는지 여부를 확인하는 문구와 창공 직경의 빈도 분포 그래프, 분석된 간 블록의 수 및 이미지를 함께 포함하십시오. SEM 저배율 관찰 시, 여기에서 보이는 바와 같이 문맥(portal tract)과 중심정맥(central vein)을 포함하여 다수의 대형 간 혈관과 동양혈관(sinusoids)을 관찰할 수 있을 만큼 충분히 넓은 면적이 노출된 간 표본의 평평한 표면이 나타납니다.

마운팅 스터브에 간 블록을 정확하게 배치하는 것은 혈관강(sinusoids)의 선명한 이미지를 얻는 데 필수적이며, 간 혈관강의 모든 세부 사항을 가리는 반짝이는 캡슐(glistening capsule)이 생기지 않도록 주의해야 합니다. 이러한 이유로, 여기에서 보여주는 것과 같이 고배율을 사용하면 LSEC 창공(fenestrations)을 관찰할 수 있습니다. 간세포판(plates of hepatocytes)이 혈관처럼 보일 수 있으나, BLI와 같은 특징들이 방향 설정에 도움을 줍니다.

이 그림은 높은 관류 압력이 LSEC SIV 판의 융합으로 인해 발생하는 것으로 생각되는 내피세포의 큰 틈과 같은 인위적 결과물(artifact)을 유발할 수 있음을 보여주며, 이는 SEM 하에서 쉽게 식별할 수 있습니다. 핵 바로 위의 세포막을 피함으로써 LSEC 표면 아래의 돌출부로 보일 수 있는 부분을 제외하면, 창공 밀도 및 공극률 계산의 정확도를 높일 수 있습니다. 마지막으로, LSEC 창공의 직경, 밀도 및 빈도를 정량화하면 창공에 대한 경험적 측정이 가능하며, 노화, 질병, 독소 또는 치료법에 의해 유도된 변화를 측정할 수 있습니다. 관류 절차 후, 조직은 세포 미세 구조 및 미토콘드리아 구조를 관찰하기 위해 투과 전자 현미경과 같은 다른 기술을 위한 처리 과정을 거칠 수 있습니다.

또한 조직학 연구에도 사용할 수 있습니다.