주사 전자 현미경으로 간 사인 내피 세포의 분석 및 그들의 Fenestrations위한 표준화 된 방법

이 절차의 전반적인 목표는 간 정현파 내피를 분석하는 것입니다. 이것은 먼저 간을 분리하고 고정제로 관류함으로써 이루어집니다. 다음으로, 간을 블록으로 자르고 탈수하여 전자 현미경을

그런 다음 간 샘플을 스퍼터 코팅하고 전자 현미경으로 검사합니다. 마지막으로, 전자 현미경 사진을 분석하고 창호 직경과 빈도 및 다공성 비율을 계산합니다. 궁극적으로 전자 현미경은 다양한 조건에서 간 정현파 내피의 변화를 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법은 내피에 있는 간 혈관의 초구조와 형태에 대한 통찰력을 제공합니다. 또한 같은 방식으로 신장과 뇌를 검사하는 데 사용할 수 있습니다 : 동물 사용과 관련된 모든 절차는 현지 법률에 따라 수행됩니다. 이 작업은 시드니 지역 보건 지구 동물 복지 위원회(Sydney Local Health District Animal Welfare Committee)의 승인을 받았습니다.

허용된 절차는 프로젝트 허가 문서에 설명되어 있으며 항상 동물의 복지를 보장하는 지침을 따릅니다. 이것은 생존이 불가능한 수술입니다. 정착제를 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 관류 완충액과 정착제를 섭씨 35-37도에서 가열합니다.

케타민과 자일라진을 복강내 1회 주사하여 동물을 마취한 후 뒷다리 철수와 꼬리 꼬집기로 진정 수준을 평가합니다. 다음으로, 끝이 뭉툭한 가위로 동물의 복부를 Y로 절개하여 간과 문맥을 노출시킵니다. 그런 다음 문맥 주위에 두 개의 매우 느슨한 봉합사를 묶는데, 하나는 간 근위부에 있고 다른 하나는 간 원위

적절한 크기의 IV 캐뉼라로 문맥을 캐뉼라화합니다. 그런 다음 봉합사를 조여 캐뉼라를 고정합니다. 이제 섭씨 37도까지 따뜻한 5-20 밀리리터의 PBS를 사용하여 10 센티미터의 H2O 압력에서 관류를 시작합니다.

간으로 유입되는 기포를 피하십시오. 이는 인공물을 생성하고 너무 높은 기압으로 인해 간을 손상시키고 복부 및 흉부 대정맥 CVA를 절단하여 완충 장치가 간에서 자유롭게 빠져나갈 수 있도록 합니다. 이는 높은 배압, 간, 정현파 및 내피 세포 또는 LCC의 손상을 방지합니다. 간에 혈액이 없어지면 PBS를 전자 현미경 또는 em, 고정액 및 관류로 대체하여 간이 굳어지고 매우 창백해질 때까지 관류합니다.

약 5분. 그런 다음 메스로 간을 1-2입방 밀리미터 블록으로 자릅니다. em 고정제를 사용하여 게시하십시오.

조직을 섭씨 4도에서 24-72시간 동안 고정합니다. 그런 다음 조직을 0.1몰 나트륨 케이트 완충액으로 옮기고 최대 12개월 동안 섭씨 4도에서 보관하여 주사 전자 현미경 또는 SEM용 검체를 장착합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 탈수한 후 금속 SEM 스텁의 바닥에 라벨을 붙이고 해부 현미경으로 스텁 상단에 양면 탄소 테이프를 바르고 샘플을 시각화하여 SEM에 가장 적합한 정현파가 있는 표면을 식별합니다.

레이스, 스텁의 탄소 테이프 표면을 향하게 선택한 표면으로 스텁에 단단히 붙입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 스퍼터 코팅 및 SEM을 수행한 후, 이미지 J의 이미지를 열고 그림에 포함된 스케일 바를 사용하여 이미지 J 트레이스의 다각형 도구를 사용하여 페네스트레이트 및 페네스트레이트 영역을 포함한 LSEC의 전체 평면 영역 주위를 스케일로 설정하고, 펀즈넥트레이션을 가릴 수 있는 셀 표면에 있는 큰 파편을 제외합니다. 창호 지름을 측정하려면 선 도구를 선택하여 각 창호의 가장 긴 지름을 통해 선을 배치합니다.

M을 눌러 선을 측정하고 D를 눌러 그림에 선을 영구적으로 그립니다. 이 선은 창호 직경으로 정의되며 이제 이미지 J.Measure의 결과 상자에서 사용할 수 있습니다.250나노미터 이상의 LSEC 세포질의 더 큰 구멍인 모든 갭과 창공을 측정합니다. 갭 주위를 추적하고 이미지 J를 사용하여 이미지 J의 결과 상자에서 Excel 스프레드시트로 데이터를 지나는 면적을 계산하여 원형이 아닌 갭의 면적을 계산합니다.

추가 분석을 위해 다음 공식을 사용하여 창호 계산을 수행하십시오. 평균 창호 직경은 모든 창호 직경의 평균과 같습니다. 창호 면적은 파이 r 제곱과 같으며, 여기서 R은 개별 창호 직경에서 계산됩니다.

다공성 백분율은 분석된 총 면적에 대한 시그마 파이 R 제곱과 같고 미크론에 100을 곱한 값은 이 계산에서 갭의 총 면적을 제외합니다. 간행물에 데이터를 제시하기 위해 창공 직경과 함께 창공 직경, 창호 빈도 및 다공성을 정의하는 데 경계 직경이 사용되었음을 확인하는 진술, 분석에 간격이 포함되었는지 여부를 확인하는 진술, 창공 직경의 빈도 분포 그래프, 간 블록 수 및 이미지. SEM에 의한 저배율은 여기에 표시된 바와 같이 문맥관 및 중앙 ES를 포함한 많은 큰 간 혈관 및 정현파를 관찰할 수 있을 만큼 충분히 큰 노출 영역이 있는 간 표본의 평평한 표면을 나타냅니다.

장착 스텁에 올바른 간 블록 배치를 보장하는 것은 정현파의 선명한 이미지를 얻는 데 필수적이며 간 정현파의 모든 세부 사항을 덮는 반짝이는 캡슐은 피해야 합니다. 이러한 이유로, 여기에서 볼 수 있듯이 더 높은 배율을 통해 LSEC 창호를 관찰할 수 있습니다. 간세포의 판은 혈관처럼 보일 수 있지만 BLI와 같은 기능은 방향을 잡는 데 도움이 됩니다.

이 그림은 높은 풍력압으로 인해 SEM에서 쉽게 식별되는 LSEC SIV 플레이트의 유착으로 인해 발생하는 것으로 생각되는 내피의 큰 틈과 같은 인공물이 발생할 수 있음을 보여주며, LSEC 표면 아래의 돌출부로 보일 수 있는 핵 바로 위의 세포막은 창공 밀도 및 다공성 계산의 정확성에 도움이 됩니다. 마지막으로, LSEC 창호 직경 밀도 및 빈도의 정량화는 창공에 대한 경험적 측정을 제공하고 노화 질병, 독소 또는 요법에 의해 유도된 변화를 측정할 수 있습니다. 관류 절차에 따라 세포의 초구조, 미토콘드리아 구조를 보기 위해 투과 전자 현미경과 같은 다른 기술로 조직을 처리할 수 있습니다.

조직학에도 사용할 수 있습니다.