Name: 뼈 조정 배지 : 준비 및 생물 검정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 배우세요 뼈 조정 배지(BCM) 제조법과 생물학적 활성 검정 기술을 실시간 PCR로 분석하는 방법을. 돼지 하악골에서 뼈 칩을 채취하고 배양하여 세포 반응을 연구하는 이 실험은 골 생물학 및 조직 공학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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저자는 Catherine Solioz의 능숙한 도움에 감사드립니다.

1. BCM 준비 <ol><li> 가능한 한 신선한 지역 정육점에서 돼지 턱을 얻습니다. 회사 표면에 턱을 놓고 전체 두께 플랩이있는 부드러운 조직을 떠나거나 뼈에 부착 된 골막하지 않도록 특별한주의를 기울이고 놓습니다. 흐름 후드에서 작동 할 필요없이 깨끗한 환경에서 작업. </li><li> 전체 두께 플랩이 해제되면, 협측에서 뼈 칩을 수확 뼈 스크레이퍼를 사용합니다. 뼈 스크레이퍼 날카로운되어 있어야합니다. 단단히 뼈 스크레이퍼를 처리하고 긴 운동은 뼈를 수집로. 작은 그 1mm를 뼈 칩을 폐기하십시오. <ol><li> 기본 뼈 칩을 유지하기 위해, 1 %의 항생제와 그들을 밖으로 건조를 허용하지 않습니다 항진균제 보충 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM)와 10cm 직경의 플라스틱 접시에 직접 뼈 칩을 놓습니다. </li><li> 열처리의 영향을 평가하기 위해, 대상 뼈 칩은 80 ° C에서 30 분 동안 저온 살균 또는121 ℃에서 20 분 동안 오토 클레이브. </li><li> , 탈회의 영향을 평가 4 ℃에서 4-6 시간 동안 1 M HCL에 뼈 칩을 흔들 pH가 중성이 될 때까지 배양 배지로 반복 세척합니다. </li></ol></li><li> 새로운 플라스틱 접시에 1 % 항생제와 항진균제로 보충 된 10 ml의 신선한 DMEM 당 뼈 칩 5 g의 총을 놓습니다. </li><li> 24 시간 동안 37 ℃에서 가습 분위기에서 플라스틱 접시를 놓습니다. 그런 다음, 수확 BCM. 원심 분리기, 파편을 제거 멸균 (0.2 nm의) 필터, -80 ℃에서 냉동 분취 량을 유지하기 위해 10 분 동안 200 XG에 BCM. </li><li> 바로 사용하기 전에 BCM 주식을 해동과 동결 융해의 반복주기를 피하십시오. </li><li> 나타낸 실험에서, RT에서 1 시간 동안 BCM 또는 무 혈청 배지로 콜라겐 막을 담가. PBS로 적극적으로 막을 세척하고 96 웰 플레이트에 배치합니다. 젖은 막은 세포와 씨앗을 품고있다. </li><li> BCM의 제조 공정은도 1에 요약 하였다. </리&gt; </ol> 간엽 세포 기준 2. 생물학적 정량 <ol><li> / cm 2 30,000 세포의 농도로 12 웰 플레이트 (예를 들어, 골 세포, 치은 및 치주 인대 섬유 아세포) 종자 인간 간엽 세포. 세포를 DMEM으로 이루어지는 성장 배지, 10 % 소 태아 혈청과 항생제를 사용 시드. 세포는 플레이트의 O / N에 부착하자. </li><li> 문화 매체를 취소하고 37 ° C에서 미리 예열 PBS로 세포를 씻어. 와 20 % BCM없이 예열 무 혈청 배지를 첨가하여 세포를 자극한다. 24 시간 동안 37 ° C에서 가습 된 분위기에서 셀을 놓는다. </li><li> , 문화 매체를 폐기 미리 예열 PBS로 세포를 씻어하고 원하는 프로토콜에 따라 RNA를 추출. </li><li> 각 샘플에서 RNA의 동일한 금액을하기 위해 RNA의 농도를 조정합니다. cDNA를 준비하고, 표 1에 나타낸 프라이머를 사용하여 선택된 유전자를 분석 QRT-PCR을 수행한다. 참고 :이 모든 구성 요소의 희석 수 있습니다 : 배 SYBR 녹색, 20 배 프라이머 앞으로, 20 배 프라이머 역, 5 배 무균 DD 물, 5 배의 cDNA. QRT-PCR은 95 ° C 15 초, 40 사이클 및 60 ° C에서 1 분간 수행된다. </li><li> CT GAPDH와 Δ (ΔCT) ΔCT 자극 - - ΔCT 제어 ΔCT는 CT의 대상이되는 Δ (ΔCT) 방법을 사용하여 하우스 키핑 유전자 GAPDH에 정상화가 상대적 발현 수준을 계산합니다. </li><li> 이 품질 관리 후에, 중간 엽 세포, 조혈 세포 또는 내피 세포를 포함하여 모든 유형의 세포를 자극하는 배양액을 추가로 BCM. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다. 조르디 Caballé - 세라노는 치과 연구 및 교육, 바젤, 스위스의 재단에서 장학금을 받았다.

뼈 에어컨 매체는 골 재생의 초기 단계 동안 뼈 이식의 공개 활동을 반영한다. 여기에 설명 된 프로토콜이 골 재생에 관여하는 세포의 다른 유형의 반응을 연구하기 위해 적응 될 수있다. 또한, 프로토콜 처리 된 뼈 또는 뼈 충전제로부터의 조건화 배지를 제조 할 수있다. 다양한 네이티브 및 처리 뼈에서 방출 요인 : 방법을 수행하고 간단한 개념에 의존하기 쉽다. 방법 BCM을 이해하는 것은 중간 엽 세포가 이식 통합 및 골자가 이식의 속성에 대한 자세한 내용을 보려면하는 데 도움이 될 수 있습니다에 영향을줍니다. 우리는 또한 세 가지 주요 계통으로 증식, 이동 및 분화에, 중간 엽 세포의 유전자 발현에 네이티브 11, 15 및 14, 20에서 처리 된 뼈 수득 BCM의 영향에 대한 지식을 축적이 개념에 근거; 조골 세포, 지방 세포와 연골 세포 (11). BCM 또한 TA에 용량을 조사 하였다파골 세포 (13)의 변조에 대해, 예를 들어 조혈 세포를 r...

자가 뼈 널리 기형의 결과, resective 수술, 재건 외상 수술, 이전 임플란트 식립 1, 2에로 발생한 결함을 연결하는 데 사용됩니다. 뼈 이식은 이식 통합의 과정을 지원하는 방법의 생물학적 원리를 이해하는 것은자가 이식이 재건 수술의 황금 표준으로 간주하는 이유를 이해하기 만 키가 아닌, 그것은 또한 뼈 대체 (3)의 개선 된 디자인에 생체 공학입니다. 그러나 이식 통합은 빠른자가 뼈와 뼈가 4,5 대체 비교된다. 따라서, 골 재생을 지원하기 때문에 효과적인 자가골을 분자 세포 메커니즘을 나타 내기 위해 필수적이다. 통합 프로세스의 6,7을 지원하는 것으로 간주되는자가 이식의 세 교과서의 특성이 있습니다. 첫째,자가 뼈가 성장하는 새로 형성된 뼈에 대한 지침을 제공, osteoconductive입니다결함에. 둘째,자가 뼈는 조골 세포 (8)로 분화 할 수 중간 엽 세포를 포함 즉, 골 형성이다. 매트릭스 내에 안치 뼈 형태 형성 단백질 유사 성장 인자 연골 또는 골 형성 intramembranous (9)의 처리를 개시 할 수있다 셋째, 자가골은 골 유도된다. 또 다른 측면이있다 : 갓 준비 뼈 칩은 &quot;뼈 에어컨 매체&quot;10 ~ 15과 체외 관찰을 기반으로 분비 기능을 유지. 또한 myelopoiesis의 영향은 16를 언급한다. &quot;탈회 골 기질 - 조정 배지&quot;A와 유사한 용어는 이미 탈회 (17)에 의해 처리 된 경우에도, 1996 년 낸 뼈의 분비 기능의 전체적인 개념을 지원 하였다. 우리의 목적을 위해, BCM은 10,11 하악골 신선한 돼지로부터 제조 될 수있다. BCM의 프로테옴 분석은 성장의 사실을 포함하여, 복잡한 구성을 밝혀ORS과 세포 외 기질 (10)의 성분은, 또한 전체의 뼈 18,19 테아의 기존 기술을 연장. 따라서, BCM은 시험관 내에서 뼈 이식의 다양한 변형의 공개 활동을 반영해야한다. 중간 엽 세포는, 예를 들어 뼈 칩 또는 구두 부드러운 조직에서 분리 된 사람들을 위해, BCM 수 있나요? 체외 노출되었을 때 어떻게됩니까, BCM은 골 형성과 지방 세포 분화를 감소시키고, IL11 식 (11)의 강한 증가를 불러 일으킨다. 게놈 넓은 마이크로 어레이는 차등 BCM에 대한 응답으로 중간 엽 세포에서 발현되는 많은 유전자를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이들 유전자 중 adrenomedullin (ADM)이며, IL11, IL33, NADPH 산화 효소 4 (NOX4), 프로테오글리칸 4 (PRG4, 또는 lubricin) 및 3 (PTX3) 15 pentraxin. 멸균 뼈 칩으로부터 얻어진 BCM은 각각 14 유전자의 발현을 변경하지 못한 경우. 저온 살균을 시행하고 동결 뼈 칩에서 BCM은 할 수 있었다유전자 발현 (14)을 변경합니다. 탈회 골 기질 (DBM-CM)의 또한 에어컨 매체는 TGF-β 조절 유전자 (20)의 표현을 변경합니다. 흥미롭게도, 주위의 부드러운 조직 뼈 (21, 22)로부터 칩을 보호하는 데 콜라겐 배리어 막은, 유전자 발현의 변화 (23)에 대한 책임 BCM의 그 부분을 흡착. BCM 연구는 몇 가지 이름을, 같은 뼈 재 흡수 파골 세포와 내피 세포로 골 재생에 관여하는 다른 세포 유형으로 확장 할 수 있습니다. 전반적으로, 축적 체외 데이터는 임상 연구의 설계를위한 과학적 근거를 제공한다. 본 프로토콜은 두 가지입니다 : 첫째, BCM을 준비하는 방법을 보여줍니다. 둘째, 체외에서 중간 엽 세포를 기반으로 생물학적 활성을 테스트하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>돼지 하악골</td> 로컬 <td>부처</td><td></td><td></td></tr><tr><td>뼈 스크레이퍼</td><td>Hu-Friedy</td><td>PPBUSE2/36</td><td></td></tr><tr><td>항생제 및 Antimicotics</td><td>All life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 멤브레인 (Bio-Gide)</td><td>Geistlich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>16030074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td> 고순도 RNA 분리 키트</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>전사자 우선 스트랜드 cDNA 합성 키트</td><td>Roche</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Microsynth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green (for Q-RT-PCR)로</td><td>슈</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr></tbody></table>

뼈 조정 배지 : 준비 및 생물 검정

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

자가 뼈 이식 널리 구강 악안면 외과, 정형 외과 및 외상에 사용됩니다. 자가 뼈 이식은 누락 된 뼈를 대체하지, 그들은 또한 골 재생의 복잡한 과정을 지원합니다. 자가 이식이 유리한 동작은 세 가지 특징에 기인한다 : osteoconductivity, osteogenicity 및 osteoinductivity을. 그러나, 다른 측면이있다 : 뼈 골 재생에 관련된 중간 엽 세포를 대상으로 할 수 성장 인자를 포함하여 분자의 무수 해제 접목. 골 이식의 분비 속성은 뼈 에어컨 매체 (BCM)를 사용하여 시험 관내에서 공부하실 수 있습니다. 여기에서 우리는 열 처리 또는 탈회를 시행 기본 돼지 피질 뼈에서 뼈 에어컨 매체를 준비하는 방법에 대한 프로토콜 및 뼈를 제시한다. 세포는 직접 BCM에 노출 또는 콜라겐 멤브레인, 이전 BCM 적신 같은 생체 재료,에 접종 할 수있다. 우리는 체외 bioassa에 대한 예를들TGF-β 조절 유전자의 발현에 중간 엽 세포와 YS. 제시된 프로토콜은 추가 골 재생시 뼈 이식의 분비 효과를 밝혀 및 재건 수술의 폭 넓은 분야의 중개 연구에 대한 경로를 엽니 다 장려해야한다.

뼈 조정 배지를 신선한 돼지 뼈 칩으로부터 제조된다. 공정의 일반 개요 BCM을 준비하고 BCM 생체 물질과 조합을 사용은도 1 및도 2에 각각 도시되어있다. BCM 준비 동안, 최종 BCM의 품질에 영향을 미칠 수있는 짧은 움직임 또는 매우 작은 뼈 칩만큼 움직임 큰 뼈 칩을 얻는 것이 중요하다. ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 및 PRG4 (도 3) : BCM의 품질 BCM 타겟 유전자의 유전자 발현을 분석하여 제어 될 수있다. ADM과 PTX3 0.4 배 아래로 아래로 조절하고 200 배에 규제까지-IL11, IL33, NOX4 및 PRG4이 될 수 있습니다. 구강 섬유 아세포 표시된 수준에서 BCM의 표적 유전자를 발현하지 않는 경우, 세포의 상태를 확인하거나 새로운 턱에서 새로운 BCM을 준비합니다. 콜라겐 장벽 막에 시드 구강 섬유 아세포에서 BCM 대상 유전자의 발현에서 4 표시에게 전형적인 결과를 <str...

우리는 뼈 에어컨 매체 (BCM)을 준비하고 시험 관내에서 활동을 테스트하는 방법을 여기에 대해 설명합니다.

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

이 비디오의 전반적인 목표는 뼈 조절 배지를 준비하고 체외에서 그 활성을 테스트하는 방법을 설명하는 것입니다. 이것은 먼저 뼈 스크레이퍼를 사용하여 돼지 하악골에서 뼈 조각을 채취함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 24시간 동안 배양 배지에서 배양하기 전에 뼈 칩을 열처리, 탈염 또는 아무것도하지 않는 것입니다.다음으로, 뼈 칩에서 방출된 모든 인자를 포함하는 뼈 조절 배지를 수집합니다. 마지막 단계는 뼈 조절 배지로 세포를 자극하거나 배양 기간 후에 뼈 조절 배지와 종자 세포가 있는 생체 물질을 사전 배양하는 것입니다. 궁극적으로 정량적 real-time PCR은 치료 후 세포의 유전자 발현 변화를 보여주는 데 사용됩니다.자가 뼈 이식편을 단독으로 또는 다른 생체 재료와 함께 사용하면 임플란트 주위 뼈 결손에서 뼈 재생을 자극하여 장기적으로 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 이 비디오는 뼈 상태 내 생체 분자에 대한 질량 세포의 유전적 반응을 결정하는 데 유용한 체외 생물학적 분석을 제시합니다. Medium Bone condition medium은 자가 뼈가 뼈 재생에서 표준 이식의 목표인 이유와 같은 외상, 악안면 및 치과 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.열처리된 뼈 자동 이식 또는 화된 뼈 매트릭스와 같이 처리된 뼈에서 상태 배지를 준비하는 것은 표준화하기 어려울 수 있습니다. 따라서 정확한 것이 중요합니다. 시작하려면 지역 정육점에서 신선한 돼지 아래턱을 구하여 단단한 표면에 놓습니다.다음으로, 골막을 사용하여 골막의 전체 두께 피판을 분리하면서 뼈에 부착된 연조직을 남기지 않도록 각별히 주의합니다. 골막이 제거되면 뼈 스크레이퍼를 단단히 잡고 긴 움직임을 사용하여 하악골의 협측 쪽에서 뼈 조각을 채취합니다. 길이가 1mm보다 작은 뼈 조각은 모두 버리십시오.뼈 조각이 마르는 것을 방지하기 위해 10cm 페트리 접시에 배양 배지로 빠르게 덮습니다. 충분한 뼈 조각을 수집한 후 뼈 칩 5g을 저온 살균하여 열 조절 배치를 준비합니다. 칩을 섭씨 80도에서 30분 동안 가열하여 저온 살균하거나 섭씨 121도에서 20분 동안 고압멸균합니다.다음으로, 염산 1몰 용액에 5g의 뼈 조각을 넣고 섭씨 4도에서 4-6시간 동안 셰이커에 올려 놓아 탈염 대조군을 준비합니다. 그런 다음 중성 pH에 도달할 때까지 배양 배지로 뼈 칩을 반복적으로 세척합니다. 신선한 뼈 칩 5g과 대조군 제제 각 5g을 별도의 접시에 넣고 각 접시에 10ml의 신선한 배양 배지를 추가합니다.그런 다음 다음날 컨디셔닝된 배지를 만들기 위해 섭씨 37도의 가습된 분위기에서 24시간 동안 샘플을 배양합니다. 각 접시에서 미디어를 제거하고 15ml 원추형 튜브에 넣습니다. 뼈 조절 매체를 200배 중력에서 10분 동안 원심분리하여 이물질을 제거합니다.그런 다음 상층액을 제거하고 0.2 미크론 멸균 필터에 통과시켜 Ali 쿼드를 섭씨 영하 80도에서 냉동 보관할 때까지 필요합니다. 뼈 세포 또는 치은 및 치주 인대 섬유아세포와 같은 인간 중간엽 세포를 평방 센티미터당 30, 000 세포의 농도로 12개의 고래 플레이트에 파종하는 것으로 시작합니다. 세포를 성장 배지로 덮고 다음날 아침 밤새 세포를 플레이트에 부착합니다.배양 배지를 버리고 섭씨 37도에서 예열 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 20% 뼈 조절 배지의 유무에 관계없이 예열 혈청 무료 배양 배지를 추가하여 세포를 자극합니다. 생체 물질의 흡수 능력도 테스트하는 경우, 관심 생체 물질이 포함된 튜브에 대조군을 포함한 뼈 조절 배지를 추가하고 튜브를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.그런 다음 예열 PBS로 생체 물질을 격렬하게 헹구고 30, 평방 센티미터 당 000 세포의 농도로 인간 중간엽 세포를 재료에 뿌립니다. 세포를 단독으로 배양하거나 생체 재료에 파종된 세포를 37도 CS 가습 분위기에서 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 배양 배지를 폐기하십시오.예열 PBS로 세포를 헹구고 표준 RNA 분리 프로토콜을 사용하여 세포 RNA를 추출합니다. RNA가 분리되면 추출된 RNA의 동일한 농도로 시작하여 각 샘플에 대해 역전사 효소 반응을 실행하여 각 처리 그룹의 CD NA 샘플을 준비합니다. 그런 다음 샘플에 대해 정량적 Real-Time PCR을 수행하여 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 나열된 프라이머 및 조건을 사용하여 선택한 유전자의 수준을 찾습니다.마지막으로, delta delta CT 방법을 사용하여 유전자의 cycle threshold level을 housekeeping gene Gabb dh로 정규화하여 상대적인 유전자 발현 수준을 기반으로 bone conditioned medium의 품질을 계산합니다. 다음은 24시간 동안 뼈 조절 배지에 노출된 구강 섬유아세포의 유전자 발현 변화를 보여주는 몇 가지 일반적인 결과입니다. 아드레날린(adrenalin)과 펜트트랙스(pent trax) 및 3개 유전자는 모두 원래 수준의 40%로 현저히 하향 조절된 반면, 인터류킨 11 및 33은 N-A-D-P-H 산화효소 4 및 프로테 글리칸 4와 함께 모두 200배까지 상향 조절되었습니다.흥미롭게도, 주위의 연조직으로부터 뼈 조각을 보호하는 데 사용되는 콜라겐 장벽 막은 유전자 발현의 변화를 담당하는 뼈 조절 배지의 대부분을 흡수합니다. 그러나 콜라겐 막은 인터류킨 33 발현을 조절하는 인자를 흡수하지 못했습니다. 그러므로, 인터루킨 33 발현은 이 환경에서 조절되지 않습니다.여기에 설명된 프로토콜은 뼈 재생과 관련된 다양한 유형의 세포 반응을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 공정 뼈 및 기타 뼈 충전재에서 상태 배지를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 이 생물학적 분석의 임상적 관련성은 불분명합니다.생체 내 BCM에 대한 세포 반응은 더 복잡할 가능성이 높으며 여기에 제시된 것을 확장하는 광범위한 유전자와 다양한 표적 세포를 포함합니다. 그럼에도 불구하고, 우리의 생물학적 분석은 아마도 복잡한 뼈 RAF 분자의 구성과 체외 세포 반응에 대한 첫 번째 통찰력을 제공합니다.

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Biology

생물학

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