뼈 조정 배지 : 준비 및 생물 검정

이 비디오의 전반적인 목표는 뼈 조절 배지를 준비하고 체외에서 그 활성을 테스트하는 방법을 설명하는 것입니다. 이것은 먼저 뼈 스크레이퍼를 사용하여 돼지 하악골에서 뼈 조각을 채취함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 24시간 동안 배양 배지에서 배양하기 전에 뼈 칩을 열처리, 탈염 또는 아무것도하지 않는 것입니다.

다음으로, 뼈 칩에서 방출된 모든 인자를 포함하는 뼈 조절 배지를 수집합니다. 마지막 단계는 뼈 조절 배지로 세포를 자극하거나 배양 기간 후에 뼈 조절 배지와 종자 세포가 있는 생체 물질을 사전 배양하는 것입니다. 궁극적으로 정량적 real-time PCR은 치료 후 세포의 유전자 발현 변화를 보여주는 데 사용됩니다.

자가 뼈 이식편을 단독으로 또는 다른 생체 재료와 함께 사용하면 임플란트 주위 뼈 결손에서 뼈 재생을 자극하여 장기적으로 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 이 비디오는 뼈 상태 내 생체 분자에 대한 질량 세포의 유전적 반응을 결정하는 데 유용한 체외 생물학적 분석을 제시합니다. Medium Bone condition medium은 자가 뼈가 뼈 재생에서 표준 이식의 목표인 이유와 같은 외상, 악안면 및 치과 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

열처리된 뼈 자동 이식 또는 화된 뼈 매트릭스와 같이 처리된 뼈에서 상태 배지를 준비하는 것은 표준화하기 어려울 수 있습니다. 따라서 정확한 것이 중요합니다. 시작하려면 지역 정육점에서 신선한 돼지 아래턱을 구하여 단단한 표면에 놓습니다.

다음으로, 골막을 사용하여 골막의 전체 두께 피판을 분리하면서 뼈에 부착된 연조직을 남기지 않도록 각별히 주의합니다. 골막이 제거되면 뼈 스크레이퍼를 단단히 잡고 긴 움직임을 사용하여 하악골의 협측 쪽에서 뼈 조각을 채취합니다. 길이가 1mm보다 작은 뼈 조각은 모두 버리십시오.

뼈 조각이 마르는 것을 방지하기 위해 10cm 페트리 접시에 배양 배지로 빠르게 덮습니다. 충분한 뼈 조각을 수집한 후 뼈 칩 5g을 저온 살균하여 열 조절 배치를 준비합니다. 칩을 섭씨 80도에서 30분 동안 가열하여 저온 살균하거나 섭씨 121도에서 20분 동안 고압멸균합니다.

다음으로, 염산 1몰 용액에 5g의 뼈 조각을 넣고 섭씨 4도에서 4-6시간 동안 셰이커에 올려 놓아 탈염 대조군을 준비합니다. 그런 다음 중성 pH에 도달할 때까지 배양 배지로 뼈 칩을 반복적으로 세척합니다. 신선한 뼈 칩 5g과 대조군 제제 각 5g을 별도의 접시에 넣고 각 접시에 10ml의 신선한 배양 배지를 추가합니다.

그런 다음 다음날 컨디셔닝된 배지를 만들기 위해 섭씨 37도의 가습된 분위기에서 24시간 동안 샘플을 배양합니다. 각 접시에서 미디어를 제거하고 15ml 원추형 튜브에 넣습니다. 뼈 조절 매체를 200배 중력에서 10분 동안 원심분리하여 이물질을 제거합니다.

그런 다음 상층액을 제거하고 0.2 미크론 멸균 필터에 통과시켜 Ali 쿼드를 섭씨 영하 80도에서 냉동 보관할 때까지 필요합니다. 뼈 세포 또는 치은 및 치주 인대 섬유아세포와 같은 인간 중간엽 세포를 평방 센티미터당 30, 000 세포의 농도로 12개의 고래 플레이트에 파종하는 것으로 시작합니다. 세포를 성장 배지로 덮고 다음날 아침 밤새 세포를 플레이트에 부착합니다.

배양 배지를 버리고 섭씨 37도에서 예열 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 20% 뼈 조절 배지의 유무에 관계없이 예열 혈청 무료 배양 배지를 추가하여 세포를 자극합니다. 생체 물질의 흡수 능력도 테스트하는 경우, 관심 생체 물질이 포함된 튜브에 대조군을 포함한 뼈 조절 배지를 추가하고 튜브를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 예열 PBS로 생체 물질을 격렬하게 헹구고 30, 평방 센티미터 당 000 세포의 농도로 인간 중간엽 세포를 재료에 뿌립니다. 세포를 단독으로 배양하거나 생체 재료에 파종된 세포를 37도 CS 가습 분위기에서 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 배양 배지를 폐기하십시오.

예열 PBS로 세포를 헹구고 표준 RNA 분리 프로토콜을 사용하여 세포 RNA를 추출합니다. RNA가 분리되면 추출된 RNA의 동일한 농도로 시작하여 각 샘플에 대해 역전사 효소 반응을 실행하여 각 처리 그룹의 CD NA 샘플을 준비합니다. 그런 다음 샘플에 대해 정량적 Real-Time PCR을 수행하여 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 나열된 프라이머 및 조건을 사용하여 선택한 유전자의 수준을 찾습니다.

마지막으로, delta delta CT 방법을 사용하여 유전자의 cycle threshold level을 housekeeping gene Gabb dh로 정규화하여 상대적인 유전자 발현 수준을 기반으로 bone conditioned medium의 품질을 계산합니다. 다음은 24시간 동안 뼈 조절 배지에 노출된 구강 섬유아세포의 유전자 발현 변화를 보여주는 몇 가지 일반적인 결과입니다. 아드레날린(adrenalin)과 펜트트랙스(pent trax) 및 3개 유전자는 모두 원래 수준의 40%로 현저히 하향 조절된 반면, 인터류킨 11 및 33은 N-A-D-P-H 산화효소 4 및 프로테 글리칸 4와 함께 모두 200배까지 상향 조절되었습니다.

흥미롭게도, 주위의 연조직으로부터 뼈 조각을 보호하는 데 사용되는 콜라겐 장벽 막은 유전자 발현의 변화를 담당하는 뼈 조절 배지의 대부분을 흡수합니다. 그러나 콜라겐 막은 인터류킨 33 발현을 조절하는 인자를 흡수하지 못했습니다. 그러므로, 인터루킨 33 발현은 이 환경에서 조절되지 않습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 뼈 재생과 관련된 다양한 유형의 세포 반응을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 공정 뼈 및 기타 뼈 충전재에서 상태 배지를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 이 생물학적 분석의 임상적 관련성은 불분명합니다.

생체 내 BCM에 대한 세포 반응은 더 복잡할 가능성이 높으며 여기에 제시된 것을 확장하는 광범위한 유전자와 다양한 표적 세포를 포함합니다. 그럼에도 불구하고, 우리의 생물학적 분석은 아마도 복잡한 뼈 RAF 분자의 구성과 체외 세포 반응에 대한 첫 번째 통찰력을 제공합니다.