영상 병인과의 Cording를 해독하고 미코 농양 Zebrafish의 배아에서

이 절차의 전반적인 목표는 Mycobacterium abscessus 균주의 독성을 연구 및 비교하고 투명 제브라피시 배아를 사용하여 생체 내에서 이러한 박테리아와 숙주 선천성 면역 체계 간의 상호 작용을 설명하는 것입니다. 이것은 먼저 균질한 박테리아 눈을 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로, 수정 후 30시간에 배아에 박테리아 현탁액을 정맥 주사합니다.

또한 감염 통제에서 대식세포의 역할을 보다 정확하게 연구하기 위해 리포 초산(lipo choate) 기반 주입 절차를 사용하여 대식세포가 고갈된 배아를 생성합니다. 마지막으로, 감염된 배아를 형광 및 컨포칼 현미경을 사용하여 준비하고 이미지화하여 감염의 진행을 모니터링합니다. 궁극적으로, 얻을 수 있는 결과는 형광 식세포 세포와 M 농양 사이의 특정 상호 작용을 개별 염상 또는 투명한 배아 내부의 구불구불한 끈으로 보여줍니다.

생쥐와 같은 다른 동물 모델보다 제브라 피쉬를 사용하는 주요 이점은 실시간으로 감염 과정을 구체적으로 조사하고 미생물 농양과 마이크로파지 또는 호중구 사이의 특정 상호 작용을 이미지로 연구할 수 있다는 것입니다. 이 단계는 제브라피시의 후속 사출 압력에 대한 중요한 문제입니다. 거친 마이코박테리움 농양(rough mycobacterium abscessus)이 큰 응집체를 형성하고 코드를 생성하는 경향이 높기 때문에 미세주입 전에 균질하고 정량적으로 제어된 이노큘러를 준비하기 위해 특정 처리가 필요합니다.

m 농양을 준비하기 위하여는, inocular 추수 150 평방 센티미터 조직 배양 플라스크에서 50 밀리리터 메마른 플라스틱 관 및 15 분 동안 4의, 000 시간 G 및 실내 온도에 분리기로 기하급수적으로 성장하는 문화. OADC 농축이 보충된 Middlebrook seven H nine 1ml와 twen, 80(이하 seven H nine medium이라고 함)을 사용하여 펠릿과 Eloqua를 재현탁합니다. 200 마이크로 리터의 박테리아 현탁액을 26 게이지 바늘이있는 1.5 밀리리터 튜브에 넣으면 박테리아 현탁액의 각 ALI 쿼드를 15 번 균질화합니다.

그런 다음 수조를 사용하여 10초 동안 3회 초음파 처리하고 각각 10초 동안 휴식을 취합니다. 그 사이에 1 밀리리터의 7 H 9, 중간 및 잠시 와류를 첨가 한 다음 3 분 동안 100 회 G에서 원심 분리합니다. 상층액이 함유된 마이코박테리아를 조심스럽게 수집하여 뭉침을 피하고 균질한 현탁액을 50ml 멸균 플라스틱 튜브에 넣습니다.

현탁액을 4, 000 회 G에서 5 분 동안 원심 분리하고 200 마이크로 리터의 7 H 9 배지를 사용하여 펠릿을 재현 탁탁하여 최종 세균 접종물을 평가합니다. 텍스트 프로토콜에 따르면, 이 방법의 시각적 시연은 현미경으로 제브라피시 배아에 주입하는 정확하고 부드러운 조작과 미세주입 기술의 습득에 약 24시간에 M 농양의 미세주입을 수행하는 데 시간이 필요하기 때문에 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 수정 또는 HPF 후에는 핀셋을 사용하여 100mm 페트리 접시에 배아를 코팅하고 섭씨 28.5도로 유지합니다.

30 48 HPF 배아를 클립된 마이크로 로더 팁과 함께 리터당 270mg의 트리카를 포함하는 25밀리리터의 물고기 물로 채워진 V자형 포지셔닝 챔버로 옮깁니다. 더 쉽게 조작할 수 있도록 배아를 채널에 적절하게 놓습니다. 0.05%와 80 사이의 PBST를 사용하여 미생물 접종물을 원하는 CFU로 희석하고 10%페놀 레드를 포함하여 마이크로 로더 팁으로 적절한 주입을 확인합니다.

마이크로주사 바늘에 5-10마이크로리터의 박테리아 접종물을 로드합니다. 주입기에 연결된 마이크로 매니퓰레이터의 홀더에 마이크로 주입 바늘을 연결하고 가는 핀셋을 사용하여 바늘 상단을 부러뜨립니다. 5-10 마이크로 미터의 개구부 직경을 얻습니다.

미세주입 압력과 시간을 조정하여 주입량을 보정합니다. 그런 다음 필요한 주입량을 얻기 위해 한 배아의 난황으로 배출된 액적의 직경을 측정하여 유아 정맥에 미세 주입합니다. 배아를 배쪽 쪽이 바늘을 향하도록 배치하고 바늘 끝을 비뇨생식기 입구 가까이에 놓습니다.

그리고 바늘 끝을 배아 정맥 부위를 관통할 때까지 배아 안으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 그런 다음 원하는 부피의 박테리아 현탁액(보통 나노리터당 약 100CFU를 포함하는 1-3나노리터)을 전달합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 배아를 배양하고 모니터링하여 lipo Choate, 24 HP에서 대식 세포 및 배아의 고갈을 수행합니다. 운명, 배아, 그리고 trica가 함유 된 물고기 물로 채워진 주입 접시로 옮깁니다.

그런 다음 등쪽이 아래쪽을 향하게 합니다. 리포솜 캡슐화된 클로드로네이트 용액을 와류로 회전시킨 후 마이크로 모세관 바늘을 로드하고 주입량을 보정합니다. 앞에서 설명한 것처럼 코들 정맥 부위를 뚫고 2-3리터의 용액을 주입합니다.

주입을 세 번 반복합니다. 섭씨 28.5도에서 배아를 배양하고 형광 현미경을 사용하여 감염되기 전에 대식세포의 적절한 고갈을 제어합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 원하는 시점의 집락 형성 단위 또는 CFU를 열거합니다.

감염 상태별로 5개의 배아를 수집하고 각 배아를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 이식합니다. 냉동 마취: 리터당 300-500mg으로 배아를 안락사시킨 후 얼음 위에서 10분 동안 배양을 배양하여 배아를 마취합니다. 트리카. 멸균수를 사용하여 새 튜브에서 배아를 두 번 씻습니다.

다음으로, 각 배아에 2%Triton X 100의 수분을 1개의 XPBS로 제거한 후 26 게이지 바늘을 사용하여 조직을 균질화하여 완전한 용해를 수행합니다. 현탁액을 원심분리한 후 하나의 X-P-B-S-T를 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 Middlebrook 7 H 10 OADC에 균질의 플레이트 직렬 희석.

B-B-L-M-G-I-T Panta를 보충하여 M 농양 감염의 실시간 이미징을 위해 군집을 세기 전에 섭씨 30도에서 플레이트를 4일 동안 배양하고, 도립 현미경을 위한 35mm 유리 바닥 페트리 접시 또는 직립 컨포칼 현미경을 위한 단일 공동 함몰 슬라이드에서 1%의 낮은 융점 아로스에서 배아를 마취한 trica를 장착합니다. 배아를 원하는 위치로 향하게 하고 M 농양 감염의 고정 이미징을 위해 trica가 포함된 물고기 물로 응고된 aros를 덮습니다. 배아를 안락사시킨 후 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 배아를 1개의 X-P-B-S-T에 4%파라폼 알데히드로 2시간 동안 고정합니다.

실온에서 10분 동안 X-P-B-S-T 1개로 배아를 두 번 세척하여 파라폼 알데히드를 제거하여 조직의 무결성과 형광을 연속적으로 보존합니다. 조건당 10분 동안 증가하는 농도의 글리세롤 용액에서 배아를 배양합니다. 50% 글리세롤이 함유된 배아를 관찰실에 놓습니다.

마지막으로, 10 x 대물렌즈가 있는 형광 현미경 또는 40 x 또는 63 x 대물렌즈가 있는 형광 컨포칼 현미경을 사용하여 배아의 순차적 형광 획득 및 투과 이미징을 수행합니다. 거칠고 매끄러운 M 농양 변이체의 독성을 조사하고 비교하기 위해 30개의 HPFC 능숙 배아에 형광 박테리아를 정맥 주사했습니다. 부드러운 변이와 대조적으로, 거친 변이는 중추 신경계 내에서 농양이 발생하면서 더 강력하고 치명적인 감염을 유발합니다.

독성의 차이는 CFU를 열거하거나 상관관계가 있는 형광 픽셀 수를 결정하여 정량화했습니다. 이는 rough variant에 대한 더 높은 박테리아 부하를 나타냅니다.이 그림에서 볼 수 있듯이, 탯줄 형성의 kinetics는 비침습적 방식으로 비디오 현미경으로 모니터링 및 이미지화할 수 있으며, 여기에 표시된 것처럼 rough variant가 세포 외로 복제되는 경향을 보여줍니다. 대식세포가 고갈된 배아를 거친 M 농양에 감염시키면 박테리아 부하와 탯줄 생산이 크게 증가하고 유충이 급속히 죽게 됩니다.

이는 대식세포와 M 농양 사이의 상호 작용을 실시간으로 관찰하기 위해 M 농양 감염을 통제하기 위해 대식세포가 필요하다는 것을 분명히 나타냅니다. 적색 형광 대식세포를 생산하는 EG one M 체리 형질전환 라인을 사용할 수 있습니다. 감염은 개별 박테리아의 효율적인 식세포작용(phagocytosis)을 통해 대식세포의 현저한 동원을 유도하는 반면, 마이코박테리아 코드(mycobacterial cords)는 농양이 발달 후 식세포작용(phagocytosion)되는 것을 피하기 위해 농양에 의해 진화된 전략을 나타냅니다.

이 기술은 면역 회피의 새로운 메커니즘으로서 코딩의 중요한 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 제브라피시 감염 두더지 덕분에, 이제 마이코박테리움 농양의 발병기전에서 코드의 생체 내 기여를 관찰하고 설명할 수 있게 되었습니다.