Name: 영상 병인과의 Cording를 해독하고 미코 농양 Zebrafish의 배아에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 배우세요 Mycobacterium abscessus의 독성을 비교하고 제브라피쉬 배아에서 선천면역계와의 상호작용을 형광현미경으로 관찰하는 방법을. 거대식세포의 감염 조절 역할을 실시간으로 연구할 수 있습니다.

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저자는 도움이 토론에 대한 각각 tdTomato와 사비의 발현을 허용 pTEC27과 pTEC15의 관대 한 선물을 사러 - 클로드과 L. 라마 크리슈를 제공하는 케이 Kissa에 감사드립니다. 프랑스 국립 연구 기관의 프로젝트 (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009과 DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) 및 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램의이 작품의 일부를 형성 (FP7-사람들-2011-ITN) 부여 계약에 따라 NO. PITN-GA-2011-289209 마리 퀴리 초기 교육 네트워크 FishForPharma합니다. 우리는 CM 듀폰에 자금을 지원하기위한 협회 그레고리 Lemarchal 및 Vaincre 라 Mucoviscidose (RF20130500835)을 감사하는 것이 좋겠다.

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제브라 피쉬는 최근 실시간 (36)의 넓은 필드와 공 촛점 이미징을 사용하여 세균 감염의 역학을 공부하는 우수한 척추 동물 모델 시스템으로 떠오르고있다. 함께 마이크로 주입 방법 (프로토콜 4)와 분산 마이코 박테리아 현탁액 (프로토콜 2.2)의 조합은 재현 전신 감염, 후속 모니터링 및 호스트 식세포와 세균의 상호 작용에 특별한 초점을 맞춘 감염의 진행의 시각화 할 수 있습니다. 엠의 독성 생체 내 농양은 야생형 골든 지브라 피쉬 (37)의 사용 덕분에 조사 될 수있다. M. 사이의 상호 작용을 연구하는 19 대 식세포를 시각화 : 농양 및 골수 세포를 호스트는 여러 형질 전환 지브라 피쉬 라인의 Tg (mCherry MPEG1) 등을 사용할 수있다. (38) 또는 Tg는 (lyz :을 DsRed) 39w</...

미코 농양은 인간의 임상 증후군의 넓은 스펙트럼을 일으키는 새로운 병원균이다. 이러한 피부 감염뿐만 아니라 심각한 만성 폐 감염, 주로 면역 및 낭포 성 섬유증 환자 1,2,3,4에서 발생을 포함한다. M.를 농양은 인간의 원내 및 인성 감염을 담당하는 주요 빠르게 성장하는 마이코 박테리아 종으로 간주된다. 또한, 몇 가지 최근의 보고서는 가능성을 강조하는 M. 농양은 혈액 - 뇌 장벽을 통과하여 중추 신경계 (CNS) 5,6- 중요한 병변을 유도 할 수있다. 빠른 재배자, M.를 임에도 불구하고 또한 농양 전시 육아 종성 구조 내에서 년 동안 묵비권과 폐 7 caseous 병변을 생성 할 수있는 능력을 포함하여 결핵균의 그와 관련된 여러 가지 병원성 기능. 더 놀라운 낮은 센입니다엠의 sitivity 항생제에 농양, 상당한 치료 실패율 8,9로 이어지는 치료하기가 매우 어렵습니다 이러한 감염을 렌더링. 이 종의 중요한 위협은 주로 주요 공중 보건 기관 (10)에 관심과 폐 이식 (11)에 대한 금기 사항이다 항생제에 고유의 저항이다. M. 농양 표시 다른 임상 결과로 이어질 부드러운 (S) 또는 거친 (R) 식민지 형태 형. S 균주 달리, R 박테리아 로프 또는 끈형 구조 (12, 13)로 이어지는 단으로 성장하는 경향이있다. 세포 또는 동물 중 모델을 기반으로 여러 독립적 인 연구는 연구의 하이퍼 독성 표현형은 14, 15를 morphotype 밝혔다. 역학 연구, M.의 가장 심각한 경우 가입일 농양, 폐 감염이 연구와 관련이있는 것으로 나타납니다하는 유일한 변형 16 개의 변종이감염된 호스트 3 년 동안 지속하는 것으로 나타났습니다. morphotype 차이는 표면 관련 glycopeptidolipids (GPL) 12 (S)에 존재 또는 (R)에서 손실에 의존한다. 그러나, 현재 이용 가능한 셀룰러 / 동물 모델의 본질적인 한계는 M.에 의한 연구를 사용 농양 감염, R 또는 S 변종의 병태 생리 학적 사건에 대한 우리의 지식은 불분명 남아있다. 정맥 또는 에어로졸 경로를 통해 면역 능력이 쥐의 감염은 지속적 감염 및 생체 내 약물 감수성 검사 (17)에 대해 연구하는 마우스의 사용을 방해, 일시적 식민지로 연결됩니다. 따라서, 호스트 응답의 조작 의무가 동물 모델을 개발하는 것은 큰 도전이다. 이러한 맥락에서, 감염의 포유 동물 모델 비는 비용, 속도 및 윤리적 양호성 O 등 여러 가지 이점을 제공한다 (18)를 포함 초파리 melanogaster의 최근 개발되어왔다마우스 모델을 VER. 감염의 제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio)) 모델은 또한 비 침습적 영상, M.의 진행과 연대하여, 시각적으로 탐구하고있다 살아있는 동물 19 농양 감염. 중요한 개념의 증거는 엠에 대한 생체 내 항생제 평가에 대한 적합성을 입증하기 위해 설립되었다 17, 20 농양. 제브라 널리 다양한 병원균과 숙주 면역 시스템 (21) 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 지난 수십 년 동안 사용되어왔다. 이 다른 척추 동물 모델의 증가 성공 동기 부여 및 다수의 바이러스와 세균 감염 19,22,23,24,25,26,27,28,29의 더 나은 이해를 위해 사용을 검증 주요 독특한 기회에 의존합니다. 대부분의 다른 동물 모델에 반해, 제브라 피쉬 배아는 비 침습적 형광 이미징 (30). 이는 헥타르 있도록 광학적으로 투명M. 공부를 LED에 농양은 세균의 형태 학적 가소성의 예를 나타내는 세포 외 cording의 설명과 남중, 전례없는 세부 제브라 피쉬 배아를 감염. Cording는 면역 체계의 파괴의 새로운 메커니즘 및 급성 엠의 발병을 촉진하는 핵심 메커니즘을 나타냅니다 농양 감염 (19). 이 보고서는 M.의 병태 생리 학적 특성을 해독하는 제브라 피쉬 배아를 사용하는 새로운 도구와 방법을 설명합니다 감염 농양과 간균과 선천성 면역 시스템 사이의 친밀한 상호 작용을 연구하는. 먼저, 그 자체 박테리아 접종원 배아 준비, 감염의 처리를 포함하는 마이크로 인젝션 상세한 프로토콜이 제시된다. 구체적 방법은 M.를 평가하도록 같은 호스트의 생존과 세균 부담 등의 다양한 매개 변수를 측정하여 농양 독성이되게됩니다. 특별한 초점은 방법에 기재되어 있습니다, 시공간 수준에서, 운명과 진행 감염과 엠에 호스트 면역 반응을 모니터링 비디오 현미경을 사용하여 농양. 또한, M. 동안의 기여와 대 식세포의 역할을 조사하기 위해 감염 농양, 방법 (genetically- 또는 화학적 기반 중 하나 방법을 사용) 대 식세포가 고갈 된 배아 설명되어 있습니다를 생성합니다. 마지막으로, 프로토콜은 고정 또는 생활 배아를 사용하여 대 식세포 나 호중구가 문서화와 특정 상호 작용을 시각화합니다. 이 보고서의 목적은 엠에 새로운 광명을 비춰하는 추가 연구를 자극하는 것입니다 농양 독성 메커니즘 및 제어되지 않은 급성 감염 프로세스의 확립에 cording 특히 역할.

<table><tbody><tr><td>BBL MGIT PANTA</td><td>BD Biosciences</td><td>245114</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>04-100-811-E</td><td></td></tr><tr><td>소 간에서 카탈라아제&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>디프코 미들브룩 7H10 한천</td><td>BD 생명과학</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>디프코 미들브룩 7H9 육수</td><td>BD 생명과학</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염(트리카인)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>올레산</td><td>시그마-알드리치</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>델타 Microscopie</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma-Aldrich 319244</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Gibco Life Technologie</td><td>30391-023</td><td></td></tr><tr><td>저녹는 아가로스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인스턴트 오션 Sea Salts&nbsp;</td><td>Aquarium Systems Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세혈관&nbsp;</td><td>셔터 기기 Inc</td><td>BF100-78-10</td><td>1mm O.D. X 0.78mm I.D.</td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러 장치&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Inc</td><td></td><td>Flamming/Brown Micropipette Puller p-87</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Tritech Research&nbsp;</td><td></td><td>디지털 마이크로인젝터, MINJ-D</td></tr><tr><td>트위저</td><td>사이언스 툴 inc</td><td></td><td>Dumont # M5S&nbsp;</td></tr><tr><td>Microloader 팁</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

영상 병인과의 cording를 해독하고<em&gt; 미코 농양</em&gt; zebrafish의 배아에서

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

제브라피시(Danio rerio) 배아는 숙주-병원체 상호 작용에서 척추동물의 선천성 면역 체계의 기능을 연구하기 위한 감염 모델로 점점 더 많이 사용되고 있습니다.많은 수의 배아를 쉽게 얻을 수 있는 것, 외부 발달로 인한 접근성, 광학적 투명성, 광범위한 유전/면역학 도구 및 형질전환 리포터 라인 컬렉션의 가용성, 이 모델의 다양성에 기여합니다.이와 관련하여, 본 원고는 Mycobacterium abscessus 감염의 연대기를 조사하기 위한 생체 내 모델 시스템으로 제브라피시를 사용하는 것을 설명합니다. 이 인간 병원체는 세포벽 구성에 따라 매끄럽게(S) 또는 거친(R) 변이체로 존재할 수 있으며, 제브라피시 배아와 유충에서 각각의 독성을 이미지화하고 비교할 수 있습니다. S 또는 R 형광 변이체를 꼬리 정맥을 통해 혈액 순환에 직접 미세 주입하면 각각 만성 또는 급성/치명적 감염을 유발합니다. 이 생물학적 시스템을 통해 농양 형성을 촉진하는 마이코박테리아 코딩의 역할을 고해상도로 시각화하고 분석할 수 있습니다. 또한 형광 대식세포를 보유한 형질전환 제브라피시 계통과 함께 형광 박테리아를 사용하면 숙주-병원체 상호 작용의 다중 색상 이미징을 위한 고유한 기회를 얻을 수 있습니다. 이 논문은 균질한 M. abscessus inoculum의 준비 및 대식세포와의 상호 작용에 대한 후속 형광 이미징을 위한 제브라피시 배아의 정맥 주사에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 기술은 탯줄 형성에 결함이 있는 돌연변이와 관련된 향후 조사의 길을 열었으며 이것이 전체 척추 동물의 M. 농양 병원성에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 전념하고 있습니다.

다양한 해부학 적 부위 (32)를 주입 할 수 있지만, 꼬리 정맥 주사는 종종 생존 실험 세균 부담 결정, 식세포 작용 활성 또는 코드를 포함하여 형성 후속 분석을위한 전신 감염을 생성하는 데 사용된다. 꼬리 근육 주사 주입 (그림 3A)의 사이트에있는 대 식세포의 모집을 평가하는 데 사용됩니다. 조사 엠의 R과 S 변종의 독성을 비교하려면 농양, 형광 박테리아 현탁액은 30 HPF 배아 (그림 3A) (19)의 꼬리 정맥에 주입된다. S 변이체는 대조적으로, R의 morphotype 중추 신경계 (CNS) (도 3c) 내에 세균성 농양의 급속한 발전에 의해 특징 지브라 피쉬 배아 (도 3B)에서 더욱 강력하고 치명적인 감염을 유발한다. R과 S 변종 모두 전신 주사는 중추 신경계 감염과 차이가 발생할병리학 및 독성 표현형은 형광 현미경...

광학적으로 투명한 제브라피시 배아는 병원성 미생물과 선천성 면역 세포 간의 상호 작용을 실시간으로 연구하고 시각화하는 데 널리 사용됩니다. 형광 이미징과 결합된 Mycobacterium abscessus의 미세 주입은 제브라피시 배아의 탯줄 형성과 같은 필수 병원성 특징을 면밀히 조사하는 데 사용됩니다.

영상 병인과의 Cording를 해독하고<em&gt; 미코 농양</em&gt; Zebrafish의 배아에서

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

이 실험 절차의 전체적인 목적은 Mycobacterium abscessus 균주의 병원성을 연구 및 비교하고, 투명 제브라피시 배아를 이용하여 생체 내(in vivo)에서 이 박테리아와 숙주의 선천성 면역 체계 간의 상호작용을 기술하는 것입니다. 이를 위해 먼저 균질한 박테리아 접종액을 준비합니다. 그 다음, 수정 후 30시간이 지난 배아에 박테리아 현탁액을 정맥 주사합니다.또한, 감염 제어에 있어 대식세포의 역할을 더 정밀하게 연구하기 위해, lipo choate 기반의 주입 절차를 사용하여 대식세포가 제거된 배아를 생성합니다. 마지막으로, 감염된 배아를 준비하고 형광 및 공초점 현미경을 사용하여 이미징함으로써 감염의 진행 과정을 모니터링합니다. 최종적으로 얻은 결과에서는 투명한 배아 내부에서 형광 표지된 식세포와 M abscessus 사이의 특이적 상호작용을 개별적인 구균 또는 구불구불한 코드 형태로 확인할 수 있습니다.생쥐와 같은 다른 동물 모델보다 제브라피시를 사용하는 주요 장점은 감염 과정을 실시간으로 구체적으로 조사할 수 있으며, *Mycobacterium abscessus*와 대식세포 또는 호중구 사이의 특정한 상호작용을 이미지로 연구할 수 있다는 점입니다. 이 단계는 이후 제브라피시로의 주입 압력을 결정하는 매우 중요한 문제입니다. 거친 형태의 *Mycobacterium abscessus*는 커다란 응집체를 형성하고 코드(codes)를 생성하는 경향이 강하므로, 미세 주입 전에 균질하고 정량적으로 제어된 접종물을 준비하기 위한 특수 처리가 필요합니다.m abscessus를 준비하려면, 150 square centimeter 조직 배양 플라스크에서 대수 성장기 배양물을 수확하여 50 milliliter 멸균 플라스틱 튜브에 접종하고, 상온에서 4,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. OADC 강화제와 tween 80이 첨가된 Middlebrook 7H9(이하 7H9 배지로 지칭) 1 milliliter를 사용하여 펠렛을 재현탁합니다. 박테리아 현탁액 200 µL를 26 gauge 바늘을 사용하여 1.5 milliliter 튜브에 분주합니다. 각 박테리아 현탁액 분주액을 15회 균질화합니다.그 다음 워터배스 소니케이터를 사용하여 10초 간격으로 3회 소니케이션을 수행하고, 각 횟수 사이에 10초의 휴지 시간을 둡니다. 그 사이에 7H9 배지 1mL를 첨가하여 짧게 볼텍싱한 후, 100 ×g에서

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

투명 zebrafish의 배아는 다음과 같은 시각화하는 유용한 모델 호스트와 타고난 면역 세포와 세포 세균성 병원체 간의 기능상 학습 상호 작용을...

세포내 세균성 병원균과 Zebrafish 태아의 감염

zebrafish의 급속한 발전, 소형 크기 및 투명성은 감염의 타고난 면역 제어 연구를위한 엄청난...

Zebrafish 애벌레의 분해해 칸디다 증의 비침습 이미징

이 비디오는 형질전환 제브라피시 배아의 주위 공간으로 유방암 세포를 전달하는 미세주입 방법을 설명합니다. 배양 후, 형광 현미경으로 배아를 시각화하여 암세포의 침입, 전파 및 전이를 관찰합니다.

zPDX-침습성 분석: 제브라피시 배아 이종이식편에서 전이성 암세포의 침습적 행동 조사

출처: Zhang, X., et al. 생체 재료 관련 황색포도상구 균 감염의 생체 내 시각화 및 생체 내 분석을 위한 제브라피쉬 배아 모델. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 황색포도상구균을 주입한 제브라피쉬 배아의 형광 이미징을 보여주며, 감염 진행 및 박테리아 분포를 정량화하여 생체 내 숙주-병원체 상호 작용에 대한 생체 재료 마이크로스피어의 영향을 평가할 수 있습니다.

 제브라피쉬 배아에서 생체 재료 관련 세균 감염의 형광 이미징

출처: Niu, L. 외. 제브라피시 배아에서 마이코박테리아 감염 중 대식세포 용해세포 사멸을 생체 내 현미경을 통해 시각화합니다. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 마이코박테리움 마리눔 감염 후 제브라피시 배아에서 대식세포 용해세포 사멸을 시각화하기 위해 생체 내 공초점 현미경을 사용해 보여줍니다.

제브라피시 배아에서 마이코박테리아 감염 중 대식세포 사사의 실시간 영상

출처: Bernut, A. 외, 얼룩말피시 배아에서 Mycobacterium absrumus 의 발병기전 해독 및 영상 분석. J . Vis. Exp. (2015).이 영상은 감염된 제브라피시 배아에서 Mycobacterium abscessus 를 분리하고 정량화하는 프로토콜을 시연합니다. 이 절차는 배아 안락사, 조직 용해, 균질화를 통해 박테리아를 방출한 후, 원심분리 및 계면활성제 완충제 내 재현탁을 포함합니다. 마지막으로, 박테리아 현탁액을 연속적으로 희석하여 항생제 보조 한천에 도판한 후 배양하여 집락 형성과 정량화를 가능하게 합니다.

제브라피시 배아에서 박테리아 분리 및 배양하여 감염 용량 평가

출처: 버넛, A. 외. 제브라피시 배아에서 마이코박테리아 아브스페서스 의 발병 및 분석 해독 및 영상화. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 형광 대식세포를 발현하고 형광성 Mycobacterium abscessus 거친 균주에 감염된 형질전환 제브라피시 배아를 사용하여 숙주-병원체 상호작용을 시각화하는 프로토콜을 시연합니다. 이 연구는 세포외 연결이 면역 회피를 가능하게 하여 박테리아 생존과 숙주 세포 손상을 촉진하는 방식을 밝혀냅니다.

마이코박테리움 abscessus에 감염된 제브라피시 배아에서 숙주-병원체 상호작용의 라이브 이미징

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

현재 학문 vivo에서 시각화 및 형광 현미경 검사 법에 따라 시간이 지나면 소재 관련 감염의 intravital 분석을 위한 zebrafish 태아 모델을 설명 합니다. 이 모델은 소재 관련 감염 vivo에서 공부에 대 한 마우스 모델 같은 포유류 동물 모델을 보완 하는 유망한 시스템.

Zebrafish 태아 모델 Vivo 시각화 및 Intravital 소재 분석 관련 된 황색 포도상구균 에 감염

이 프로토콜은 마이코박테리움 마리눔 감염 동안 배아 제브라피시의 대식세포 행동 및 사망을 시각화하는 기술을 설명합니다. 박테리아의 준비, 배아감염 및 활력 내 현미경 검사법 에 대한 단계가 포함되어 있습니다. 이 기술은 감염 또는 멸균 염증을 관련시키는 유사한 시나리오에 있는 세포 행동 그리고 죽음의 관측에 적용될 수 있습니다.

제브라피시 배아에서 사체내 현미경 검사를 통해 진균 감염 시 대식세포 리액세포 사멸 시 시각화

배우세요 Mycobacterium abscessus의 독성을 비교하고 제브라피쉬 배아에서 선천면역계와의 상호작용을 형광현미경으로 관찰하는 방법을. 거대식세포의 감염 조절 역할을 실시간으로 연구할 수 있습니다.

영상 병인과의 Cording를 해독하고

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