높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

이 절차의 전반적인 목표는 고속 스크리닝 방법을 사용하여 관심 기질을 인산화하는 키나아제를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 glutathione S-transferase 또는 GST로 융합된 키나아제를 발현하는 플라스미드를 세포에 형질전환함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 GST 키나아제 풀다운을 실시하는 것입니다.

다음으로, 샘플을 젤에 로딩한 후 전기영동을 수행하고 kumasi brilliant blue 염료로 염색합니다. 마지막 단계는 젤을 건조시킨 후 자동 방사선 촬영 필름에 노출시키는 것입니다. 최종적으로 결과 필름을 현상하고 해석함으로써 kinase substrate 쌍을 식별할 수 있으며, 각 레인은 서로 다른 kinase assay를 나타냅니다.

기존에 알려진 인산화 기질에 대한 키나아제를 식별하는 방법으로는 기질 내의 합의 서열(consensus site)을 검색하는 생물정보학적 접근법, 생화학적 기술과 시행착오법을 이용한 키나아제와 기질 사이의 복합체 검출, 알려진 생물학적 기능을 기반으로 한 합의 기질 검색 등이 있습니다. 이러한 접근 방식은 시간이 많이 소요되며 항상 성공적인 결과를 얻는 것은 아닙니다. 본 연구의 접근법은 기능적 결과에 기반하여 키나아제-기질 쌍을 신속하게 식별할 수 있게 합니다.

이 방법의 아이디어를 처음 구상했을 때, 저희는 in vitro에서 특이성이 부족할 것을 우려했습니다. 하지만 결과적으로 기질 특이성이 매우 뛰어난 것으로 나타났으며, 스크리닝 과정에서 특정 기질을 인산화할 수 있는 것은 주로 동일 패밀리 멤버 키나아제뿐이라는 점을 자주 확인했습니다. 이는 각 스크리닝에서 여러 기질을 사용하여 멀티플렉싱을 수행할 때 특히 분명하게 드러나며, 이 절차의 유효성을 입증합니다. 제 실험실의 기술자인 Courtney가 시연하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 시약, 플레이트 및 세포 준비부터 절차를 시작하십시오.

키나제 플라스미드가 포함된 플레이트를 냉동 보관했다면, 상온에서 해동한 후 1900 ×g에서 3분간 원심분리하여 웰 바닥에 응결된 수분을 제거합니다. 8.6 mL의 저혈청 배지와 312.7 µL의 지질 기반 트랜스펙션 시약을 혼합하고, 혼합물을 5분간 방치합니다. 키나제 플라스미드가 포함된 96-웰 플레이트의 각 웰에 저혈청 배지 10 µL를 분주합니다.

소량 카세트가 장착된 자동 액체 분주기를 사용하여 웰당 10 µL의 저혈청 배지 트랜스펙션 시약 혼합물을 첨가하고, 플레이트를 20분에서 45분 동안 그대로 둡니다. 다음으로, 293 T 세포를 0.75 million cells/mL 농도로 complete delcos modified equals medium 또는 DMEM 80 mL에 재현탁한 후, 소량 카세트가 장착된 자동 액체 분주기를 사용하여 웰당 100 µL의 세포 현탁액을 분주합니다. 현미경으로 웰 내 세포가 균일하게 분포되었는지 확인한 후, 플레이트를 37 °C 인큐베이터로 옮겨 24시간 동안 배양합니다.

GST kinase pull-down 실험을 시작하려면, 먼저 0.2 M sodium vanadate 60 µL와 물 540 µL를 혼합하여 4 mM vanadate 용액을 만듭니다. 두 번째 튜브에 30% peroxide 2.7 µL와 phosphate buffered saline(PBS) 1.4 mL를 혼합합니다. 이 두 용액을 함께 섞은 후, 사용 전 15분 동안 그대로 둡니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 0.25 M calcium chloride 2 µL를 분주한 다음, 검증된 날짜 용액 2.5 µL를 분주합니다. 각 플레이트를 37 °C에서 10분 동안 배양한 후, 얼음 위에 올려 플레이트 상태를 유지합니다. 각 웰에서 배지를 제거하고, 즉시 웰당 50 µL의 ice cold lysis buffer를 진공 장치로 가합니다.

표준 카세트가 장착된 자동 액체 분주기를 사용하여 플레이트를 얼음 위에서 30분 동안 방치하여 세포를 용해합니다. 4°C에서 1900 ×g로 3분 동안 플레이트를 원심 분리한 후, 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 세포를 긁어내어 적절하게 라벨링된 vbo. 96웰 플레이트로 모든 내용물을 옮깁니다. 플레이트를 4°C에서 1900 ×g로 10분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리하는 동안 글루타치온 코팅 플레이트의 각 웰에 얼음처럼 차가운 용해 버퍼 100 µL를 채웁니다.

세척 과정 동안 플레이트를 얼음 위에 보관하십시오. 하단 플레이트의 원심분리가 끝나면, 글루타치온 플레이트를 싱크대 위에서 뒤집어 용해 버퍼를 털어내고 종이 타월로 닦아냅니다. V자형 바닥 플레이트의 용해 버퍼를 플레이트를 기울인 상태에서 멀티 채널 피펫을 사용하여 글루타치온 플레이트로 옮기되, 바닥의 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오.

그 다음 플레이트를 덮고 최소 2시간 동안 얼음 위에 둡니다. 2시간의 결합 단계가 끝나갈 무렵, 방사성 물질 작업에 필요한 안전 예방 조치가 갖추어졌는지 확인하며 방사성 작업대를 준비합니다. 하이브리드화 오븐을 30°C로 설정합니다.

글루타치온 플레이트를 싱크대 위에서 뒤집어 용해 버퍼를 털어낸 후 페이퍼 타월로 닦아냅니다. PMSF가 포함되지 않은 용해 버퍼 100 µL로 웰을 세 번 헹굽니다. 웰이 마르지 않도록 주의하십시오.

다음 단계를 진행할 준비가 될 때까지 세척액에 보관하십시오. 그다음, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 55 milliliters의 1X kinase buffer 또는 1X KB를 준비합니다. 표준 부피 카세트가 장착된 자동 액체 분주기를 사용하여 플레이트의 각 웰에 50 microliters의 1X KB를 첨가합니다.

그런 다음 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 관심 기질과 myelin basic protein 또는 MVP를 포함하는 용액 A를 각각 준비합니다. 플레이트를 싱크대 위에서 뒤집어 1X KB 세척액을 종이 타월로 제거하고, 즉시 소량 카세트가 장착된 자동 액체 분주기를 사용하여 용액 A 30 µL를 첨가합니다. 플레이트를 얼음 위에 보관하십시오.

다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 방사성 물질 작업 구역에서 웰당 20 µL의 용액 B를 준비합니다. 분출력으로 인한 혼합 효과를 주는 리피터 피펫을 사용하여 플레이트를 덮고, 30 °C 하이브리드화 오븐에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 플레이트를 다시 얼음 위로 옮깁니다.

그다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 2x sodium dodecyl sulfate 또는 SDS 용해 버퍼 50 µL를 첨가합니다. 이 섹션의 모든 작업은 방사성 물질 지정 구역에서 수행해야 합니다. 하이브리다이제이션 오븐의 전원을 켜고 온도를 85 °C로 설정합니다.

오븐이 설정 온도에 도달하면, 플레이트를 오븐으로 옮겨 10분 동안 인큐베이션하여 샘플을 변성시킵니다. 다음으로, 26웰 프리캐스트 겔에 각 반응액 15 µL를 로딩합니다.

멀티 채널 파이펫을 사용하여 여러 웰을 동시에 채울 때는 모든 팁이 해당 웰과 일치하도록 주의해야 합니다. 샘플을 추가하기 전에 겔을 150 volts에서 전기영동합니다. 결합되지 않은 ATP가 포함되어 있으므로 청색 라인이 겔 바닥 밖으로 나가지 않도록 하십시오. 그런 다음 겔을 분해하고 결합되지 않은 ATP를 제거하십시오. 이를 제거하지 않으면 필름의 겔 노출 시 겔이 어둡게 나타날 수 있습니다.

라벨이 부착된 용기에 겔을 넣고 kumasi stain으로 15분 동안 덮어둡니다. 그다음, kumasi stain을 제거합니다. 겔을 물로 짧게 헹군 후 detain solution을 첨가합니다.

단백질이 명확하게 보일 때까지 겔을 방치합니다. 각 샘플에서 MVP 밴드와 기질 밴드가 관찰되어야 합니다. 겔을 건조하려면 커다란 필터 페이퍼 시트를 잘라 건조기 위에 놓으십시오.

셀로판 시트를 증류수로 적셔 표면이 매끄럽고 주름이 없게 만든 후 종이 위에 놓습니다. 겔의 순서를 기록하며 셀로판 시트 위에 겔들을 올립니다. 두 번째 셀로판 시트를 적셔 겔들 위에 덮습니다.

균일한 표면을 만들기 위해 모든 기포를 밀어내어 제거합니다. 덮개를 닫고 진공 장치를 켠 후 80 °C에서 3시간 동안 젤을 건조시킵니다. 젤이 건조되면, 신호를 증폭시키기 위해 스크린을 사용하여 이중 유제 자동 방사선 사진 필름에 노출시킵니다.

카세트를 새런랩이나 비닐봉지로 감싼 후 테이프로 밀봉하여 성에가 생기지 않도록 하고, -80°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 다음 날, 냉동고에서 카세트를 꺼내 실온에서 해동하십시오. 표시된 제조업체의 지침에 따라 암실에서 필름 프로세서를 사용하여 필름을 현상하십시오.

다음은 180종의 키나아제를 대상으로 한 스크리닝의 대표적인 결과입니다. kreb 조절 전사 공활성화 인자 2(CRTC2)의 268번부터 283번 아미노산에 해당하는 GST 태그 펩타이드 기질과 전형적인 키나아제 분석 기질인 myelin basic protein(MBP)를 사용하여 스크리닝을 진행하였습니다. 그 결과, Mark2와 이와 밀접하게 관련된 키나아제인 Mark3만이 CRTC2 펩타이드를 인산화시켰습니다. MBP는 인산화 가능한 잔기를 다수 포함하고 있으며 겔의 하단부인 18 kilodaltons에서 이동하므로, 모든 분석에서 내부 대조군으로 포함되었습니다.

이를 통해 특이성에 대한 해석이 가능합니다. 일부 인산화효소는 기질과 MVP를 강력하게 인산화합니다. 여기서 주목할 점은 GST만 포함된 웰에서 항상 일부 내인성 인산화효소 활성이 정제된다는 것입니다.

따라서 분석 시 항상 배경 인산화가 발생합니다. 이것이 기질의 인산화가 실제라는 사실을 부정하는 것은 아니지만, 인 비트로(in vitro) 환경에서는 키나아제의 선택성이 낮아질 수 있음을 시사합니다. 키나아제 기질 특이성에 관한 결론을 도출하기 위해서는 서로 다른 분자량을 가진 여러 기질을 포함하는 것이 특히 유용합니다.

본 스크리닝은 in vitro에서 수행되었으며 in vivo에서는 추가적인 복잡성이 발생하므로, 후보 키나아제는 세포 내에서 검증되어야 합니다. 예를 들어, 후보 키나아제가 in vitro에서 기질을 인산화할 수 있는 능력이 있더라도, 해당 기질과 동일한 세포 유형이나 세포 내 구획의 동일한 하위 부위에 발현되지 않을 수 있습니다. 이는 일반적으로 RNAi 매개로 후보 유전자를 사일런싱하여 수행합니다.

또한 특이성을 확인하기 위해 기질의 비인산화 가능 돌연변이체를 사용하여 2차 스크리닝을 수행할 수 있습니다.