Name: 높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 배우세요 고처리량 검열을 사용하여 특정 기질을 인산화하는 키나제를 식별하는 방법을. GST 풀다운과 방사성 자기영상을 활용한 이 프로토콜은 세포 신호 전달 연구에 필수적인 키나제-기질 상호작용을 효율적으로 분석합니다.

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이 작품은 NSERC 부여에 의해 지원되었다 386634. 우리는 도움이 토론 Screaton 연구소의 회원들에게 감사의 말씀을 전합니다.

시약, 플레이트, 및 세포의 1. 준비 <ol><li> 25 mM 트리스 pH가 7.5, 150 mM의 염화나트륨, 50 mM의 불화 나트륨, 0.5 mM의 EDTA pH를 8.0, 0.5 % 트리톤-100, 5mM의 베타 - 글리세로 포스페이트, 5 % 글리세롤 : 500 ml의 용해 완충액을 만든다. 4 ℃에서 보관하십시오. 사용 1 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT), 1 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 및 1 mM의 나트륨 바나 데이트를 추가하기 직전. 이 단계 후에, PMSF가 임의의 세정 완충액으로 요구되지 않는다. </li><li> 200 mM 트리스의 pH 7.5, 50 mM의 베타 글리세 (FW 216), 2 mM의 나트륨 바나 데이트 : 10 배 키나제 버퍼의 20 mL로한다. -20 ° C에서 1 ml의 튜브에 나누어지는 및 저장. 사용 5 mM의 DTT를 추가하기 직전. </li><li> 300 μM 아데노신 삼인산 (ATP), 66 밀리미터의 MgCl 2, -20 ° C에서 33 mM의 MnCl 2 1 ml의 튜브에 나누어 저장 : 10 배 M-ATP 버퍼의 20 mL로한다. </li><li> 배 도데 실 황산나트륨 100 mL로 (SDS)를 용해 완충액 : 1.5 g 트리스베이스, 글리세롤 20 ㎖, 30 ㎖의 H 2 O. 용해 및 HCl로 6.8에 산도를 조정합니다. 40 추가ml의 10 % SDS는 100 ㎖에 볼륨을 조정합니다. 25 mg의 브로 모 페놀 블루를 추가합니다. </li><li> 스팟 따라 96 웰 플레이트와 라벨 플레이트 세트에서 잘 당 GST-키나제 (14)를 인코딩 (25) NG / μL 포유 동물 발현 플라스미드의 4 μL. 사용할 때까지 -20 ° C에서 인감 및 동결 판. </li><li> 형질 전환 1-2 일 전에, CO 2 (최종 5 %)로 보충 된 37 ℃ 배양기에서 배양 HEK293T의 완전한 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) + 10 % 소 태아 혈청 (FBS)과 항생 물질의 세포. 트립신과 통로는 주식이 확장시&gt; 80 % 합류가 될 수 없습니다. 6 × 10 7 세포의 최소 화면 (80 % 합류에 HEK293T 세포의 약 3 × 15cm 요리)가 필요합니다. </li></ol> 2. 형질 참고 : 전체 프로토콜의 흐름도는 그림 1을 참조하십시오. <ol><li> 키나아제 플라스미드를 함유하는 플레이트를 동결 되었으면, 실온에서 해동차 우물의 바닥에서 습기를 수집하기 위해 3 분 동안 1,900 XG에 원심 분리기. </li><li> 지질 기반 형질 전환 시약의 312.7 μL와 감소 혈청 배지 (예를 들어, OPTI-MEM)의 8.6 ml의 혼합. 5 분 동안 앉아 보자. </li><li> 작은 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 각 웰에 감소 혈청 매체의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 작은 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용 단계 2.2에서 감소 된 혈청 배지 / 형질 전환 시약 믹스 잘 당 10 μl를 추가합니다. 20-45 분 동안 앉아 보자. </li><li> 전체 80ml의 DMEM에 7.5 × 105 세포 / ml로 재현 탁 293T 세포. 잘 표준 볼륨 카세트 ​​장착 자동 액체 디스펜서를 사용하여 당 세포 현탁액 (즉, 7.5 × 10 4 세포)의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 균일 한 세포 분포에 대한 현미경으로 우물을 확인하고 24 시간 동안 인큐베이터로 돌아갑니다. </li></ol> 3. GST-키나제 풀다운 <ol><li> F 확인resh : H 2 O의 540 μL와 0.2 M 나트륨 바나 데이트 60 μl를 혼합하여 4 mM의 pervanadate 솔루션 제 2 튜브 믹스 30 % 과산화수소 2.7 μL와 PBS 1.4 ml 중에. 함께 두 가지 솔루션을 추가하고 사용하기 전에 15 분 동안 앉아 보자. </li><li> (이것은 또한 너무 많은 난류를 생성로서 자동화 액체 디스펜서를 사용하지 않는) 단계 3.1에서 제조 pervanadate 2.5 μL,이어서 각 웰에 0.25 M CaCl2를 2 μL 분주 멀티 채널 피펫을 사용. 10 분 동안 37 ℃에서 각각의 판을 품어 후 얼음에 배치합니다. </li><li> 제 1 (시약의 제조)에 나타낸 바와 같이 DTT, PMSF, 나트륨 바나 데이트를 첨가하여 용해 완충액 35 mL로 제조. </li><li> 얼음에 판을 유지, 각 웰 진공 흡입기를 사용하는 매체를 제거합니다. 즉시 표준 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 50 μL / 웰의 차가운 얼음 용해 버퍼를 추가합니다. 를 Lyse에 얼음에 30 분 앉아 보자 (옵션 : 작은지면을 밀봉하여 여기에 필요한 경우 중지 할 수 있습니다전자 및 -80 ° C에서 저장. 얼음에, 해동 판)을 계속합니다. </li><li> 4 ℃에서 3 분 동안 1,900 XG에 스핀 판. </li><li> 각 웰 멀티 채널 피펫을 사용하는 세포를 긁고 모든 내용을 전송 적절 V 바닥 96 웰 플레이트를 표시합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,900 XG에 스핀 판. </li><li> 회전하는 동안, 린스 100 μL / 웰의 (PMSF)없이 차가운 얼음 용해 버퍼와 글루타티온 코팅 된 플레이트 (각 96 웰 플레이트에 대해 하나)를 입력합니다. 얼음에 판을 보관하십시오. </li><li> 원심 분리기에서 V-바닥 플레이트를 제거합니다. 한 번에 하나는 종이 타월에 용해 버퍼와 얼룩을 흔들 싱크를 통해 글루타티온 판을 반전. 하단에있는 펠렛을 방해하지에주의하면서 판을 기울 멀티 채널 피펫을 사용하여 글루타티온 판에 V-바닥 판에서 용해 버퍼를 전송합니다. 판 커버와 결합하는 최소 2 시간 동안 얼음에 둡니다. </li><li> 2 시간 바인딩 단계의 마지막에 가까운, T을 보장 방사능 워크 스테이션을 준비그는 필요한 안전 조치는 방사성 작업 장소에 있습니다. 30 ° C로 설정 하이브리드 오븐. </li><li> 이 단계에서 필요하지 않은 제 1 절 PMSF에 표시된 추가 DTT 나트륨 바나 데이트에 의해 용해 완충액 200 ㎖를 준비합니다. </li><li> 용해 버퍼를 흔들 종이 타월에 가릴 수있는 싱크대 글루타티온 플레이트 전환. 헹구고 웰 (PMSF)없이 100 ㎕의 용해 완충액으로 3 배. 진행 할 준비가 될 때까지 세정에 보관 - 우물이 마른 앉게하지 마십시오. </li><li> 10 배 주식을 희석하고 표준 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 1X KB의 50 μL 1. 린스 판 한 번 섹션에 표시된대로 DTT를 추가하여 1X 키나제 버퍼 (KB) 55 mL로 준비합니다. 솔루션이 준비가 될 때까지 우물에 1X KB를 남겨주세요 : <ol><li> 15.9 ml의 최대 530 관심있는 기판의 μg의, 미엘린 염기성 단백질 500 μg의 (MBP), 10 배의 2.65 ml의 KB, 1 M DTT의 13.25 μL, 및 H 2 O 500을 추가하여 솔루션을 준비합니다. </li></ol></리&gt; <li> 한 번에 하나씩, 1X KB 린스를 제거 종이 수건에 오점, 바로 작은 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하는 솔루션의 30 μl를 추가 싱크대 위에 접시를 반전. 얼음에 판을 보관하십시오. </li><li> 2.5 ml의 10 배 M-ATP, 500 μCi를 감마 (32) P의 ATP, 및 H 2 O에 10 ㎖를 첨가하여 방사능 작업 영역 용액 B를 준비한다. <ol><li> 잘 배출 힘에 의한 혼합에 도움 리피터 피펫을 사용하여 당 용액 B 20 μl를 추가합니다. 덮고, 30 분 동안 30 ° C의 오븐에서 혼성화 부화. </li></ol></li><li> 30 분 후, 얼음에 다시 접시를 전송합니다. 각 웰 멀티 채널 피펫을 사용하여 2 배 SDS 용해 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 다음 단계로이 시점에서 진행, 또는 편리한 때까지 -20 ℃에서 알루미늄 호일 및 저장과 번호판을 봉인 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 달리기, 염색, 건조 젤 참고 : 모든 작업은 지역 DESIGNA에서 수행되어야한다방사능에 대한 테드. <ol><li> 하이브리드 오븐의 전원을 켜고 85 ℃로 설정합니다. 실온에서 해동 판. 일단 오븐 오븐 10 분 샘플을 변성하는 동안 배양 온도, 이전 판에 도달했습니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 반응의 15 μL와로드 26 웰 프리 캐스트 젤은 한 번에 여러 우물을 채우기 위해. 케어는 모든 팁 대응도 전에 샘플을 추가로 정렬 않도록주의해야합니다. 이 비법 인 ATP를 포함로 추적 염료 (파란 선)은 젤의 바닥 떨어져 실행하지 못하게 150 V.에서 젤을 실행합니다. </li><li> 젤을 해체하고 메스하거나 영화를 과다하므로 직선을 사용하여 비법 인 ATP (파란 선)을 차단. 라벨이 붙은 용기에 젤을 놓고 15 분 동안 쿠마 얼룩 커버. </li><li> 간단히, 쿠마 얼룩을 제거 물 젤을 씻어 및 솔루션을 destain 추가합니다. 젤 Destain 단백질은 명확하게 볼 수 있습니다 때까지. MBP를위한 밴드 및 기판 밴드해야각 샘플에 대한 표시. </li><li> 젤을 건조 : <ol><li> 필터 큰 종이를 잘라 건조기에 놓습니다. </li><li> 이 부드러운 때까지 증류수에 셀로판 시트를 적시고 무료 주름, 용지의 상단에 배치. </li><li> 젤의 순서를 기록하고, 셀로판 시트의 상단에 젤을 놓습니다. 두 번째 셀로판 시트를 적시고 젤 위에 놓습니다. </li><li> 좋은 균일 한 표면에 대한 모든 거품을 (플레이트 밀봉 롤러이 잘 작동) 출시. 플랩을 닫고 진공 켜고 80 ℃에서 3 시간 동안 젤을 건조. </li></ol></li><li> 겔이 건조되면, 신호를 강화하기 위해 스크린을 사용 XAR 필름에 노출. 사란 랩 또는 비닐 봉지와 카세트를 감싸고 서리을 유지하기 위해 테이프로 밀봉. -80 ° C 하룻밤에 카세트를 저장합니다. </li></ol> 5. XAR 필름 개발 <ol><li> 다음 날, 냉장고에서 카세트를 제거하고 실온에서 해동을 할 수 있습니다. 의 필름 개발암실은 제조자의 지시에 따른 필름을 사용하여 프로세서. 참고 : 키나제 기판 쌍의 증거에 대한 영화를 검사합니다. 두 번째 이상 노출도 약한 인산화 이벤트를 감지하는 데 유용 할 수 있습니다. </li></ol>

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14,15 접근법을 설명 원래 공보 이후, 180 GST-키나제의 원래 라이브러리는 인간 단백질 kinome 420 부재, 또는 ~ 80 %로 확대되었다. 확장 된 라이브러리와 같은 설명 프로토콜 (필요하다고 인정하는) phosphorimaging 및 디지털 신호 향상의 사용에 의해 단축 될 수있는 필름을 개발 4~5일 다음 1~4일 걸립니다. 주의를 기울여야합니다 몇 가지 주요 단계 (프로토콜의 개요를 그림 1 참조)이 있습니다. 우선, 세포의 콘텐츠의 상태이다 (마이코 플라스마 무료, 팽창 중에 합류에 도달 할 수 없다, 각 통로에서 트립신) 배치 팽창 단계 동안 및 트랜시의 96 웰 플레이트에서. 형질 장소 (단계 1.5)를 취한다 때 세포는 균일 시드, 그리고 80 %의 합류해야한다. 둘째로, 그것은 볼륨 TRANSF을 최소화 자동화 액체 분배기를 사용하는 형질 감염 동안 적합ER 오류, 따라서 웰 사이의 변동 계수 (...

단백질 번역 후 변형 (PTMS)는 세포 내 통신을위한 필수적이다. 아마도 모든 PTMS의 연구 최고 세포 내 현지화, 형태, 안정성, 생화학 적 활동을 포함한 단백질 기능의 무수를 조절 단백질 인산화 효소에 의해 촉매 인산화이다. 표적 단백질의 인산화 부위의 식별은 트립신 포스 포 매핑 또는 인산화 펩티드 1,2- 위해 농축 된 샘플을 이용하여 현재 표준 프로테옴 기법에 의해 달성 될 수있다. 발현 프로테옴 사분의 삼가 3 인산화 될 것으로 예상하고 100 만 6까지 예상치 200,000 인산화 부위 5를 식별하는 동안, 이들의 대부분은 통로 또는 단백질 키나제 시그널링 어떠한 할당 생물학 없다. 인산화 사이트의 식별은 비교적 큰 도전이고, 비교적 간단하지만기판 쌍 :이 사이트를 대상으로 동족 키나제 (들), 우리가 매핑 키나제로 참조하는 프로세스를 식별합니다. 기판 쌍이 설명되었지만, 어느 주목 키나아제로 시작하고 그 기판을 찾고 관심 또는 기판에서 시작하여 개질 키나아제 7-11 또는 실험적 계산 (12)을 찾기 위해 시도 : 키나아제를 식별하기위한 여러 가지 방법. 공지 인산화 기판 키나제를 식별하는, 생물 정보학 기판과 강수량 복합체를 형성 키나제 인산화 잔사 (컨센서스 사이트) 측면뿐만 아니라 식별 아미노산의 짧은 보존 된 서열을 포함하는 단백질을 식별하는 데 사용될 수있다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되어 종종 성공을 충족하지 않습니다. 우리는 주어진 빠르게 기판 (13)을 인산화 키나아제를 식별 체계적인 접근 기능을 개발 하였다. 스크린 분석법 우수한 특정을 생산잠재적 인 동족 키나제에 대한 아주 명확한 선택과 성만. 생물학적 신호에 인산화의 중심성을 감안할 때, 스크린은 거의 모든 세포 신호 전달 경로 14-16에서 발견에 유용합니다. 스크린은 인간 단백질 키나제의 라이브러리로 대규모 키나아제 분석을 수행하는 것을 포함한다. 키나아제는 박테리아 글루타치온 S 트랜스퍼 라제 (GST) 단백질로 태그 된 재조합 효소 즉, 포유 동물 세포 추출물로부터 정제 - 박테리아로부터 제조 된 것과 달리 - 종종 필요한 상류 단백질 키나제의 존재하에 생성되고 재조합 효소는 시험 관내에서 활성을 갖는. 세린, 트레오닌 및 티로신 키나제 활성이 하류 키나제 활성화에 필요하면서 실제로 효모 (10)에 존재하는, 효모 게놈은 500 유전자 17 포유류 kinome는,하기 위해 훨씬 더 복잡해질 것을 나타내는, 122 단백질 키나제를 코딩 REGULA고차 생물에 고유의 프로세스를 테. 또한, 세포 생물학 및 (등과 소분자, 성장 인자, 호르몬 등) 인간의 질병과 관련된 다른 자극의 효과는 적절한 컨텍스트 (14, 15)는 조절 키나제 활성에 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>용해 완충액</td> 사<td>내에서</td><td></td> 제작 <td>프로토콜 단계 1.1</td></tr><tr><td>10x 키나아제 완충액</td><td>사내에서</td><td></td> 제작 <td>프로토콜 단계 1.2</td></tr><tr><td>참조 10x M-ATP</td><td>사내에서</td><td></td> 제조 <td>프로토콜 단계 1.3</td></tr><tr><td>인간 키나아제 플라스미드</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>GST 태그 하우스</td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td> <td>참조</td></tr><tr><td>293T 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>100&nbsp 보충제; U/ml 페니실린, 100&nbsp; &#956; g/ml 스트렙토마이신, 10% 태아 송아지 혈청.</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15cm 세포 배양 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>환원 혈청 배지</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>지질 기반 형질 주입 시약</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>자동 액체 분주기</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>소형 카세트 부착</td>물 <td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>표준 카세트 부착</td>물 <td>Thermo Scientific</td><td></td> 14072670 <td></td></tr><tr><td>4 mM pervanadate</td><td>사내에서</td><td></td> 제작 프로토콜 <td>단계 3.1</td></tr><tr><td>0.25 M CaCl2</td><td>사내</td><td></td><td></td>제작</tr><tr><td>멀티채널 피펫 (20-200 &#956; l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫 (1-10 &#956; l)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 6-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온 코팅 96-웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 오븐</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GST 태그 기질</td><td>사내</td><td></td><td></td>제작</tr><tr><td>미엘린 염기성 단백질(MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>리피터 피펫 (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>32P 감마-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS 용해 버퍼 (100&nbsp; ml)</td><td>집에서</td><td></td> 제작 <td>프로토콜 단계 1.4</td></tr><tr><td>참조 26-웰 프리캐스트 TGX 겔</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>겔 필요한 비율은 관심 기질의 분자량에 따라 달라집니다</td></tr><tr><td>쿠마시 염색</td><td>집에서</td><td></td> 제조 <td>0.1% 쿠마시 R250, 10% 아세트산, 40% 메탄올</td></tr><tr><td>쿠마시 염색</td><td>집에서</td><td></td> 제조 <td>10% 아세트산, 20% 메탄올</td></tr><tr><td>라벨이 붙은 젤 용기</td><td>집에서</td><td></td> 만든 <td>빈 팁 상자에서 나온 플라스틱 뚜껑을 사용했으며, 젤 Whatman 여과지 하나를 담을 수 있을 만큼 큰</td></tr> 크기입니다 <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>셀로판 시트 (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>젤 건조기</td><td>Labconco 4330150</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이중 에멀젼 자가방사선 촬영 필름</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>필름 카세트</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>강화 스크린</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 씰링 고무 롤러</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

우리는 새로운 신호 전달 경로를 밝히기 위해 사용될 수 인산화 기판 전용 인간 단백질 키나제를 식별하기위한 스크리닝 플랫폼을 개발했다. 우리의 접근 방식은 정제 GST - 태그 인간의 단백질 키나아제의 라이브러리와 관심의 재조합 단백질 기판의 사용을 특징으로한다. 우리는, CREB-규제 전사 보조 활성화 인자 2 (CRTC2)에 글루코스 조절 사이트 키나아제 MAP / 미세 소관 연관 조절 키나제 2 (MARK2)를 식별하는 베타 세포의 증식에 필요한 단백질뿐만 아니라을이 기술을 사용한 티로신의 액슬 제품군은 어댑터 단백질 엘모의 인산화에 의한 세포 전이의 규제로 키나아제. 우리는이 기술을 설명하고 세포가 환경 자극에 반응하는 방법의 포괄적 인지도를 구축하는 데 도움이 될 수 있습니다 방법에 대해 설명합니다.

화면에서 대표적인 결과는도 2에 도시되어있다. 180 키나아제는 CRTC2뿐만 아니라 고전 키나아제 검정 기질 미엘린 염기성 단백질 (MBP)로부터 AA 2백68부터 2백83까지 대응 GST 표지 된 펩티드 기질을 사용하여 스크리닝 하였다. 단 두 키나제, MARK2와 매우 관련 키나아제 MARK3는 CRTC2 펩타이드를 인산화. 그것은 많은 phosphorylatable 잔류 물을 포함하고 젤의 아래쪽으로, 18 kDa의에서 실행되는 MBP, 모든 분석에서 내부 통제 포함되어 있습니다. 이 특이성의 해석을 허용 : 일부 키나제는 견고 기판과 MBP를 인산화합니다. 여기에 참고로하여 항상 분석에서 배경 인산화가, (노 키나제 컨트롤 IE) 혼자 GST가 포함 된 우물은 항상 어떤 내인성 키나제 활성을 정화한다는 것입니다. 이 기판의 인산화가 진짜임을 배제하지 않지만, 그것은 이하 선택적 일 수있다 키나아제 설정 체외에서 그 제안 않는다.그것은 키나제 - 기질 특이성...

단백질 인산화는 세포가 세포 외 환경에서 정보를 해석하고 반응하는 방법의 핵심 기능입니다. 여기에서는 포유류 세포에서 정제된 kinase를 사용하여 관심 기질을 인산화하는 kinase를 신속하게 식별하는 고처리량 스크리닝 프로토콜을 제시합니다.


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

이 절차의 전반적인 목표는 고속 스크리닝 방법을 사용하여 관심 기질을 인산화하는 키나아제를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 glutathione S-transferase 또는 GST로 융합된 키나아제를 발현하는 플라스미드를 세포에 형질전환함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 GST 키나아제 풀다운을 실시하는 것입니다.다음으로, 샘플을 젤에 로딩한 후 전기영동을 수행하고 kumasi brilliant blue 염료로 염색합니다. 마지막 단계는 젤을 건조시킨 후 자동 방사선 촬영 필름에 노출시키는 것입니다. 최종적으로 결과 필름을 현상하고 해석함으로써 kinase substrate 쌍을 식별할 수 있으며, 각 레인은 서로 다른 kinase assay를 나타냅니다.기존에 알려진 인산화 기질에 대한 키나아제를 식별하는 방법으로는 기질 내의 합의 서열(consensus site)을 검색하는 생물정보학적 접근법, 생화학적 기술과 시행착오법을 이용한 키나아제와 기질 사이의 복합체 검출, 알려진 생물학적 기능을 기반으로 한 합의 기질 검색 등이 있습니다. 이러한 접근 방식은 시간이 많이 소요되며 항상 성공적인 결과를 얻는 것은 아닙니다. 본 연구의 접근법은 기능적 결과에 기반하여 키나아제-기질 쌍을 신속하게 식별할 수 있게 합니다.이 방법의 아이디어를 처음 구상했을 때, 저희는 in vitro에서 특이성이 부족할 것을 우려했습니다. 하지만 결과적으로 기질 특이성이 매우 뛰어난 것으로 나타났으며, 스크리닝 과정에서 특정 기질을 인산화할 수 있는 것은 주로 동일 패밀리 멤버 키나아제뿐이라는 점을 자주 확인했습니다. 이는 각 스크리닝에서 여러 기질을 사용하여 멀티플렉싱을 수행할 때 특히 분명하게 드러나며, 이 절차의 유효성을 입증합니다. 제 실험실의 기술자인 Courtney가 시연하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 시약, 플레이트 및 세포 준비부터 절차를 시작하십시오.키나제 플라스미드가 포함된 플레이트를 냉동 보관했다면, 상온에서 해동한 후 1900 ×g에서 3분간 원심분리하여 웰 바닥에 응결된 수분을 제거합니다. 8.6 mL의 저혈청 배지와 312.7 µL의 지질 기반 트랜스펙션 시약을 혼합하고, 혼합물을 5분간 방치합니다. 키나제 플라스미드가 포함된 96-웰 플레이트의 각 웰에 저혈청 배지 10 µL를 분주합니다.소량 카세트가 장착된 자동 액체 분주기를 사용하여 웰당 10 µL의 저혈청 배지 트랜스펙션 시약 혼합물을 첨가하고, 플레이트를 20분에서 45분 동안 그대로 둡니다. 다음으로, 293 T 세포를 0.75 million cells/mL 농도로 complete delcos modified equals medium 또는 DMEM 80 mL에 재현탁한 후, 소량 카세트가 장착된 자동 액체 분주기를 사용하여 웰당 100 µL의 세포 현탁액을 분주합니다. 현미경으로 웰 내 세포가 균일하게 분포되었는지 확인한 후, 플레이트를 37 °C 인큐베이터로 옮겨 24시간 동안 배양합니다.GST kinase pull-down 실험을 시작하려면, 먼저 0.2 M sodium vanadate 60 µL와 물 540 µL를 혼합하여 4 mM vanadate 용액을 만듭니다. 두 번째 튜브에 30% peroxide 2.7 µL와 phosphate buffered saline(PBS) 1.4 mL를 혼합합니다. 이 두 용액을 함께 섞은 후, 사용 전 15분 동안 그대로 둡니다.멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 0.25 M calcium chloride 2 µL를 분주한 다음, 검증된 날짜 용액 2.5 µL를 분주합니다. 각 플레이트를 37 °C에서 10분 동안 배양한 후, 얼음 위에 올려 플레이트 상태를 유지합니다. 각 웰에서 배지를 제거하고, 즉시 웰당 50 µL의 ice cold lysis buffer를 진공 장치로 가합니다.표준 카세트가 장착된 자동 액체 분주기를 사용하여 플레이트를 얼음 위에서 30분 동안 방치하여 세포를 용해합니다. 4°C에서 1900 ×g로 3분 동안 플레이트를 원심 분리한 후, 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 세포를 긁어내어 적절하게 라벨링된 vbo. 96웰 플레이트로 모든 내용물을 옮깁니다. 플레이트를 4°C에서 1900 ×g로 10분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리하는 동안 글루타치온 코팅 플레이트의 각 웰에 얼음처럼 차가운 용해 버퍼 100 µL를 채웁니다.세척 과정 동안 플레이트를 얼음 위에 보관하십시오. 하단 플레이트의 원심분리가 끝나면, 글루타치온 플레이트를 싱크대 위에서 뒤집어 용해 버퍼를 털어내고 종이 타월로 닦아냅니다. V자형 바닥 플레이트의 용해 버퍼를 플레이트를 기울인 상태에서 멀티 채널 피펫을 사용하여 글루타치온 플레이트로 옮기되, 바닥의 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오.그 다음 플레이트를 덮고 최소 2시간 동안 얼음 위에 둡니다. 2시간의 결합 단계가 끝나갈 무렵, 방사성 물질 작업에 필요한 안전 예방 조치가 갖추어졌는지 확인하며 방사성 작업대를 준비합니다. 하이브리드화 오븐을 30°C로 설정합니다.글루타치온 플레이트를 싱크대 위에서 뒤집어 용해 버퍼를 털어낸 후 페이퍼 타월로 닦아냅니다. PMSF가 포함되지 않은 용해 버퍼 100 µL로 웰을 세 번 헹굽니다. 웰이 마르지 않도록 주의하십시오.다음 단계를 진행할 준비가 될 때까지 세척액에 보관하십시오. 그다음, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 55 milliliters의 1X kinase buffer 또는 1X KB를 준비합니다. 표준 부피 카세트가 장착된 자동 액체 분주기를 사용하여 플레이트의 각 웰에 50 microliters의 1X KB를 첨가합니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 관심 기질과 myelin basic protein 또는 MVP를 포함하는 용액 A를 각각 준비합니다. 플레이트를 싱크대 위에서 뒤집어 1X KB 세척액을 종이 타월로 제거하고, 즉시 소량 카세트가 장착된 자동 액체 분주기를 사용하여 용액 A 30 µL를 첨가합니다. 플레이트를 얼음 위에 보관하십시오.다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 방사성 물질 작업 구역에서 웰당 20 µL의 용액 B를 준비합니다. 분출력으로 인한 혼합 효과를 주는 리피터 피펫을 사용하여 플레이트를 덮고, 30 °C 하이브리드화 오븐에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 플레이트를 다시 얼음 위로 옮깁니다.그다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 2x sodium dodecyl sulfate 또는 SDS 용해 버퍼 50 µL를 첨가합니다. 이 섹션의 모든 작업은 방사성 물질 지정 구역에서 수행해야 합니다. 하이브리다이제이션 오븐의 전원을 켜고 온도를 85 °C로 설정합니다.오븐이 설정 온도에 도달하면, 플레이트를 오븐으로 옮겨 10분 동안 인큐베이션하여 샘플을 변성시킵니다. 다음으로, 26웰 프리캐스트 겔에 각 반응액 15 µL를 로딩합니다.멀티 채널 파이펫을 사용하여 여러 웰을 동시에 채울 때는 모든 팁이 해당 웰과 일치하도록 주의해야 합니다. 샘플을 추가하기 전에 겔을 150 volts에서 전기영동합니다. 결합되지 않은 ATP가 포함되어 있으므로 청색 라인이 겔 바닥 밖으로 나가지 않도록 하십시오. 그런 다음 겔을 분해하고 결합되지 않은 ATP를 제거하십시오. 이를 제거하지 않으면 필름의 겔 노출 시 겔이 어둡게 나타날 수 있습니다.라벨이 부착된 용기에 겔을 넣고 kumasi stain으로 15분 동안 덮어둡니다. 그다음, kumasi stain을 제거합니다. 겔을 물로 짧게 헹군 후 detain solution을 첨가합니다.단백질이 명확하게 보일 때까지 겔을 방치합니다. 각 샘플에서 MVP 밴드와 기질 밴드가 관찰되어야 합니다. 겔을 건조하려면 커다란 필터 페이퍼 시트를 잘라 건조기 위에 놓으십시오.셀로판 시트를 증류수로 적셔 표면이 매끄럽고 주름이 없게 만든 후 종이 위에 놓습니다. 겔의 순서를 기록하며 셀로판 시트 위에 겔들을 올립니다. 두 번째 셀로판 시트를 적셔 겔들 위에 덮습니다.균일한 표면을 만들기 위해 모든 기포를 밀어내어 제거합니다. 덮개를 닫고 진공 장치를 켠 후 80 °C에서 3시간 동안 젤을 건조시킵니다. 젤이 건조되면, 신호를 증폭시키기 위해 스크린을 사용하여 이중 유제 자동 방사선 사진 필름에 노출시킵니다.카세트를 새런랩이나 비닐봉지로 감싼 후 테이프로 밀봉하여 성에가 생기지 않도록 하고, -80°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 다음 날, 냉동고에서 카세트를 꺼내 실온에서 해동하십시오. 표시된 제조업체의 지침에 따라 암실에서 필름 프로세서를 사용하여 필름을 현상하십시오.다음은 180종의 키나아제를 대상으로 한 스크리닝의 대표적인 결과입니다. kreb 조절 전사 공활성화 인자 2(CRTC2)의 268번부터 283번 아미노산에 해당하는 GST 태그 펩타이드 기질과 전형적인 키나아제 분석 기질인 myelin basic protein(MBP)를 사용하여 스크리닝을 진행하였습니다. 그 결과, Mark2와 이와 밀접하게 관련된 키나아제인 Mark3만이 CRTC2 펩타이드를 인산화시켰습니다. MBP는 인산화 가능한 잔기를 다수 포함하고 있으며 겔의 하단부인 18 kilodaltons에서 이동하므로, 모든 분석에서 내부 대조군으로 포함되었습니다.이를 통해 특이성에 대한 해석이 가능합니다. 일부 인산화효소는 기질과 MVP를 강력하게 인산화합니다. 여기서 주목할 점은 GST만 포함된 웰에서 항상 일부 내인성 인산화효소 활성이 정제된다는 것입니다.따라서 분석 시 항상 배경 인산화가 발생합니다. 이것이 기질의 인산화가 실제라는 사실을 부정하는 것은 아니지만, 인 비트로(in vitro) 환경에서는 키나아제의 선택성이 낮아질 수 있음을 시사합니다. 키나아제 기질 특이성에 관한 결론을 도출하기 위해서는 서로 다른 분자량을 가진 여러 기질을 포함하는 것이 특히 유용합니다.본 스크리닝은 in vitro에서 수행되었으며 in vivo에서는 추가적인 복잡성이 발생하므로, 후보 키나아제는 세포 내에서 검증되어야 합니다. 예를 들어, 후보 키나아제가 in vitro에서 기질을 인산화할 수 있는 능력이 있더라도, 해당 기질과 동일한 세포 유형이나 세포 내 구획의 동일한 하위 부위에 발현되지 않을 수 있습니다. 이는 일반적으로 RNAi 매개로 후보 유전자를 사일런싱하여 수행합니다.또한 특이성을 확인하기 위해 기질의 비인산화 가능 돌연변이체를 사용하여 2차 스크리닝을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

류신 리치 반복 키나제 2 큰 multidomain의 키나제이며, 돌연변이가있는 파킨슨병의 가​​장 흔한 유전적 원인이됩니다. 이 단백질 키나제의 활동 분석은이 단백질의 생물학과 장애를 이해하는 중요한 도구로 입증되었습니다. 본...

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

이 비디오에서는 자가 반응성 CD4+CD8+ 이중 양성 미성숙 흉선세포의 세포사멸을 조절하는 저분자 키나아제 억제제를 식별하는 방법을 설명합니다. 세포사멸은 항-CD3 및 항-CD28 코팅된 자성 비드로 이중 양성 흉선세포를 활성화하여 유도됩니다. 그 다음에는 저분자 억제제 처리 및 유세포 분석 분석을 통해 억제제가 apoptotic marker 발현을 조절하는지 여부를 검출합니다.

강한 TCR 신호에 대한 흉선세포 반응을 조절하는 키나아제 억제제 식별

거의 전체 (S)를 포함하는 단백질 마이크로 어레이를 사용하여 cerevisiae의 프로테옴은 병렬 단백질 - 단백질 상호 작용의 수천의 신속한 편견 심문 프로브된다. 이 방법은 단백질 - 소분자, 번역 후 수정 및 높은 처리량의 다른 분석을 위해 이용 될 수있다.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

펩타이드 어레이 스크리닝은 단백질-단백질 상호 작용 부위를 식별하기 위한 고처리량 분석법입니다. 이를 통해 표적 단백질의 여러 상호 작용을 매핑할 수 있으며 단백질을 표적으로 하는 억제제의 부위를 식별하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 어레이를 스크리닝하고 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

여기, 우리는 순진 primed pluripotent 전환의 키나제 조절기에 대한 목표로 작은 분자 화면을 수행하는 양적 및 확장 프로토콜을 제시한다.

높은 처리량 억제제 스크리닝에 의한 배아 줄기 세포의 다 능성을 조절하는 키나제를 확인하는 간단한 방법

펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

 종속 키 1 (Cdk1) 세포 주기의 g 2 단계에서 활성화 되 고 많은 세포 경로 조절. 여기, Cdk1, Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별이 중요 한 키의 셀룰러 목표 설정에 대 한 수와 함께 체 외에 니 분석 결과 대 한 프로토콜 선물이.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

이 프로토콜의 목적은 레이블, 풍부, 및 단백질 키 니 아 CK2 세포 lysate 또는 조직 homogenate 같은 복잡 한 생물학 견본에서의 기판 확인 하는 것 이다. 이 메서드는이 목적을 위해 CK2 생물학의 독특한 측면을 활용합니다.

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

우리는 강력한 생화확적인 접근을 사용하여 새로운 키나아제 단백질을 특징으로 했습니다: 다른 세포주 및 조직에 있는 전용적인 항체를 가진 서쪽 얼룩 분석, coimmunocipation 실험에 의하여 상호 작용, 서쪽에 의해 검출된 키나아제 활동 인광 특이적 항체를 사용하여 블롯[32 P] ATP 라벨링에 의해.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

키나아제 억제제의 스크리닝을 위한 자가 조립된 인간 단백질 마이크로어레이의 생성을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

배우세요 고처리량 검열을 사용하여 특정 기질을 인산화하는 키나제를 식별하는 방법을. GST 풀다운과 방사성 자기영상을 활용한 이 프로토콜은 세포 신호 전달 연구에 필수적인 키나제-기질 상호작용을 효율적으로 분석합니다.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

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