높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

이 절차의 전반적인 목표는 고처리량 스크리닝 방법을 사용하여 관심 기질을 인산화하는 키나아제를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 키나아제 FU를 글루타티온으로 발현하는 플라스미드로 세포를 전이효소 또는 GST로 transection하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 GST 키나아제 풀다운을 수행하는 것입니다.

다음으로, 샘플을 젤에 넣은 다음 실행하고 kumasi brilliant blue 염료로 염색합니다. 마지막 단계는 젤을 건조시켜 자동 방사선 촬영 필름에 노출시키는 것입니다. 궁극적으로 생성된 필름을 현상하고 해석함으로써 각 lane이 별개의 kinase assay를 나타내기 때문에 kinase 기질 쌍을 식별할 수 있습니다.

알려진 인산화 기질에 대한 키나아제를 식별하는 기존 방법에는 생물정보학적 접근법을 사용하여 기질에서 합의 부위를 검색하고, 생화학적 기법 및 시행착오 접근법을 사용하여 키나아제와 기질 사이의 복합체를 검출하고, 알려진 생물학적 기능을 기반으로 conte 합의 기질을 검색하는 것이 포함됩니다. 이러한 접근 방식은 시간이 많이 걸리고 항상 성공할 수 있는 것은 아닙니다. 우리의 접근 방식은 기능적 결과를 기반으로 kinase 기질 쌍을 신속하게 식별할 수 있습니다.

이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸을 때 in vitro 특이성이 충분하지 않을까 우려했습니다. 밝혀진 바와 같이, 기질 특이성은 우수하며 우리는 종종 패밀리 구성원 키나아제만이 스크린에서 주어진 기질을 인산화할 수 있음을 발견합니다. 이는 각 스크린에서 여러 기질을 사용하여 멀티플렉싱할 때 특히 분명하며, 제 실험실의 기술자인 Courtney가 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시약, 플레이트 및 세포를 준비하는 것으로 절차를 시작할 것임을 시연합니다.

kinase plasmids가 포함된 플레이트가 동결된 경우 실온에서 해동하고 1900배 G에서 3분 동안 원심분리하여 웰 바닥의 수분을 수집합니다. 8.6ml의 환원된 혈청 배지와 312.7μl의 지질 기반 형질주입 시약을 혼합하고 혼합물을 각 웰에 5분 동안 그대로 둡니다. 환원된 혈청 배지의 10 마이크로리터에서 키나아제 플라스미드를 함유하는 96 웰 플레이트.

소량 카세트가 장착된 자동 액체 디스펜서를 사용한 다음 소량 카세트가 장착된 자동 액체 디스펜서를 사용하여 웰당 10마이크로리터의 환원된 혈청 배지 형질주입 시약 혼합물을 추가하고 플레이트를 20-45분 동안 그대로 둡니다. 다음으로, resus는 웰당 100마이크로리터의 세포 현탁액에서 80밀리리터의 완전한 delcos modified 또는 DMEM과 동일한 80ml에서 밀리리터당 0.75 백만 개의 세포로 2개의 93 T 세포를 현탁시킵니다. 표준 용량 카세트가 장착된 자동 액체 분전기를 사용하여 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 24시간 동안 다시 넣기 전에 현미경으로 웰의 세포 분포가 균일한지 확인합니다.

GST 키나아제 풀다운 실험을 시작합니다. 2.7 마이크로 리터의 30 % 과산화물과 1.4 밀리리터의 인산염 완충 식염수 또는 PBS를 혼합 한 두 번째 튜브에서 0.2 몰 나트륨 바나 데이트와 540 마이크로 리터의 물을 혼합하여 바나 데이트 용액 당 4 밀리 몰을 만듭니다. 두 용액을 함께 넣고 혼합물을 15분 동안 그대로 두었다가 사용하십시오.

멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 2마이크로리터의 0.25몰 염화칼슘을 분주한 다음 2.5마이크로리터의 입증된 연대측정 용액을 분주합니다. 각 플레이트를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양한 다음 얼음 위에 놓고 플레이트를 얼음 위에 유지합니다. 얼음 저온 용해 완충액의 웰당 50마이크로리터에서 즉시 진공을 사용하여 각 웰에서 매체를 제거합니다.

표준 카세트가 장착된 자동 액체 디스펜서를 사용하여 접시를 얼음 위에 30분 동안 그대로 두어 머릿니가 되도록 합니다. 섭씨 4도에서 3분 동안 1900배 G로 플레이트를 회전시킨 후 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 세포를 긁어내고 모든 내용물을 적절하게 라벨링된 vbo로 옮깁니다. 96개의 웰 플레이트는 섭씨 4도에서 10분 동안 1900회 G로 플레이트를 회전시키며, 글루타티온 코팅된 플레이트를 웰당 100마이크로리터의 얼음 저온 용해 완충액으로 스핀 충전합니다.

헹구는 동안 접시를 얼음 위에 보관하십시오. 바닥 플레이트를 원심분리한 후 글루타치온 플레이트를 싱크대 위에 뒤집어 용해 완충액을 털어내고 종이 타월로 닦아냅니다. 플레이트를 기울이고 다중 채널 피펫을 사용하여 V 바닥 플레이트에서 글루타티온 플레이트로 용해 버퍼를 옮기되, 바닥의 펠릿을 방해하지 않도록 주의합니다.

그런 다음 접시를 덮고 최소 2시간 동안 얼음 위에 두십시오. 2시간의 바인딩 단계가 끝날 무렵에 바인딩하려면 방사능 작업에 필요한 안전 예방 조치가 마련되어 있는지 확인하는 방사능 워크스테이션을 준비합니다. 혼성화 오븐을 섭씨 30도로 설정합니다.

글루타치온 플레이트를 싱크대 위에 뒤집어 용해 완충액을 털어내고 종이 타월로 닦아냅니다. PMSF가 없는 100마이크로리터의 용해 완충액으로 웰을 세 번 헹굽니다. 우물을 건조하게 두지 마십시오.

계속 진행할 준비가 될 때까지 헹굼에 보관하십시오. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 55ml의 X 키나아제 완충액 1개 또는 1개의 x kb를 준비합니다. 표준 용량 카세트가 장착된 자동 액체 디스펜서를 사용하여 플레이트의 각 웰에 1 x kb의 50마이크로리터를 추가합니다.

그런 다음 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 관심 기질과 미엘린 염기성 단백질 또는 MVP를 포함하는 용액을 한 번에 하나씩 만들어 용액 A를 준비합니다. 종이 타월에 1개의 XKB 헹굼 계획을 제거하기 위하여 수채 위에 판을 반전시키고 즉시 해결책의 30 마이크로리터를 추가하십시오 A.Using 작은 양 카세트와 맞은 자동화된 액체 분배기를 사용하십시오. 접시를 얼음 위에 보관하십시오.

다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 웰당 20마이크로리터의 용액 B에서 방사능 작업 영역에서 용액 B를 준비합니다. 분출력으로 인한 혼합을 돕는 리피터 피펫을 사용하여 플레이트를 섭씨 30도 혼성화 오븐에서 30분 동안 덮고 배양합니다. 30분 후 플레이트를 다시 얼음으로 옮깁니다.

그런 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 50마이크로리터의 2 x sodium eccle sulfate 또는 SDS lysis buffer를 각 웰에 추가합니다. 이 섹션의 모든 작업은 무선 활동을 위해 지정된 지역에서 수행해야 합니다. 혼성화 오븐을 켜고 섭씨 85도로 설정합니다.

오븐이 온도에 도달하면 플레이트를 오븐으로 옮기고 10분 동안 배양하여 샘플을 변성시킵니다. 다음로드. 각 반응의 15마이크로리터가 있는 26웰 프리캐스트 겔.

멀티채널 피펫을 사용하여 한 번에 여러 웰을 주입할 경우 모든 팁이 해당 웰과 정렬되도록 주의해야 합니다. 샘플을 추가하기 전에 150볼트에서 젤을 실행합니다. 젤 바닥에서 파란색 선이 흘러내리지 않도록 하려면 여기에는 통합되지 않은 A TP가 포함되어 있습니다. 그런 다음 젤을 분해하고 필름의 젤 노출을 어둡게 할 것이므로 통합되지 않은 TP를 제거합니다.

라벨이 붙은 용기에 젤을 넣고 15분 동안 쿠마시 얼룩으로 덮습니다. 다음으로 쿠마시 얼룩을 제거합니다. 젤을 물로 간단히 헹구고 억류 용액을 추가합니다.

단백질이 명확하게 보일 때까지 겔을 억류합니다. MVP용 밴드와 기판용 밴드는 각 샘플에 대해 표시되어야 합니다. 젤을 말리려면 큰 여과지를 잘라 건조기에 올려 놓으십시오.

셀로판 시트가 매끄럽고 주름이 없어질 때까지 증류수에 적셔 종이 위에 놓습니다. 셀로판 시트 위에 젤을 놓고 젤의 순서를 기록해 둡니다. 두 번째 셀로판 시트를 적시고 젤 위에 놓습니다.

멋지고 균일한 표면을 위해 모든 거품을 굴립니다. 덮개를 닫고 진공 청소기를 켠 다음 섭씨 80도에서 3시간 동안 젤을 구동합니다. 젤이 건조되면 스크린을 사용하여 이중 에멀젼 자동 방사선 촬영 필름에 노출시켜 신호를 강화합니다.

카세트를 사란 랩이나 비닐 봉지로 감싸고 테이프로 밀봉하여 서리를 막은 후 카세트를 영하 80도에서 밤새 보관하십시오. 다음 날 냉동실에서 카세트를 꺼내 실온에서 해동하십시오. 표시된 제조업체의 지침에 따라 필름 프로세서를 사용하여 어두운 방에서 필름을 현상합니다.

다음은 180 키나아제를 사용하여 스크리닝한 180 키나아제를 사용하여 스크리닝한 것으로, 크렙 조절 전사 공동 활성제 2 또는 C RTC 2의 아미노산 268 내지 283에 해당하는 A GST 태그 펩티드 기질과 고전 키나아제 분석 기질 미엘린 염기성 단백질 또는 MBP 2를 사용하여 스크리닝했습니다. Kinase는 2를 표시하고 관련성이 높은 kinase는 3을 인산화합니다. CRTC 2 펩타이드 MBP는 많은 인산 관련 잔류물을 포함하고 겔 바닥을 향해 18킬로달톤으로 실행되기 때문에 모든 분석에서 내부 대조군으로 포함됩니다.

이를 통해 특이성을 해석할 수 있습니다. 일부 키나아제는 기질과 MVP를 강력하게 인산화합니다. 여기서 주목할 점은 GST를 단독으로 포함하는 웰이 항상 일부 내인성 키나아제 활성을 정제한다는 것입니다.

따라서 분석에는 항상 배경 인산화가 있습니다. 이것이 기질의 인산화가 실제라는 것을 배제하지는 않지만, 시험관 내 설정에서 키나아제가 덜 선택적일 수 있음을 시사합니다. kinase 기질 특이성에 관한 결론을 도출하기 위해 분자량이 다른 여러 기질을 포함하는 것은 특히 유익합니다.

스크리닝이 in vitro이고 추가적인 수준의 복잡성이 in vivo에서 발생하기 때문에 후보 kinase는 세포에서 검증되어야 합니다. 예를 들어, 후보 키나아제는 시험관내에서 기질을 인산화할 수 있는 능력을 가질 수 있으며, 이는 기질과 동일한 세포 유형 또는 격실의 동일한 서브 셀에서 발현되지 않을 수 있습니다. 이는 일반적으로 후보 물질의 RNAi 매개 침묵을 사용하여 수행됩니다.

또한 특이성을 확인하기 위해 기질의 non phosphoryl 관련 돌연변이를 사용하여 2차 스크리닝을 수행할 수도 있습니다.