식물 표피 지질 폴리 에스테르 단량체의 분리 및 성분 분석

관속식물은 식물 조직과 외부 환경 사이의 방수 장벽 역할을 하는 세포외층에 의존합니다. 이러한 친유성 세포는 관련 구조를 가지고 있지만 병원성 감염을 제한하고 식물 조직 안팎으로 가스, 물 및 용해 물질의 수동적 이동을 조절합니다. 한 가지 중요한 장벽은 식물 특유의 복잡한 구조인 식물 표피입니다.

큐틴(cutin)은 불용성 글리세롤 지질 폴리에스테르로, 큐티클의 구조 매트릭스를 구성하며 용매 추출 가능한 왁스와 관련이 있습니다. 여기에서 우리는 지질 폴리에스터의 구성을 분석하고 지질 식물 조직을 유지하는 신뢰할 수 있는 기술을 제시합니다. 이 프로토콜에서는 전체 조직 샘플을 수확하고, 균질화하고, 일련의 용매 추출에 의해 철저하게 팽창시켜 표피 및 에피 특정 왁스를 포함한 용매 용해성 지질을 제거합니다.

막 지질의 트리글리세롤. 그런 다음 샘플은 나트륨 메스 산화물 촉매 메틸 용해에 의해 구성 성분인 지질 단량체로 중합됩니다. 시뮬레이션 시약은 트랜스 메틸레이트 하이드록실기에 가스 크로마토그래피 분석에 적합한 해당 트리메틸 세포 유도체에 추가됩니다.

그런 다음 유도체 잔류물을 GC 바이알로 옮기고 분석을 위해 A-G-C-M-S에 로드하여 크로마토그램을 생성하고 바이오 폴리에스터의 단량체 조성을 특성화합니다. 추출된 샘플에 존재합니다. 여기에서 우리는 야생형과 성숙한 애기장대 ANA 식물의 두 돌연변이에서 전체 잎 샘플을 수확합니다.

추출 및 분석을 위해 클로로포름으로 미리 헹궈진 유리관을 청소하기 위해 0.5g의 조직을 추가합니다. 플라스크에 이소프로판올 100ml를 넣고 부틸화 하이드록시 톨루엔을 0.01% 농도 BHT에 첨가하면 용매 추출 중 이중 결합과 지방산을 산화로부터 보호하기 위해 첨가되는 항산화제입니다. 수조에서 용매를 약 85도로 예열합니다.

식물 조직 그램당 25ml의 가열된 이소프로판올을 추가하고 85도의 열 LOC에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 튜브를 실온으로 식히고 귀와 눈을 보호하십시오. 마지막으로, 균질기로 시료를 분쇄하여 스크류 캡이 있는 균일한 분산 밀봉 튜브를 만들고 800G에서 10분 동안 1-2개의 원심분리 시료에 대해 100RPM으로 흔듭니다.

펠릿에 압축된 고밀도 물질에서 유기상을 분리하려면 파스퇴르 또는 제안제를 사용하여 상등액을 제거하고 폐기합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 실온에서 동일한 부피의 이소프로판올을 첨가하고 밤새 샘플을 흔듭니다.

100 RPM에서 샘플을 원심분리하고 상층액을 버립니다. 나는 25 밀리리터의 클로로포름, 메탄올, 조직 퍼그램의 2 대 1 용액을 첨가하고 밤새 샘플을 원심 분리기로 흔들어 유기상을 버립니다. 그런 다음 1-2개의 클로로포름 메탄올 용액을 사용하여 이 과정을 반복합니다.

펠릿을 밤새 건조시키고 흄 후드에서 무수 황산칼슘이 포함된 진공 건조제로 튜브를 옮겨 최소 3일 동안 또는 일정한 질량에 도달할 때까지 샘플을 탈수합니다. 완전히 건조되면 샘플은 나트륨 메스탄화에 의해 제거될 준비가 됩니다. 유리 주사기를 사용하여 25마이크로리터의 메틸 HETO 데카노에이트와 25마이크로리터의 오메가 펜텍 및 락톤으로 시작하는 건조 조직이 들어 있는 튜브에 두 가지 내부 표준물질 용액을 추가합니다.

심층 중합을 시작하려면 샘플에 0.9ml의 메틸 아세테이트를 첨가한 다음 1.5ml의 메토타르 산화물 촉매와 3.6ml의 메탄올을 첨가합니다. 반응 시스템 내에서 주기적인 와류로 60도에서 2시간 동안 샘플을 배양하면 지질 폴리에스터가 친핵성 메로폰 산화물 음이온과 반응하여 불안정한 사면체 중간체를 형성하여 지방산, 메틸 에스테르 및 산화물 음이온으로 쉽게 해리됩니다. 이러한 a 산화물은 접합체 염기이며 촉매 활성 메스암페타민 IDE 음이온을 재생하는 메탄올과 반응하여 추가적인 심층 중합 반응을 유지합니다.

시스템에 물이 있으면 메스산화나트륨과 반응하여 수산화나트륨을 형성합니다. 폴리에스터를 돌이킬 수 없게 바람직하지 않은 유리 지방산으로 전환하는 강력한 염기. 가수분해를 방지하기 위해 fas 대신 메틸 아세테이트를 첨가하여 시스템 내의 수산화나트륨을 제거합니다.

튜브를 실온으로 식히십시오. 배양 후 각 튜브에 10ml의 메틸렌 디클로라이드를 추가하여 단량체를 추출합니다. 그런 다음 1.5ml의 빙산을 첨가하여 샘플을 산성화합니다.

튜브에 0.5몰 염화나트륨 용액을 채우고 철저히 소용돌이치며 몇 분 동안 원심분리합니다. 흄 후드 아래. 피펫으로 하부 유기상을 깨끗하고 미리 헹궈진 중간 크기의 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

식염수 와류와 원심 분리기로 10분 동안 샘플을 다시 세척합니다. 상부 수성상을 제거한 다음 용액 와류 샘플 원심 분리기에 남아있는 미량의 물을 제거하기 위해 건조제로 샘플에 무수 황산나트륨을 첨가하고 용매를 전사하여 미리 헹굼 된 소형 튜브를 청소하고 튜브를 질소 증발기에 삽입하여 용매를 증발시키고 단량체의 건조 잔류 물을 얻습니다. 유리 주사기를 사용하여 100 마이크로 리터의 퓨린과 100 마이크로 리터의 B-S-T-F-A를 첨가하여 수산기를 휘발성 트리메틸 세포 유도체로 변환합니다.

100도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 튜브를 식히고 질소 가스로 증발시키십시오. 500마이크로리터의 일대일 헵탄 톨루엔 용액을 적색 용해 잔류물에 첨가한 다음 간단히 원심분리합니다.

유도체 시료를 400마이크로리터 인서트가 포함된 GC 바이알로 옮깁니다. 바이알을 둘러싸고 샘플을 가스 크로마토그래프에 주입하여 분석을 위해 모세관 컬럼에 주입한 다음 4중 질량 분석기로 용출액을 검출합니다. GCMS 분석으로 획득한 원시 데이터는 처리되어 각 샘플에 대한 크로마토그램으로 표시됩니다.

서로 다른 크로마토그래피 피크에 해당하는 개별 단량체는 특정 질량 스펙트럼에 의해 식별됩니다. GC 머무름 시간에서 개별 단량체의 양은 내부 표준 정량화 방법을 사용하여 측정되며, 이를 통해 시료 간에 단량체의 존재 정도와 조성을 비교할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 야생형에 해당하는 토끼 농양 잎 조직과 뚜렷한 단량체 프로파일을 보여주는 P 4 50 모노 옥시게나제 효소를 암호화하는 유전자의 두 돌연변이 대립유전자에서 방출된 단량체의 대표적인 분석에서 얻은 오버레이 크로마토그램입니다.

우리의 결과는 3가지 주요 큐틴, 단량체, 야생형 및 돌연변이 애기장대 식물의 풍부함이라는 중요한 차이점을 보여줍니다. 이 프로토콜은 식물 지질 폴리에스테르의 조성을 구성 단량체의 분리, 식별 및 정량화에 의한 분석을 위한 강력한 방법입니다. 이 절차는 확장 가능하며 뿌리, 씨앗, 잎 및 기타 전체 조직을 포함한 다양한 식물 재료의 대량을 처리하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

이 기술은 고등 식물에서 큐틴과 수베린의 생합성 조절 및 분포를 조사하는 연구에 적용할 수 있습니다.