Name: 식물 표피 지질 폴리 에스테르 단량체의 분리 및 성분 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 배우세요 식물 표피 지질 폴리에스테르의 분해 및 단량체 분석 방법을 통해 커틴 생합성과 식물 생리학을 연구하세요. GC-MS를 활용한 이 기술은 다양한 식물 종과 돌연변이체 연구에 적용 가능합니다.

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이 작업은 S.J.에 대한 NSERC(Natural Sciences and Engineering Research)-USRA 보조금과 I.M.에 대한 NSERC-Discovery 보조금의 지원을 받았습니다. 기술 지원을 제공해 주신 Richard Bourgault, Meghan Rains, Amanda Fluke에게 감사드립니다. att1-1 및 att1-2 돌연변이의 씨앗은 중국 베이징에 있는 유전학 및 발달 생물학 연구소의 Jian-Min Zhou 박사가 친절하게 제공했습니다.

참고 :이 프로토콜은 보나 벤처 호텔 등의 알에서 적응했다. (2004), 몰리나 등. (2006), 리튬 등. (2013) 7,10,11. 1-5 단계는 그림 1에 요약되어있다. 1. 조직 탈지 참고 : 항상, 클로로포름 모든 유리와 모자를 씻어 사용하기 전에, 흄 후드에서 건조시키는. 주의 : 조직 균질화 및 흄 후드 아래에있는 모든 용매 전송 단계를 수행; 항상 화학 물질과 직접 접촉을 방지하고 오염으로부터 샘플을 보호하기 위해 실험실 코트, 장갑, 스플래시 안전 고글을 착용하십시오. <ol><li> 예열 물 목욕 및 85 ° C의 열 블록. </li><li> 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 캡 나사 벌였습니다 미리 칭량 20mm X 125mm 유리 시험관에 각 리프 시료 약 0.5 g을 단다. 샘플 당 네 개의 복제를 포함합니다. </li><li> 삼각 플라스크 (약 125 ml의 2- 프로판올을 배치; SAMP의 g 당 25 ㎖를르). 0.01 %의 최종 농도 (또는 부틸 히드 록시 톨루엔, BHT로 알려진) 2,6- 디 -tert- 부틸 -4- 메틸 페놀을 추가 (W / V). 주 : 메탄올 모액 (/ V W) 5 % 내지 BHT 추가 (BHT는 불포화 지방산의 산화를 최소화). </li><li> 물을 욕조에 85 ° C로 예열 2- 프로판올 솔루션입니다. </li><li> 열 블록에 85 ° C에서 15 분 동안 각각의 샘플 튜브 가열로 12 ml의 뜨거운 -2- 프로판올 용매를 추가한다. 이 단계는 파괴 세포에서 방출 될 수 리파제를 비활성화합니다. </li><li> 튜브를 실온으로 냉각하고 균질 한 현탁액을 수득 할 때까지 균질 조직을 완전히 분쇄하자. </li><li> 궤도 통에 샘플을 넣고 100 rpm으로 상온에서 1~2 시간 동안 흔들어. </li><li> 800 XG에서 10 분 동안 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. </li><li> 2- 프로판올의 동량을 첨가하고, 실온에서 12 시간 동안 흔들어. </li><li> 800 XG에서 10 분 동안 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. </li><li> 12 ㎖의 CH 추가CL 3 : CH 3 OH (2 : 1, V / V) (샘플의 g 당 25 ㎖)에 잔류 물 100 rpm으로 실온에서 밤새 흔들. </li><li> 800 XG에서 10 분 동안 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. </li><li> 12 ml의 클로로포름 추가 : CH 3 OH를 (1 : 2, v / v)의 잔류 물 100 rpm으로 실온에서 하룻밤 흔들. </li><li> 800 XG에 10 분 동안 원심 분리기 및 용매 제거합니다. </li><li> 샘플을 실온에서 밤새 흄 후드에서 건조 시키십시오. </li><li> 잔류 물을 공기 - 건조 후, 무수 CaCl2를 또는 일정한 중량 (3~5일)에 도달 할 때까지 4 CASO 위에 진공 데시 케이 터 내에서 배치했다. </li></ol> 2. 해중합 : 나트륨 메톡와 메탄올 (그림 2) 주의 : - 2.4, 2.7-2.8, 2.10 - 단계 2.3 수행 2.15과 2.17 - - 2.11, 2.13 흄 후드에서 2.18; 항상 실험실 코트, 장갑, 스플래시 안전 고글을 착용하십시오. <ol><li> 60 ℃로 예열 열 블록. </li><li> (추가 계산을 위해 중요) 건조 잔류 물을 포함하는 테스트 튜브의 무게. </li><li> 각각의 튜브 내부 기준을 추가 : 25 ωL 메틸 heptadecanoate (1 ㎎ / ㎖ 주) 25 μL의 ω-pentadecalactone (1 ㎎ / ㎖ 주식을). </li><li> 각 튜브에 0.9 ml의 메틸 아세테이트, 1.5 ml의 나트륨 메톡 시드, 및 3.6 mL의 메탄올을 첨가하고 그들을 모자. 다르게는, 이러한 세 가지 시약과의 반응 혼합물을 준비하고, 각 샘플을 6 mL의 분취 량을 추가한다. </li><li> 2 ℃에서 60 시간 동안 주기적으로 15 분 간격으로 선회 용 열 샘플. </li><li> 샘플을 실온까지 냉각 보자. </li><li> 지방산 메틸 에스테르를 추출 메틸렌 클로라이드 (CH 2 CL (2)) 및 빙초산 150 mL를 10 ㎖를 추가한다. </li><li> 각각의 튜브와 캡을 채우기 위해 생리 식염수 (0.5 M의 NaCl)를 추가합니다. </li><li> 800 X g에서 10 분 동안 1 분 원심 분리기에 대한 소용돌이 샘플. </li><li> 폴리 중형 크기의 튜브를 청소 (저급) 유기상을 트랜스퍼 (16 × 125mm의 유리 시험관테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)를 벌였습니다 스크류 캡). </li><li> 각각의 튜브와 캡을 채우기 위해 생리 식염수 (0.5 M의 NaCl)를 추가합니다. </li><li> 800 X g에서 10 분 동안 1 분 원심 분리기에 대한 소용돌이 샘플. </li><li> 수성 (위) 단계를 제거하고를 반복 2.11-2.12 단계를 반복합니다. </li><li> 모든 수성 (위) 단계를 제거합니다. </li><li> 1 분 동안 튜브, 소용돌이 캡 용매에 무수 황산나트륨 (NA 2 SO 4)을 추가; 샘플은 현재 다음 날 때까지 남아있을 수 있습니다.이 점 샘플 흄 후드에서 밤새 남아있을 수 있습니다에서. </li><li> 하단에있는 나 2 SO 4 소금을 압축하는 800 XG에서 2 분 동안 원심 분리기. </li><li> 작은 유리 일회용 튜브 (폴리 테트라 플루오로 에틸렌 13 X 100mm 유리 테스트 튜브 (PTFE)를 벌였습니다 스크류 캡)에 유기 상을 전송합니다. </li><li> 질소 하에서 건조에 용매를 증발 및 유도체 화 단계로 진행합니다. 즉시 처리되지 않는 경우, 저장소는 -20 ° C에서 샘플을 증발시켰다 (샘플 일 수있다LSO) 증착 단계 이전에 저장된다. </li></ol> 가스 크로마토 그래피 파생 상품 3. 준비 주의 : 단계 3.1.2과 3.1.5 수행 - 흄 후드에서 3.1.8을; 항상 실험실 코트, 장갑, 스플래시 안전 고글을 착용하십시오. <ol><li> 트리메틸 실릴 유도체 <ol><li> 100 ℃로 예열 열 블록. </li><li> 각각의 튜브에 피리딘 100 ㎕와 BSTFA (N, O 비스 - 트리메틸 실릴 - 트리 플루오)의 100 μl를 추가하고 캡. </li><li> 10 분 동안 100 ℃에서 가열 된 샘플. </li><li> 샘플을 실온까지 냉각 보자. </li><li> 실온에서 질소하에 샘플을 증발시켰다. 시료에 열을 가하지 마십시오, 단량체는이 단계에서 매우 휘발성이다. </li><li> 1 (v / v)의 헵탄 : 톨루엔 1의 500 μl를 추가합니다. </li><li> 800 X g에서 2 분 1 분 원심 분리기에 대한 소용돌이 샘플. </li><li> GC 바이알에 샘플을 추가하고 GC / MS 분석을 진행합니다. </li></ol></li><li> 아세틸파생 상품 주 : 아세틸 들어, 단계 수정 3.1.1-3.1.3 상기 (비디오에 도시되지 않음) 다음; 3.1.4-3.1.8이 동일한 단계 : <ol><li> 60 ℃로 예열 열 블록. </li><li> 피리딘 100 ㎕와 튜브에 아세트산 무수물 100 ㎕ (O 행 2)를 추가합니다. </li><li> 열 샘플 60 ° C에서 1 시간. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS 분석 <ol><li> HP-5 캐 필러 리 컬럼 (30 MX 0.25 mm X 0.25 μm의 필름 두께) 또는 이와 동등한 (예., 5 % 페닐, 95 % 디메틸 폴리실록산)를 사용합니다. 프로그램 3 ℃ / 분으로 300 ℃까지 150에서 프로그래밍 헬륨 캐리어 가스 1.5 ml / 분으로 설정 유량 및 오븐 온도 GC. </li><li> 40-600 AMU (전자 충격 이온화)를 통해 모드를 스캔 분할 주입 (분할 비율 1시 10분) 및 설정 질량 분석기를 사용합니다. </li><li> 용매 (빈), (WT) 및 돌연변이 복제, 각 사용하여 표시 각질 분석 방법을 포함한 일련의 테이블을 만듭니다. </li><li> 로드 용매그리고 회전 목마 샘플 유리 병은, 필요한 경우 자동 시료 주입기에 주사기 세척 유리 병에 헥산을 추가하고 순서를 시작합니다. 시퀀스가 완료된 후, 총 이온 크로마토 그램 트레이스 모든 샘플 가능하다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 게시 된 질량 스펙트럼에 대한 각 피크의 질량 스펙트럼을 비교하거나 가능한 경우 상용 라이브러리를 검색하여 지질 폴리 에스테르 단량체를 확인합니다. </li><li> 총 이온 전류 크로마토 그램의 각각의 피크에 대해 식별, GC / MS 소프트웨어 (기업도 1)에서 적분 결과 테이블 영역을 찾기 위해 각각의 체류 시간을 사용한다. </li><li> 각 단량체 (컬럼 AB)를 들면, 모노머의 엑셀 테이블 (보조 파일 2 열 CF)에서 샘플을 복제마다의 해당 칼럼에 통합 테이블 (기업도 1, 열 D)에 위치한 영역 값을 추가 스프레드 시트는 애기 장대를 정량화하기각질 TMSI 유도체. 아세틸 유도체 대신 준비하는 경우 보충 파일 3을 사용합니다. </li><li> IS 열 (홍콩)에 내부 표준 (IS)의 영역을 추가합니다. 단량체 테이블의 정량 (보라색 음영 셀에 대한있는 그대로 공 명성 (IS1); 보충을 : 그, 즉 지방산 메틸 에스테르를 유도하지 않는 단량체 (FAMES), 및 디카 르 복실 산 디메틸 에스테르 (DCA DMEs)의 경우, 17을 사용 파일 2/3). 차 알코올, 페룰 산 및 ω-하이드 록시 산을 포함하는 수산화 단량체, 15 사용 : 화합물 정량에 대한 선택의있는 그대로 0 ~ 15 하이드 록시 명성 (IS2) (단량체 테이블에 녹색 shadded 세포, 2/3 보충 파일) . </li><li> 각각의 건조 잎 무게 추가 열을 복제 AX-BA (보충 파일 2) 또는 AQ-AT (보조 파일 3); 대안 적으로, 단량체 단위 당 부하를 표현하는 표면 영역을 계산하고, 단량체 테이블 영역 값을 추가하기 위해 잎을 스캔표면적. </li></ol>

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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

이러한 DNA와 단백질 등의 생체 고분자와는 달리, 식물 지질 폴리 에스테르 템플릿에서 만든되지 않습니다. 대신, 자신의 조성물은 이러한 세포 외 중합체를 만드는 조직에 존재하는 효소의 특이성에 따라 달라집니다. 같은 화학 성분 분석으로 구성 요소는 지질 폴리 에스테르 성분을 이해하는 것이 중요하다. 에스테르 결합을 절단하는 화학적 방법은 비누화, 수소화 분해, 산 촉매 transmethylation,베이스 - 촉매 transmethylation (2)를 포함한다. 그들 각각의 장점과 단점이 있습니다. 비누화 보조 반응을받을 수있는 자유 지방산 하이드 록시 산을 생산하고 있습니다. 리튬 알루미늄 하이드 라이드와 수소화 (LiAlH 4)도 16은도 7의 cutin 분석에 사용되었다. 수소화는 알코올에 탄소수 작용을 감소시키고 구조가 원래의 알루미늄 리튬 중수소 (LiAlD 4)와 deuteriolysis 유추되어야한다. 그만큼이 방법의 단점은, 그 구조의 할당을 획득하기 위해 지방산 폴리올 deuteriation의 정도를 비교하는 사진 GC / MS의 요구 사항이다. 메탄올 불화 붕소 (BF 3)와 에스테르 교환 반응 산 촉매는 자주 각질 및 suberin depolymerizations 8,17,18에서 사용되었지만, 시약은 제한된 수명을 가지며, 반응 15 측면에 의한 인공물을 초래할 수있다. 메탄올 성 황산을 10도 다른 방법에 비하여, 단량체하지만 아마도 진정한 지질 폴리 에스테르 성분없는 2- 히드 록시 지방산의 더 큰 비율과 메틸 에스테르를 산출한다. 이 프로토콜에 설명에 NaOMe - 촉매 에스테르 교환법이 식별 특성 질량 스펙트럼을 제공 수산기의 실릴 화에 의해 유도되는 지방산 메틸 에스테르를 생성하거나 아세틸 fo를 수산기보다 안정한 유도체를 제공 할R 정량. 이 기술의 한 가지 단점은 물이 반응에 존재하는 경우, 가수 분해가 에스테르 교환 반응과 경쟁한다는 것이다. 물에 NaOMe (촉매)과 반응하여 차례로 유리 산 (도 2d)을 수득 지방산 메틸 에스테르를 가수 분해에 NaOH를 생성한다. 따라서 분석을 복잡 메틸 에스터 및 TMSI 에스테르 유도체 : 두 개의 피크는 각각 지방산 대 존재할 수 있기 때문에 바람직하지 않은 부반응이다. 무수 시약을 사용하여 비누화와 경쟁 보조 용매로서 메틸 아세테이트를 첨가 가수 분해 (도 2D)를 방지하는 것이 중요한 단계이다. 각질과 suberin 1 26 % 글리세롤 (4) 사이에 포함되어 있습니다. 그러나,이 단량체는이 프로토콜에서 설명한 실험 조건에 의해 검출되지 않을 것이다. 글리세롤은 지방산 메틸 에스테르 계 단량체와 달리, 수성 용매 세척 단계에서 제거 될 것이고, 고 친수성이고. 이러한 제한도다른 각질 해중합 방법하지만 글리세롤 pplies는 효소 방법을 사용하여 에스테르 교환 반응 후의 수층으로 결정될 수있다. 대안 적으로,이 온화한 조건을 이용하여 정량화 할 수있다 (예., 0.05 M에 NaOMe) 상기 물 추출없이 모든 단량체를 검출하는, 글리세롤 정량 목적 .Although 유용한 글리세롤 (19, 20)를 포함하여, 온화한 조건은 일반적으로 각질의 불완전한 탈 중합을주고 suberin. 불꽃 이온화 검출기 (FID)에 결합 GC 사용할 경우 대표적인 샘플의 피크는 GC / MS에 의해 식별 된 후, 모든 복제는 정량 목적이 기기에서 분석 될 수있다. 보존 지수가 공지되어있는 경우 또는, GC / FID 트레이스에 단량체가 식별 될 수있다. 불꽃 이온화 검출기가 크고 작은 샘플 성분의 정량 중요 특히 높은 감도와 비례의 넓은 범위를 갖는다단일 실행에. 또한, 강력하고 유지하며 15을 조작하기 쉽다. 설명 된 프로토콜은 하나 이상의 지질 에스테르 단량체 조성물 상이 돌연변이 화학적 특성을 허용 식물 지질 에스테르 단량체의 신뢰성 및 재현성 분리, 식별 및 정량화를 허용한다. 절차가 쉽게 뿌리, 종자, 잎, 줄기, 꽃 등 다양한 식물 재료의 작은 벌크 수량 모두를 처리하도록 구성 될 수있다, 확장 가능하다. 많은 종에서 지질 에스테르 단량체의 질량 스펙트럼 데이터는, 21-26. 예를 게시하고 다른 조직 및 / 또는 종이 프로토콜을 채택 할 때 알려지지 단량체를 식별하는 데 가치있는 자원을 구성하고있다. 이 방법은 고등 식물 지질의 생합성 에스테르, 규제, 및 분포 연구에 적용 할 수있다.

혈관 식물은 식물 조직과 외부 환경 사이의 방수 장벽으로서 기능 외 층에 의존한다. 이러한 친 유성 세포벽 - 관련 구조는 병원성 감염을 제한 및 식물 조직에서 1 가스, 물 및 용해 된 물질의 수동적 운송을 조절한다. 이러한 장벽은 표피 식물, 식물 (2) 및 다른 suberin 함유 확산 장벽 synapomorphic 독특한 구조이다. 표피는 세포벽 3-5의 외 측면에 pectinaceous 층을 통해 표피 세포에 의해 합성되고 바인드 친 유성 층이다. 이것은 식물 조직과 환경 사이의 인터페이스로서 기능하는 필수적인, 고등 식물의 주요 공중 장기를 둘러싼 다. 각질, 표피의 구조 매트릭스 및 suberin은 용매 추출 왁스 2,4과 관련이 불용성 glycerolipid 폴리 에스테르이다. 이러한 고분자 Lipids 포화 및 불포화 지방산 유도체로 이루어지는 두 구조적 및 기능적으로 유사하다된다. 그러나, 그들은 화학 조성 및 증착 사이트의 특성의 차이에 의해 구별된다. Suberin는 보조 벽을 형성하는 소정의 외부 및 내부 조직의 셀 벽 내부에있는 지방족 폴리 에스테르이다. Suberized 조직은 뿌리의 periderms, 덩이 줄기와 나무 껍질, 뿌리 endodermis, 씨앗 ​​코트 층, 치유 상처 (2)를 포함한다. 각질 달리 suberin 폴리 에스테르는 전형적으로 알콜, 포화 모노 - 불포화 된 디카 르 복실 산, 매우 장쇄 단량체의 큰 비율 (C≥20)을 포함한다. 각질 혈관 식물 6에서 가장 풍부한 지질 폴리 에스테르, 글리세린과 하이드 록시 및 하이드 록시 - 치환 된 에폭시 지방산 AS 4 C16-C18 interesterified 지방산 유도체, 구성된다. 각질 중합체 조성물 동안0, 18- 히드 록시 -9,10- 에폭시 18 : 0, 18 9,10,18 트리 히드 록시 : 0 지방산 tracheophyte 종에 걸쳐 변화가 가장 우세한 단량체는 주 16 16 히드 록시, (10)이다. 2 디카 르 복실 산 7,8 : 흥미롭게도, 애기 잎과 각질 줄기는 주로 (18)로 구성되어있다. 식물 표피는 수 마이크로 미터 (9)에 수 나노 미터에 이르기까지, 두께에 상당한 변화를 제시한다. 표피 분리는 특히 애기 장대 (8)의 것과 매우 얇은 잎 큐티클위한 수고와 시간이 많이 걸리는 공정이기 때문에, 표피 분리를 우회 방법 개발 7,8 검증되었다. 여기서, 우리는 나트륨 메톡 시드 (에 NaOMe) 해중합 촉매 반응 이후 가스 크로마토 그래피 / 질량 분석 (GC / MS)에 의해 분석 된 애기 장대 잎의 각질의 단량체 조성물을 연구하기 위해 상세한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 공동을 분석을위한 강력한 방법을 제공한다전체 delipidated 조직에서 식물 지질 폴리 에스테르의 mposition, 그리고 이전에보고 된 프로토콜 7,10,11에서 적응하고있다. 전체 조직 샘플은 균질화 제 철저 cuticular 및 epicuticular 왁스, 멤브레인 지질 및 트리 아실 글리세롤을 포함한 용매 추출 성 지질을 제거 delipidated. 세포벽 강화 잔기는 나트륨 메톡 시드 메탄올 촉매 작용에 의해 그 구성 메틸 에스테르 단량체로 해중합된다. 지방산 메틸 에스테르 산성화에 추출하고, 해당 트리메틸 실릴 또는 아세틸 유도체를 얻기 위해 유도된다. 유도체 화 잔기는 높은 휘발성이며, GC / MS 분석에서 구조적 형태를 변경하지 않고 적절한 온도에서 기체 크로마토 그래피 칼럼으로부터 용출 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>화학 물질</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPA451-4</td><td>탈지</td></tr>분용 용매 <tr><td>무수 황산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>무수아세트산</td><td>시그마 알드리치</td><td>320102</td><td>유도체화제</td></tr><tr><td>BSTFA (N,O-bis(트리메틸실릴)-트리플루오로아세트아미드)</td><td>시그마-알드리치</td><td>15222</td><td>유도체화제</td></tr><tr><td>부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT)</td><td>시그마-알드리치</td><td>101162</td><td>항산화</td></tr><tr><td>칼슘 클로라이드, 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td>건조제</td></tr><tr><td>칼슘 suflate, 무수 (DRIERITE-8 MESH with indicator)</td><td>Acros Organics</td><td>219090020</td><td>건조제</td></tr><tr><td>클로로포름 (트리클로로메탄)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C6074</td><td>유기 용제</td></tr>, <tr><td>빙초산</td><td>, Fisher Scientific</td>, <td>BP2401212</td><td>산성화제,</td></tr><tr><td>헬륨 운반 가스, 압축</td><td>공기 액체,</td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>운반 가스, GC/MS</td></tr>, <tr><td>헵탄</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>H3501</td><td>유기 용제</td></tr><tr><td>, 헥산,</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3024</td><td>유기 용제</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td>유기 용매, 트랜스메틸화 반응</td></tr>성 <tr><td>메틸 아세테이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>296996</td><td>유기 용매</td></tr><tr><td>메틸 헵타데칸노에이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>H4515</td><td>내부 표준물질(1mg/mL 재고)</td></tr><tr><td>메틸렌 디클로라이드(디클로로메탄)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D374</td><td>유기 용매</td></tr><tr><td>질소, 압축</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>캐리어 가스, GC-FID</td></tr><tr><td>펜타데칸놀락톤</td><td>Fluka</td><td>76530</td><td>내부 표준물질(1mg/ml 재고)</td></tr><tr><td>피리딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>270970</td><td>유도체화를 위한 보조 용매</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358212</td>염<td>수 용액</td></tr><tr><td>메톡시드나트륨(25wt.%)</td><td>시그마-알드리치</td><td>156256</td><td>Nucleophile</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>FIsher Scientific</td><td>T2904</td><td>유기 용매</td></tr><tr><td>식물 성장 용품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>Premier Tech Horticulture Ltd</td><td></td><td>Pro-Mix PGX는 애기장대 식물을 재배하는 데 권장됩니다(Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) 애기장대 성장을 위한 Purdue 방법&nbsp;</td></tr><tr><td>PermaNest 습도 돔&nbsp;</td><td>Grower's Solution, LLC, 테네시주 쿡빌&nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Nest 식물 트레이 (22x11인치)</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>사각형 온실 화분, 3.5인치&nbsp;</td><td>Grower's Solution, LLC, 테네시주 쿡빌&nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>범용 식물 비료, Plant-Prod 20-20-20</td><td>Premier Tech Home and Garden In., Brantford,</td><td>ON N/A</td><td></td></tr><tr><td>유리 제품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 x 100mm 유리 시험관(테플론 표면 나사 캡 포함</td>) <td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>테프론 표면 나사 캡이 있는 16 x 125mm 유리 시험관</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>테플론 표면 나사 캡이 있는 20 x 125mm 유리 시험관</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>GC 바이알 캡</td><td>National Scientific</td><td>C400051A</td><td></td></tr><tr><td>GC 바이알 마이크로인서트</td><td>National Scientific</td><td>C4011631</td><td></td></tr><tr><td>GC 바이알 National</td><td>Scientific</td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>일회용 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분석 균형</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>벨리 댄서</td><td></td><td></td><td>Belly Dancer를 사용할 수 없는 경우 이러한 목적으로 Shaker를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>DB-5 Capillary GC column</td><td>J& W Scientific, 캘리포니아, 미국; &nbsp;</td><td></td><td>30 m x 0.25 mm x 0.25 & m 필름 두께</td></tr><tr><td>데시케이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 202 수조</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT 단일 사중극자 질량 분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>열 블록</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>질소 증발기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron 균질화</td><td>Birkmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 1300 기체 크로마토그래프</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2단계 조절기</td><td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>진공 데시케이터</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex 믹서</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

식물 표피 지질 폴리 에스테르 단량체의 분리 및 성분 분석

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

육상 식물은 특정 조직의 세포벽을 변형시키는 세포 외 지방족 바이오 폴리에스터를 생산합니다. 표피 세포는 글리세롤과 변형 지방산의 폴리에스터인 큐틴(cutin)을 합성하며, 이는 공중 식물 표면을 덮고 있는 큐티클의 골격을 구성합니다. Suberin은 뿌리 내배엽과 괴경의 둘레, 나무 껍질 및 뿌리를 포함한 특정 조직의 세포벽에 침착되는 관련 지질 폴리에스터입니다. 이러한 지질 중합체는 식물 종에 따라 조성이 매우 다양하며 종종 단일 종 내의 조직에 따라 다릅니다. 여기에서는 메톡시드나트륨(NaOMe) 촉매 해중합, 유도체화 및 후속 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC/MS) 분석을 통해 애기장대(Arabidopsis thaliana) 잎에서 큐틴의 단량체 조성을 연구하기 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 큐틴 또는 수베린을 함유한 전체 탈지화된 식물 조직에서 분리된 불용성 폴리에스터의 단량체를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 이전에 분석되지 않은 종의 지질 중합체 조성을 특성화하는 데 적용할 수 있을 뿐만 아니라 후보 유전자 기능을 평가하기 위한 정방향 및 역방향 유전적 접근 방식의 분석 도구로도 적용할 수 있습니다.

.이 논문에서 설명하는 프로토콜은 그림 1 비 각질 지질 (10)의 기여를 최소화, (., 각질 또는 suberin 예) 지질 폴리 에스테르 단량체를 결정하기 위해 설정 모두 8 사이의 소요 분석의 개요를 제시한다 - 10 일 (GC 데이터를 획득 초기 조직 수확에서), 건조 허용되는 시간을 샘플에 따라. 선택된 염기 - 촉매 메탄올 (그림 2) 폴리 에스테르를 해중합하는 방법은 이전에 각질과 suberin 모두 포함 애기 씨에 대해 검증 하였다. 조직이 먼저 균질화하고 철저하게 용매 추출 지질을 제거하는 delipidated된다. 추출 후 잔류 물 수익률은 초기 신선한 무게의 비율로, A의 보통 6 %입니다 장대 골-0 잎. 세포벽 강화 잔기 진공 건조기에서 건조시킨 후, 그 구성에 의해 메틸 에스테르 단량체로 해중합 아르염기 - 촉매 transmethylation. 두 시간 인큐베이션 해중합 적절한 지질 및 폴리 에스테르 성분의 회복에 필요한 중요한 시간으로 선택되었다. 긴 배양 시간은 2- 히드 록시 산의 증가 하였다; 이러한 잠재적으로 막 스핑 고리 피드 (10)에서 파생. O -TMSi 에테르 유도체 (도 3A) 및 O의 아세틸 유도체 (도 3B)에 대한 야생형 애기 장대 잎의 cutin는도 3에 도시되어있는 경우의 전형적인 크로마토 그램. 각각의 피크는 문헌 7,8 및 12 당사 비디오 프로토콜 TMSI 유도체를 제조하는 방법을 보여준다 공용 데이터베이스로부터 질량 스펙트럼 비교에 의해 식별 되었으나, 샘플은 다르게는 수산기를 유도체 화하는 아세틸 화 될 수있다. 그들이 진단 질량 스펙트럼을 제공하기 때문에 실릴 유도체 식별을 위해 좋다. 그러나, 아세틸 유도체보다 안정적이고 좋은 대안이 실릴하기한 번 단량체 (10) 확인되었다. 단지 GC 불꽃 이온화 검출기 (FID)에 접속 한 실험실에서 이러한 프로토콜을 구현하기 위해, GC / FID는 WT 리프 각질 단량체 및 지방산 메틸 에스테르를 기준 동족체 계열에 아세틸 화 유도체에 대응하는도 나타낸다 트레이스 (기업도 4). 이 방법은 정성과 샘플 사이의 양적 차이, 돌연변이 분석에 따라서 그 값을 검색합니다. 개별 단량체의 양은 샘플 사이의 단량체 풍부 비교를 가능하게 정량의 내부 표준 방법을 사용하여 결정된다. 이 피크의 크기 (총 이온 카운트) 폴리 에스테르 단량체의 몰비를 반영하지 않을 수 있음이 명확해야한다. 우리는 지방산 메틸 에스테르 유도체 및 TMSI (보조 파일 1) 또는 ACE로 애기 장대 잎의 cutin 모노머 량을 계산하는 단량체의 편집되는 테이블을 포함<html> 알코올의 TYL 유도체 (보충 파일 2). 이 테이블은 샘플이 다른 기관 또는 식물 종에서 추출하는 경우 적용 할 필요가있다. 예를 들어, 우리가 분석 한 애기 장대 탈리아 NA 컬럼비아 (골-0) 야생형 잎과 CYP86A2 / ATT1 유전자, att1-1 (M-1)과 att1-2의 두 이전에 특성화 된 널 돌연변이 대립 유전자 (M-2 ) (13, 14). CYP86A 아과의 시토크롬 P450 모노 옥 시게나 제는 추정 ω-oxydases를 인코딩 및 suberin과 각질 단량체 생합성에 참여한다. 우리의 결과 (그림 4) (WT) 잎에 비해 돌연변이 잎에 세 가지 주요 지질 단량체의 부하에 상당한 감소를 보여줍니다. 0, 18 : 2, 18 : 효소의 예측 기능, 16 일치 1 디카 르 복실은 특히 att1 돌연변이에 영향을 받았다. &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 지질 폴리 에스테르 분석 1. 개요. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> 도에 NaOMe - 촉매 transmethylation 반응 2. 메커니즘. 핵성 메톡 음이온 용이 지방산 메틸 에스테르 및 알콕시 드 음이온 (B)로 해리 불안정한 사면체 중간체 (A)를 형성하는 지질 폴리 에스테르 cabonyl 탄소를 공격한다. 이 알콕사이드는 공액 염기이며, 이에 추가 해중합 반응 (C)를 ​​유지하는, 촉매 활성 메톡 음이온 재생 메탄올로 반응한다. 물이 존재하면시스템은, 그것은 수산화 나트륨, 비가 역적으로 바람직하지 않은 유리 지방산을 생성하는 에스테르를 가수 분해 강염기를 형성하기 위해 나트륨 메톡 시드와 반응한다. 메틸 아세테이트. 시스템 (D) 내에서 수산화 나트륨의 적은 양을 제거하기 위해 공동 용매 (15)으로 추가됩니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> 그림 3. 야생형 애기 장대의 잎 각질 모노머의 대표적인 총 이온 크로마토 그램. (A) O -trimethylsilyl (TMSI) 에테르와 (B) 아세테이트 하이드 록시 유도체 등을들 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </&gt; <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> 도 애기 장대 WT 4. 각질 단량체 조성물과 CYP86A2 유전자의 두 널 돌연변이 대립 유전자. (돌연변이-1 = att1-1; 돌연변이 -2- = att1-2) 오차 막대는 (N = 4)의 평균의 표준 편차를 나타내는 . © 블랙웰 출판 (2007)의 허가, 13에서 적응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> GC / MS 소프트웨어에서 보충 그림 1. 피크 통합 결과 테이블. 확인 단량체 및 내부 기준에 해당하는 봉우리는 retenti에 의해 식별된다<html> 시간 (열 C) 및 면적 값이 열에 표로에 디는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> 애기 장대 각질 단량체 (하이드 록시 지방산 메틸 에스테르의 트리메틸 실릴 에테르 유도체)의 보충 파일 2. 표. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> 애기 각질 단량체 (하이드 록시 지방산 메틸 에스테르의 O의 아세틸 유도체)의 기업 파일 3. 표.COM / 파일 / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivati​​ves.xlsx &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> 기업도 4 GC / FID의 트레이스 (AB) 지방산 메틸 에스테르 (FAME) 보유 지수는 표준 (피크는 각각 포화 FAME 사슬 길이로 표지된다); 및 (C)는 (A)를 아세틸 장대 중량 잎 각질 단량체. 16 : 0 FAME (1), ferulate (2), 18 : 3 FAME (3), 18 : 1/18 : 2 FAMES (4), 18 (5), sinapate 0 FAME (6 피크 숫자에 해당합니다 ), 16 : 0 DCA (7), 16-OH 16 : 0 FAME (8), 18 : 2 DCA (9), 18 : 1 DCA (10) 18 : 0 DCA (11), 18-OH 18 : 2 명성 (12), 18-OH 18 : 1 FAME (13), 20 : 0 FAME (14), 10,16 - 디 하이드 록시 16 : 0 FAME (15), 24 : 0 FAME (16). DCA : 다이 카복실산 다이 메틸 에스터; FAME : 지방산 메틸 에스터; IS1 : 내부 표준 1, 17 : 0 명성; IS2 : 내부 세인트andard 2, 15-OH 15 : 0 FAME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

지질 폴리에스터는 두 개의 세포벽 변형, 즉 식물 큐티클과 수베린 함유 확산 장벽의 구조적 구성 요소를 구성합니다. 이 비디오에서는 탈지된 잎 전체에서 큐틴을 탈중합하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 큐틴 또는 수베린 생합성에서 손상된 돌연변이를 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

관관속 식물은 식물 조직과 외부 환경 사이에서 방수 장벽 역할을 하는 세포 외 층에 의존합니다. 이러한 친유성 세포 및 관련 구조물은 병원균의 감염을 제한하고, 식물 조직 내부와 외부로 출입하는 가스, 물, 용해 물질의 수동 수송을 조절합니다. 중요한 장벽 중 하나는 식물 특유의 복잡한 구조인 식물 큐티클입니다.큐틴(Cutin)은 큐티클의 구조적 매트릭스를 구성하는 불용성 글리세롤 지질 폴리에스터이며, 용매로 추출 가능한 왁스와 결합되어 있습니다. 본 연구에서는 지질 폴리에스터의 조성을 분석하고 지질이 제거된 식물 조직을 얻기 위한 신뢰할 수 있는 기술을 제시합니다. 이 프로토콜에서는 조직 전체 샘플을 수확하고 균질화한 후, 일련의 용매 추출 과정을 통해 큐티클 및 표피 왁스를 포함한 용매 가용성 지질을 완전히 제거하여 탈지시킵니다.막 지질 내의 트리글리세롤. 이후 샘플은 소듐 메톡사이드 촉매 메틸 분해를 통해 구성 지질 단량체로 탈중합됩니다. 시뮬레이션 시약을 첨가하여 하이드록시기를 가스 크로마토그래피 분석에 적합한 해당 트리메틸셀 유도체로 전이 메틸화합니다.그런 다음 유도체화된 잔여물을 GC 바이알로 옮겨 A-G-C-M-S에 로드하여 분석함으로써 크로마토그램을 생성하고, 바이오 폴리에스테르의 단량체 조성을 분석합니다. 이는 추출된 시료에 존재합니다. 여기에서는 성숙한 arabidopsis ANA 식물의 야생형 및 두 가지 변이체로부터 전체 잎 시료를 수확합니다.추출 및 분석을 위해, 클로로포름으로 미리 헹군 깨끗한 유리 튜브에 조직 0.5 g을 넣습니다. 플라스크에 이소프로판올 100 mL를 넣고 부틸화 하이드록시톨루엔(butylated hydroxy toluene)을 0.01% 농도로 첨가합니다. BHT는 용매 추출 과정 동안 이중 결합과 지방산이 산화되는 것을 방지하기 위해 첨가하는 항산화제입니다. 항온수조에서 용매를 약 85 °C로 예열합니다.식물 조직 1g당 가열된 isopropanol 25 milliliters를 첨가하고, 샘플을 85 degrees의 가열 LOC에서 15분 동안 배양합니다. 귀와 눈 보호구를 착용한 상태에서 튜브가 상온으로 식을 때까지 기다립니다. 마지막으로, 균질기로 샘플을 분쇄하여 균일하게 분산시킨 후 스크류 캡으로 튜브를 밀봉하고 100 RPM으로 1~2분간 흔들어 줍니다. 샘플을 800 G에서 10분 동안 원심 분리합니다.펠렛으로 압착된 고밀도 물질로부터 유기상을 분리하려면, 파스퇴르 피펫이나 프로펜트를 사용하여 상층액을 제거하고 버립니다. 이때 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 실온의 이소프로판올을 동일한 부피로 첨가하고 샘플을 하룻밤 동안 흔들어 섞습니다.100 RPM에서 샘플을 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 조직 g당 클로로포름과 메탄올이 2:1 비율로 혼합된 용액 25 milliliters를 첨가하고, 샘플을 하룻밤 동안 흔들어 섞은 후 원심 분리하여 유기상을 제거합니다. 그 다음, 클로로포름과 메탄올이 1:2 비율로 혼합된 용액을 사용하여 이 과정을 반복합니다.펠릿을 하룻밤 동안 건조하고, 흄 후드에서 무수 황산칼슘이 들어 있는 진공 데시케이터로 튜브를 옮겨 최소 3일 동안 또는 항량에 도달할 때까지 시료를 탈수합니다. 충분히 건조되면 소듐 메톡사이드 촉매 메탈리시스(metalysis)를 통한 탈지(defloration) 준비가 완료됩니다. 유리 시린지를 사용하여 건조된 조직이 들어 있는 튜브에 내부 표준물질 용액 두 가지를 첨가하는데, methyl HETO decanoate 25 microliters와 omega pentec and lactone 25 microliters 순으로 넣습니다.심층 중합을 시작하려면, 샘플에 methyl acetate 0.9 milliliters를 추가한 후, sodium meth oxide 촉매 1.5 milliliters와 methanol 3.6 milliliters를 차례로 추가합니다. 샘플을 60 degrees에서 2시간 동안 배양하며 반응 시스템 내에서 주기적으로 vortexing합니다. 지질 폴리에스터는 친핵성 meth oxide 음이온과 반응하여 불안정한 사면체 중간체를 형성하며, 이는 지방산 methyl ester와 oxide 음이온으로 쉽게 분해됩니다. 이 oxide들은 짝염기이며 methanol과 반응하여 촉매 활성 meth IDE 음이온을 재생함으로써 추가적인 심층 중합 반응을 지속시킵니다.시스템 내에 물이 존재할 경우, 이는 메톡시드 나트륨과 반응하여 수산화 나트륨을 형성합니다. 수산화 나트륨은 폴리에스테르를 원치 않는 유리 지방산으로 가역 불가능하게 전환시키는 강염기입니다. 따라서 가수분해를 방지하기 위해, 시스템 내의 모든 수산화 나트륨을 제거할 수 있도록 메틸 아세테이트를 첨가합니다.튜브를 실온까지 식힙니다. 배양 후, 각 튜브에 10 milliliters의 methylene dichloride를 첨가하여 단량체를 추출합니다. 그다음, 시료를 산성화하기 위해 1.5 milliliters의 glacial acidic acid를 첨가합니다.튜브에 0.5 molar 염화나트륨 용액을 채우고, 충분히 볼텍싱한 후 수 분 동안 원심분리합니다. 흄 후드 내에서 수행하십시오. 피펫을 사용하여 하층의 유기상을 깨끗하게 미리 세척된 중간 크기의 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.샘플을 식염수로 다시 세척하고 볼텍싱한 후 10분 동안 원심분리합니다. 상층의 수성층을 제거한 다음, 용액에 남아 있는 미량의 수분을 제거하기 위해 건조제인 무수 황산나트륨을 샘플에 첨가하여 볼텍싱하고 원심분리합니다. 용매를 깨끗하게 사전 세척된 소형 튜브로 옮긴 후, 질소 농축기에 튜브를 넣고 용매를 증발시켜 단량체의 건조 잔류물을 얻습니다. 유리 주사기를 사용하여 퓨린 100 µL와 B-S-T-F-A 100 µL를 첨가하여 하이드록실기를 휘발성 트리메틸실릴 유도체로 전환합니다.샘플을 100 °C에서 10분 동안 배양합니다. 튜브를 냉각시킨 후 질소 가스 하에서 증발시킵니다. 1:1 HEPTANE 톨루엔 용액 500 µL를 첨가하여 잔류물을 다시 용해시킨 다음, 짧게 원심 분리합니다.유도체화된 시료를 400 µL 인서트가 포함된 GC 바이알로 옮깁니다. 바이알을 밀폐하여 가스크로마토그래프에 로딩하면, 시료가 분석을 위해 모세관 컬럼으로 주입되고 용리액은 사중극자 질량분석기로 검출됩니다. GCMS 분석을 통해 얻은 원시 데이터는 처리되어 각 시료의 크로마토그램으로 제시됩니다.서로 다른 크로마토그래피 피크에 해당하는 개별 단량체들은 각각의 특이적 질량 분석 스펙트럼을 통해 식별됩니다. GC 머무름 시간을 통해 내부 표준 정량법으로 개별 단량체의 양을 결정함으로써, 시료 간의 단량체 풍부도와 조성을 비교할 수 있습니다. 여기 제시된 것은 야생형 및 P450 모노옥시게나제 효소를 인코딩하는 유전자의 두 가지 돌연변이 대립유전자에 해당하는 토끼 농양 잎 조직에서 방출된 단량체의 대표적 분석 결과로, 서로 다른 단량체 프로파일을 보여주는 중첩 크로마토그램입니다.본 연구 결과는 야생형 및 돌연변이 애기장대 식물에서 세 가지 주요 큐틴 모노머의 함량에 유의미한 차이가 있음을 보여줍니다. 이 프로토콜은 구성 모노머의 분리, 식별 및 정량을 통해 식물 지질 폴리에스테르의 조성을 분석하는 강력한 방법입니다. 이 절차는 확장 가능하며 뿌리, 종자, 잎 및 기타 전체 조직을 포함한 다양한 식물 재료의 대량 샘플을 처리하도록 쉽게 조정될 수 있습니다.이 기술은 고등 식물의 큐틴 및 수베린의 생합성 조절과 분포를 조사하는 연구에 적용 가능합니다.

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생물학

식물 표피 물 절약의 기본 역할을뿐만 아니라, 병원성 미생물의 항목에 대한 중요한 장애가 식물에 밀랍 외부 덮개입니다. 이 비디오에서는, 우리는 순방향 및 역방향 유전학 방법으로 식별 식물 표피의 돌연변이의 분석을 보여줍니다.

식물 표피의 생합성을 탐구 Arabidopsis eceriferum 돌연변이의 이용

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 내용과 polyphenolic의 리그닌의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 콘텐츠와 벽 파생 탄수화물의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

극지 지질 추출물의 조성과 개별 glycerolipids의 지방산 조성은 간단하고 강력한 지질 프로파일 실험에서 결정됩니다. 이를 위해 glycerolipids는 얇은 층 크로마 토그래피에 의해 격리되고 그들의 아실 그룹의 transmethylation를 받게. 지방산 아실 methylesters는 기체 - 액체 크로마 토그래피에 의해 계량입니다.

씬 크로마 토그래피 (TLC)에 의해 Arabidopsis thaliana 폴라 Glycerolipid의 프로파일은 기체 - 액체 크로마 토그래피 (GLC)와 결합

공중 식물 장기는 표피, supramolecular biopolyester - 왁스 어셈블리의 보호를받습니다. 우리는 고체 NMR 및 원자 힘 현미경에 의한 분자와 마이크로 저울에 토마토 과일 손톱에서의 선택적 제거 에피와 intracuticular 왁스, 각각을 모니터링하고, 공학 cuticular biopolyesters의 가교 능력을 평가하기 위해 프로토콜을 소개합니다.

분리 및 과일 손톱의 Biophysical 연구

그람 음성 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 지질 도메인의 분리 및 특성은 세포 표면 항생제 내성의 기반 메커니즘, 세균의 생존과 건강, 어떻게 화학적으로 다양한 지질 분자 종은 차등 호스트 타고난 면역 반응을 조절에 대한 통찰력을 제공합니다.

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

세균성 세포벽은 펩티드에 의해 교차된 당가닥의 거대 분자 네트워크인 펩티도글리칸으로 구성됩니다. 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피는 펩티도글리칸 조성물의 새로운 발견을 위한 고해상도 및 처리량을 제공합니다. 우리는 세포벽 (sacculi)의 격리와 UPLC를 통해 분석을위한 후속 준비를위한 절차를 제시합니다.

초성능 액체 크로마토그래피에 의한 조성 분석을 위한 세균세포벽의 격리 및 준비

여기, 우리는 여러 바이오 매스 소스 로부터 리그 닌의 에탄올 추출 수행 하는 프로토콜을 제시. 리그 닌 수율 및 β-O-4 콘텐츠 추출 조건의 효과 표시 됩니다. 선택적인 depolymerization 높은 방향족 모노 머 제품을 얻은 lignins에 수행 됩니다.

온화한 에탄올 추출 및 Depolymerization 수율에 미치는 영향에 의해 높은 β-O-4 콘텐츠 리그 닌의 추출

파충류, 피부 지질 conspecifics에서 성적 신호 침입 종 관리에서 잠재적인 사용에 대 한 중요 한 있습니다. 우리가 헛간 피부 또는 전체 동물에서 피부 지질을 추출 하기 위한 프로토콜을 설명 하는 여기, 결정 및 총 지질 질량 분석 및 분류를 통해 칼럼 크로마토그래피를 사용 하 여 지질을 분리.

화학, 정량화, 고립과 파충류의 피부 지질 분리

다양한 광합성 유기체와 관련된 플라스토글로불 지질 방울의 분리를 위한 빠르고 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 분리된 플라스토글로불의 성공적인 준비는 단백질체학 및 지질체 분석과 같은 상세한 분자 조사에 앞서 중요한 첫 번째 단계입니다.

Plastoglobule 지질 액적 분리 식물 잎 조직 및 시아노박테리아

배우세요 식물 표피 지질 폴리에스테르의 분해 및 단량체 분석 방법을 통해 커틴 생합성과 식물 생리학을 연구하세요. GC-MS를 활용한 이 기술은 다양한 식물 종과 돌연변이체 연구에 적용 가능합니다.

식물 표피 지질 폴리 에스테르 단량체의 분리 및 성분 분석

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