식물 표피 지질 폴리 에스테르 단량체의 분리 및 성분 분석

관관속 식물은 식물 조직과 외부 환경 사이에서 방수 장벽 역할을 하는 세포 외 층에 의존합니다. 이러한 친유성 세포 및 관련 구조물은 병원균의 감염을 제한하고, 식물 조직 내부와 외부로 출입하는 가스, 물, 용해 물질의 수동 수송을 조절합니다. 중요한 장벽 중 하나는 식물 특유의 복잡한 구조인 식물 큐티클입니다.

큐틴(Cutin)은 큐티클의 구조적 매트릭스를 구성하는 불용성 글리세롤 지질 폴리에스터이며, 용매로 추출 가능한 왁스와 결합되어 있습니다. 본 연구에서는 지질 폴리에스터의 조성을 분석하고 지질이 제거된 식물 조직을 얻기 위한 신뢰할 수 있는 기술을 제시합니다. 이 프로토콜에서는 조직 전체 샘플을 수확하고 균질화한 후, 일련의 용매 추출 과정을 통해 큐티클 및 표피 왁스를 포함한 용매 가용성 지질을 완전히 제거하여 탈지시킵니다.

막 지질 내의 트리글리세롤. 이후 샘플은 소듐 메톡사이드 촉매 메틸 분해를 통해 구성 지질 단량체로 탈중합됩니다. 시뮬레이션 시약을 첨가하여 하이드록시기를 가스 크로마토그래피 분석에 적합한 해당 트리메틸셀 유도체로 전이 메틸화합니다.

그런 다음 유도체화된 잔여물을 GC 바이알로 옮겨 A-G-C-M-S에 로드하여 분석함으로써 크로마토그램을 생성하고, 바이오 폴리에스테르의 단량체 조성을 분석합니다. 이는 추출된 시료에 존재합니다. 여기에서는 성숙한 arabidopsis ANA 식물의 야생형 및 두 가지 변이체로부터 전체 잎 시료를 수확합니다.

추출 및 분석을 위해, 클로로포름으로 미리 헹군 깨끗한 유리 튜브에 조직 0.5 g을 넣습니다. 플라스크에 이소프로판올 100 mL를 넣고 부틸화 하이드록시톨루엔(butylated hydroxy toluene)을 0.01% 농도로 첨가합니다. BHT는 용매 추출 과정 동안 이중 결합과 지방산이 산화되는 것을 방지하기 위해 첨가하는 항산화제입니다. 항온수조에서 용매를 약 85 °C로 예열합니다.

식물 조직 1g당 가열된 isopropanol 25 milliliters를 첨가하고, 샘플을 85 degrees의 가열 LOC에서 15분 동안 배양합니다. 귀와 눈 보호구를 착용한 상태에서 튜브가 상온으로 식을 때까지 기다립니다. 마지막으로, 균질기로 샘플을 분쇄하여 균일하게 분산시킨 후 스크류 캡으로 튜브를 밀봉하고 100 RPM으로 1~2분간 흔들어 줍니다. 샘플을 800 G에서 10분 동안 원심 분리합니다.

펠렛으로 압착된 고밀도 물질로부터 유기상을 분리하려면, 파스퇴르 피펫이나 프로펜트를 사용하여 상층액을 제거하고 버립니다. 이때 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 실온의 이소프로판올을 동일한 부피로 첨가하고 샘플을 하룻밤 동안 흔들어 섞습니다.

100 RPM에서 샘플을 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 조직 g당 클로로포름과 메탄올이 2:1 비율로 혼합된 용액 25 milliliters를 첨가하고, 샘플을 하룻밤 동안 흔들어 섞은 후 원심 분리하여 유기상을 제거합니다. 그 다음, 클로로포름과 메탄올이 1:2 비율로 혼합된 용액을 사용하여 이 과정을 반복합니다.

펠릿을 하룻밤 동안 건조하고, 흄 후드에서 무수 황산칼슘이 들어 있는 진공 데시케이터로 튜브를 옮겨 최소 3일 동안 또는 항량에 도달할 때까지 시료를 탈수합니다. 충분히 건조되면 소듐 메톡사이드 촉매 메탈리시스(metalysis)를 통한 탈지(defloration) 준비가 완료됩니다. 유리 시린지를 사용하여 건조된 조직이 들어 있는 튜브에 내부 표준물질 용액 두 가지를 첨가하는데, methyl HETO decanoate 25 microliters와 omega pentec and lactone 25 microliters 순으로 넣습니다.

심층 중합을 시작하려면, 샘플에 methyl acetate 0.9 milliliters를 추가한 후, sodium meth oxide 촉매 1.5 milliliters와 methanol 3.6 milliliters를 차례로 추가합니다. 샘플을 60 degrees에서 2시간 동안 배양하며 반응 시스템 내에서 주기적으로 vortexing합니다. 지질 폴리에스터는 친핵성 meth oxide 음이온과 반응하여 불안정한 사면체 중간체를 형성하며, 이는 지방산 methyl ester와 oxide 음이온으로 쉽게 분해됩니다. 이 oxide들은 짝염기이며 methanol과 반응하여 촉매 활성 meth IDE 음이온을 재생함으로써 추가적인 심층 중합 반응을 지속시킵니다.

시스템 내에 물이 존재할 경우, 이는 메톡시드 나트륨과 반응하여 수산화 나트륨을 형성합니다. 수산화 나트륨은 폴리에스테르를 원치 않는 유리 지방산으로 가역 불가능하게 전환시키는 강염기입니다. 따라서 가수분해를 방지하기 위해, 시스템 내의 모든 수산화 나트륨을 제거할 수 있도록 메틸 아세테이트를 첨가합니다.

튜브를 실온까지 식힙니다. 배양 후, 각 튜브에 10 milliliters의 methylene dichloride를 첨가하여 단량체를 추출합니다. 그다음, 시료를 산성화하기 위해 1.5 milliliters의 glacial acidic acid를 첨가합니다.

튜브에 0.5 molar 염화나트륨 용액을 채우고, 충분히 볼텍싱한 후 수 분 동안 원심분리합니다. 흄 후드 내에서 수행하십시오. 피펫을 사용하여 하층의 유기상을 깨끗하게 미리 세척된 중간 크기의 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

샘플을 식염수로 다시 세척하고 볼텍싱한 후 10분 동안 원심분리합니다. 상층의 수성층을 제거한 다음, 용액에 남아 있는 미량의 수분을 제거하기 위해 건조제인 무수 황산나트륨을 샘플에 첨가하여 볼텍싱하고 원심분리합니다. 용매를 깨끗하게 사전 세척된 소형 튜브로 옮긴 후, 질소 농축기에 튜브를 넣고 용매를 증발시켜 단량체의 건조 잔류물을 얻습니다. 유리 주사기를 사용하여 퓨린 100 µL와 B-S-T-F-A 100 µL를 첨가하여 하이드록실기를 휘발성 트리메틸실릴 유도체로 전환합니다.

샘플을 100 °C에서 10분 동안 배양합니다. 튜브를 냉각시킨 후 질소 가스 하에서 증발시킵니다. 1:1 HEPTANE 톨루엔 용액 500 µL를 첨가하여 잔류물을 다시 용해시킨 다음, 짧게 원심 분리합니다.

유도체화된 시료를 400 µL 인서트가 포함된 GC 바이알로 옮깁니다. 바이알을 밀폐하여 가스크로마토그래프에 로딩하면, 시료가 분석을 위해 모세관 컬럼으로 주입되고 용리액은 사중극자 질량분석기로 검출됩니다. GCMS 분석을 통해 얻은 원시 데이터는 처리되어 각 시료의 크로마토그램으로 제시됩니다.

서로 다른 크로마토그래피 피크에 해당하는 개별 단량체들은 각각의 특이적 질량 분석 스펙트럼을 통해 식별됩니다. GC 머무름 시간을 통해 내부 표준 정량법으로 개별 단량체의 양을 결정함으로써, 시료 간의 단량체 풍부도와 조성을 비교할 수 있습니다. 여기 제시된 것은 야생형 및 P450 모노옥시게나제 효소를 인코딩하는 유전자의 두 가지 돌연변이 대립유전자에 해당하는 토끼 농양 잎 조직에서 방출된 단량체의 대표적 분석 결과로, 서로 다른 단량체 프로파일을 보여주는 중첩 크로마토그램입니다.

본 연구 결과는 야생형 및 돌연변이 애기장대 식물에서 세 가지 주요 큐틴 모노머의 함량에 유의미한 차이가 있음을 보여줍니다. 이 프로토콜은 구성 모노머의 분리, 식별 및 정량을 통해 식물 지질 폴리에스테르의 조성을 분석하는 강력한 방법입니다. 이 절차는 확장 가능하며 뿌리, 종자, 잎 및 기타 전체 조직을 포함한 다양한 식물 재료의 대량 샘플을 처리하도록 쉽게 조정될 수 있습니다.

이 기술은 고등 식물의 큐틴 및 수베린의 생합성 조절과 분포를 조사하는 연구에 적용 가능합니다.