특정 게놈 지역과 enChIP으로 관련 분자의 식별의 분리

이 절차의 전반적인 목적은 분자 간 상호작용을 유지하면서 특정 게놈 영역을 분리하여, 해당 게놈 영역과 상호작용하는 분자들을 식별하는 것입니다. 이 방법은 전사 및 후성유전학적 조절과 같은 게놈 기능 분야의 의문점을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 게놈 영역과 상호작용하는 분자들을 직접적으로 식별할 수 있다는 점입니다.

시연은 제 연구실의 조교수인 Toshitsugu Fujita가 진행하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 원하는 DNA 결합 분자를 제작하십시오. 여기에는 원하는 gBlock 서열을 생성하고, 예를 들어 이를 레트로바이러스에 삽입하여 세 개의 FLAG-dCas9와 복합체를 이루는 가이드 RNA를 생성하는 과정이 포함됩니다.

또는, 표적 서열을 인식하는 세 개의 FLAG-TAL 단백질을 생성할 수 있습니다. 그 다음, 텍스트 프로토콜에 따라 준비된 레트로바이러스를 세포에 감염시킵니다. 설계된 DNA 결합 분자의 발현을 확인하고 세포주를 구축합니다.

이제 포름알데히드를 사용하여 세포를 가교 결합시킵니다. 형질전환된 세포 20 million개를 일반 배양액 30 milliliters에 현탁하고, 최종 농도가 1%가 되도록 37% formaldehyde 810 microliters를 첨가합니다. 혼합물을 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 5분 후, 1.25 molar glycine 3.1 milliliters를 첨가하여 가교 결합 반응을 중단시킵니다.

다음 단계로 진행하기 전, 세포를 실온에서 10분 동안 방치합니다. 그 다음, 냉장 원심분리기를 사용하여 세포 튜브를 300 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고, 30 milliliters의 PBS로 혼합 및 원심분리를 하여 세포 펠릿을 세척합니다.

PBS로 두 번 세척합니다. 필요한 경우, 고정된 세포의 세척된 펠렛을 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 이어서 세포에서 크로마틴을 수집합니다.

이들을 10 milliliters의 용해 버퍼(lysis buffer)에 현탁시키고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 그 후, 냉장 원심분리기를 사용하여 세포를 수집하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 이제 세포 펠릿(cell pellet)을 핵 용해 버퍼(nuclear lysis buffer)에 현탁시키고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.

배양하는 동안 몇 분마다 한 번씩 혼합물을 짧게 볼텍싱합니다. 다시 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 이제 10 milliliters의 PBS로 펠릿을 세척하고, 다시 한번 원심분리를 하여 세척액을 제거합니다.

이렇게 하면 크로마틴 분획이 생성되며, 필요한 경우 급속 냉동하여 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 크로마틴 펠렛을 800 µL의 modified lysis buffer three에 현탁한 후, 현탁액을 더 작은 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 이제 초음파 분쇄기 프로브를 3단계 출력의 연속 모드로 작동시킵니다.

염색질을 단편화하기 위해, 10초간의 초음파 처리와 20초간의 얼음 위 방치를 수동으로 반복합니다. 샘플이 과열되지 않도록 매 5회 또는 6회 주기마다 얼음 위 방치 시간을 2분으로 연장합니다. 샘플에 거품이 생기는 것을 방지하기 위해 프로브 팁이 튜브 바닥에 닿지 않도록 유지하며, 이 초음파 처리 주기를 10회에서 18회까지 수행합니다.

초음파 처리가 끝나면, 저온 고속 원심분리를 통해 샘플을 수집합니다. 그런 다음, 단편화된 크로마틴이 포함된 상층액을 새 튜브로 옮기고 펠렛은 버립니다. 단편화 정도를 평가하는 방법은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.

면역침강을 준비하기 위해, 먼저 항체를 Dynabeads에 접합하십시오. 이 면역침강 과정은 2,000만 개의 세포에서 유래한 샘플 규모에 맞춰 설계되었습니다. Triton X-100이 포함된 변형 용해 버퍼 3을 단편화된 크로마틴에 부피의 1/5만큼 첨가하여 Triton의 최종 농도가 1%가 되도록 하십시오.

다음으로, 혼합물을 정상 마우스 IgG가 접합된 자기 비드에 추가합니다. 냉장 상태의 로테이터에서 1시간 동안 반응을 배양합니다. 이후, 마그넷 스탠드에서 3분 동안 용액으로부터 비드를 끌어당겨 분리합니다.

그런 다음, 상층액을 수집합니다. 수집한 상층액을 anti-FLAG 항체가 결합된 마그네틱 비즈가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 이 결합 반응을 4°C의 로테이터에서 하룻밤 동안 진행합니다.

다음 날 아침, 튜브에 자석을 3분 동안 대어 비드를 수집합니다. 그런 다음, 상층액을 파이펫으로 뽑아내어 버립니다. 이제 비드를 세척합니다.

이를 1 mL의 저염 버퍼(low-salt buffer)에 현탁하고 4 °C의 로테이터에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후, 자석을 이용해 비즈를 분리하고 상층액을 제거합니다. 저염 버퍼를 사용하여 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.

동일한 기술을 사용하여 고염 농도 버퍼로 두 번 더 세척하십시오. 이 방법을 계속 사용하여 염화 리튬 버퍼로 비드를 두 번 세척하십시오. 마지막으로, TBS-IGEPAL CA-630으로 비드를 한 번만 세척하십시오.

일곱 번의 세척 단계 후, 비드를 200 µL의 용출 버퍼에 현탁하고 37 °C에서 20분 동안 배양합니다. 그 다음, 자석을 이용해 비드를 끌어당기고 상층액을 새 튜브에 수집합니다. 수율을 높이기 위해 이 용출 단계를 반복합니다.

그 다음, 수율을 추정하기 위해 DNA의 약 5%를 정제합니다. 먼저 용출액의 대부분을 침전 반응액과 혼합합니다. 염색질을 -20 °C에서 하룻밤 동안 침전시킵니다.

다음 날, 샘플을 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 펠렛을 1 mL의 70% ethanol로 세척하고 10분 동안 원심분리를 반복합니다. 그런 다음, 상층액을 제거하고 펠렛을 40 µL의 2x sample buffer에 현탁합니다.

이제 현탁액을 5분 동안 충분히 볼텍스하십시오. 그런 다음 100 °C에서 30분 동안 배양하여 가교 결합을 변성 및 해제합니다. 가열 후, 샘플 40 µL를 SDS-PAGE 젤에 로딩하여 전기영동을 수행하십시오.

일반적으로 4에서 20%의 구배(gradient)가 사용됩니다. 염료가 웰(well)에서 1cm 아래로 내려갈 때까지 겔을 전기영동합니다. 그 후, 겔을 염색하고 약 2mm 길이의 다섯 조각으로 자릅니다.

겔 조각에서 단백질을 희석하여 질량 분석법 분석에 사용하십시오. RNA 정제 및 이어지는 시퀀싱 분석은 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다. 전반적으로 enChIP을 사용하여 표적 게놈 영역의 최대 10%까지 정제할 수 있습니다.

여기서는 비특이적 Sox2 유전자좌와 비교하여 IRF-1 유전자의 프로모터 영역을 표적으로 한 분석의 수율을 확인할 수 있습니다. 또 다른 예로는 비특이적 gamma-satellite 유전자좌 대비 텔로미어를 표적으로 한 분석이 있습니다. enChIP SILAC을 통해 인터페론 감마 특이적 방식으로 IRF-1 프로모터와 결합하는 여러 단백질을 식별하였습니다.

enChIP과 질량 분석법을 결합하여 텔로미어 결합 단백질 또한 확인하였습니다. 이어서 enChIP RNA 시퀀싱을 통해 텔로미어와 연관된 RNA를 식별하였습니다. 이 기술의 개발 이후, 전사 및 후성유전학적 조절 분야의 연구자들은 다양한 생물학적 시스템에서 이러한 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.