특정 게놈 지역과 enChIP으로 관련 분자의 식별의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 게놈 영역과 상호 작용하는 분자를 식별하기 위해 분자 상호 작용을 유지하는 특정 게놈 영역을 분리하는 것입니다. 이 방법은 전사 및 후성유전학적 조절과 같은 게놈 기능 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 게놈 영역과 상호 작용하는 분자를 직접 식별할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 조교수인 후지타 토시츠구(Toshitsugu Fujita)입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 관심 있는 DNA 결합 분자를 엔지니어링합니다. 여기에는 관심 있는 gBlock 염기서열을 생성하고 이를 레트로바이러스에 삽입하여 예를 들어 3개의 FLAG-dCas9와 복합체를 이루는 가이드 RNA를 생성하는 것이 포함됩니다.

또는, 타겟 서열을 인식하는 3개의 FLAG-TAL 단백질을 생성할 수 있습니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 준비된 레트로바이러스로 세포를 감염시킵니다. 조작된 DNA 결합 분자의 발현을 확인하고 세포주를 확립합니다.

이제 세포를 포름 알데히드로 가교 연결하여 진행하십시오. 2,000만 개의 형질 주입된 세포를 30ml의 일반 배양 배지에 현탁시키고 810마이크로리터의 37% 포름알데히드를 첨가하여 최종 농도 1%를 얻습니다.혼합물을 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 5분 후 1.25몰 글리신 3.1ml를 첨가하여 가교 반응을 종료합니다.

진행하기 전에 셀을 실온에 10분 동안 그대로 두십시오. 다음으로, 냉장 원심분리기에서 300G의 세포 튜브를 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 조심스럽게 버리고 혼합 및 원심분리를 통해 PBS 30ml로 세포 펠릿을 세척합니다.

PBS 세척을 두 번 수행합니다. 필요한 경우 고정 된 셀의 세척 된 펠릿은 섭씨 영하 80도에서 보관 할 수 있습니다. 계속해서 세포에서 염색질을 수집합니다.

10ml의 용해 완충액에 현탁시키고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 냉장 원심 분리기를 사용하여 세포를 수집하고 상층액을 조심스럽게 버립니다. 이제 세포 펠릿을 핵 용해 완충액에 현탁시키고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.

배양 중 몇 분마다 혼합물을 잠시 와류로 만듭니다. 다시 말하지만, 원심분리로 세포를 수집합니다. 이제 10ml의 PBS로 펠릿을 세척하고 다른 원심분리로 세척 용액을 제거합니다.

이것은 염색질 분획을 생성하고, 원하는 경우 급속 냉동하여 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다. 염색질 펠릿을 800마이크로리터의 변형 용해 버퍼 3에 현탁시키고 현탁액을 더 작은 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 이제 연속 작동으로 레벨 3 전력으로 초음파 처리 프로브의 전원을 켭니다.

염색질을 조각화하려면 10초의 초음파 처리와 얼음 위의 20초 사이를 수동으로 순환합니다. 5번째 또는 6번째 주기마다 얼음 단계를 2분으로 연장하여 샘플이 과열되지 않도록 합니다. 이 초음파 처리 주기를 10-18회 수행하되, 샘플에서 거품이 생기는 것을 방지하기 위해 프로브 끝을 튜브 바닥에서 떨어뜨립니다.

초음파 처리 후 빠른 냉장 원심 분리로 샘플을 수집합니다. 그런 다음 단편화된 염색질을 포함하는 상등액을 새 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 조각화를 평가하는 방법에 대한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.

면역침전을 준비하려면 먼저 항체를 Dynabeads에 접합합니다. 이 면역침전은 2,000만 개의 세포에서 유래한 샘플로 확장됩니다. 단편화된 염색질에 Triton X-100이 포함된 1/5 부피의 modified lysis buffer three를 첨가하여 1%Triton의 최종 농도를 얻습니다.

다음으로, 일반 마우스 IgG에 접합된 마그네틱 비드에 혼합물을 첨가합니다. 냉장 장치가 있는 회전기에서 한 시간 동안 반응을 배양합니다. 나중에 자석 스탠드에서 3 분 동안 용액의 구슬을 끌어 당깁니다.

그런 다음 상층액을 수집합니다. 상등액을 anti-FLAG 항체에 접합된 마그네틱 비드 튜브로 옮깁니다. 이 접합 반응을 섭씨 4도의 회전기에서 밤새 실행합니다.

다음 날 아침, 구슬을 모으기 위해 3분 동안 튜브에 자석을 끼웁니다. 그런 다음 상층액을 피펫으로 빼내고 버립니다. 이제 구슬을 씻으십시오.

1ml의 저염 완충액에 매달아 섭씨 4도의 회전체에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 비드 자화를 분리하고 상층액을 폐기합니다. 저염 버퍼로 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.

동일한 기술을 사용하여 고염 버퍼를 사용하여 두 번 더 세척합니다. 이 방법을 사용하여 염화리튬 완충액에서 비드를 두 번 세척합니다. 마지막으로 TBS-IGEPAL CA-630으로 비드를 한 번만 세척합니다.

7단계 세척 후 비드를 200마이크로리터의 용리 완충액에 현탁시키고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 자화로 비드를 끌어당기고 상등액을 새 튜브에 모읍니다. 이 용리 단계를 반복하여 수율을 높입니다.

그런 다음 DNA의 약 5%를 정제하여 수율을 추정합니다. 먼저 대량의 용리액을 침전 반응으로 혼합합니다. 하룻밤 사이에 염색질을 섭씨 영하 20도에서 침전시킵니다.

다음날, 샘플을 원심 분리하고 상층액을 버립니다. 펠릿을 70% 에탄올 밀리리터로 헹구고 10분 동안 원심분리를 반복합니다. 그런 다음 상등액을 버리고 펠릿을 40마이크로리터의 2x 샘플 버퍼에 현탁합니다.

이제 5분 동안 서스펜션을 소용돌이칩니다. 그런 다음 섭씨 100도에서 30분 동안 배양하여 변성시키고 가교를 역전시킵니다. 끓인 후 SDS-PAGE 젤에 샘플을 40마이크로리터로 가열합니다.

일반적으로 4-20%의 경사가 사용됩니다. 염료가 웰 아래 1cm까지 이동할 때까지 젤을 실행합니다. 그런 다음 젤을 염색하고 약 2mm 길이의 5개 조각으로 자른다.

겔 조각에서 단백질을 희석하여 질량 분석 분석에 사용합니다. RNA의 정제 및 염기서열분석 분석은 텍스트 프로토콜에서 다룹니다. 전체적으로 enChIP를 사용하여 표적 게놈 영역의 최대 10%를 정제할 수 있습니다.

비특이적 Sox2 유전자 자리와 비교하여 IRF-1 유전자의 프로모터 영역을 표적으로 하는 분석의 수율입니다. 또 다른 예는 텔로미어와 비특이적 감마-위성 궤적을 표적으로 하는 것입니다. enChIP SILAC은 인터페론 감마 특이적 방식으로 IRF-1 프로모터와 관련된 여러 단백질을 식별했습니다.

텔로미어 결합 단백질은 또한 질량 분석법과 결합된 enChIP에 의해 식별되었습니다.그런 다음 enChIP RNA 염기서열분석을 사용하여 텔로미어와 관련된 RNA를 식별했습니다. 개발 후 이 기술은 전사 및 후성유전학적 조절 분야의 연구자들이 다양한 생물학적 시스템에서 이러한 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.