Name: 이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 학습하세요 ChIP-Seq를 사용하여 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 탈메틸화효소의 게놈 목표를 식별하는 방법을. 이 기법은 단백질-DNA 상호작용 연구와 후성유전학적 조절 메커니즘 이해에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH에서 115,347 - RSG - 08-271 - 01 - GMC ACS에서, 그리고 CA138631에 의해 부여에 의해 지원되었다.

프로토콜은 원래 B. 랜, 2001 적응했다. 그것은 오돔 외하여 프로토콜의 약간의 수정을 나타냅니다.에서 찾을 수 있습니다 5 <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1. 사전 차단하고 자석 구슬에 항체의 바인딩은 (다음 단계 전에 밤에 수행되어야 함) <ol><li> 신선한 BSA / PBS 용액 (50 MG 10 ML에 BSA PBS -이 솔루션은 한 주일 동안 지속됩니다.) 1 ML에 Dynabeads 단백질 G 100 μL를 (IP 당 여러 개의 IP에 대해 결합) 와시 </li><li> 자기 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 세척 절차를 두 번 더 반복합니다. </li><li> 다음 PBS / BSA 솔루션 비즈 슬러리 (IP 당) 250 μl에 항체의 10 μg을 추가하고 4 회전 플랫폼에서 밤새 품어 ° C. </li><li> 완료되면, PBS / BSA 용액 1 ML의 비즈 세 번 세척 후 PBS / BSA 솔루션 (IP 당) 10 μl에 resuspend. </li></ol> 2. 셀 교차 연결 <ol><li> 이 절차를 시작하려면 약 10 8 각 immunoprecipitation에 대한 세포, 또는 IP를 성장. 여기, 확산 조직 구 림프종 U937 세포가 사용하고 96시간에 대한 TPA와 monocytic 차별 화를위한 유도하고 있습니다. </li><li> 세포의 성장에 따라, 1 %의 최종 농도 미디어에 직접 포름 알데히드 용액을 추가합니다. 그렇다면 그들이 10 분 동안 상온에서 앉아 소용돌이 flasks의 간략하고하실 수 있습니다. 그런 다음, 미디어를 기음과 얼음처럼 차가운 PBS의 15 ML로 세포를 씻어. 한번 세척을 반복합니다. </li><li> 다음 각 용해 완충액 1 6 ML (50 MM HEPES - 코, 산도 7.5, 140 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 % 글리세롤을 0.5 % NP - 40, 0.25 % 트리톤 프로 테아제 억제제를 포함하는 X - 100) 추가 얼음 flasks니다. 그런 다음, 4 20 분 동안 flasks 문제를 일으키고 ° C. </li><li> 마지막으로, 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확 15 ML 원뿔 튜브에게 전송할 수 있습니다. 이 시점에서 전지는 -80 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol> 3. 셀 Sonication <ol><li> 세포가 얼어있다면, 그들을 좀 녹여. 일단 해동, 4에서 10 분 동안 3,000 rpm으로 세포를 스핀 다운 ° C 및 뜨는 폐기하십시오. 그런 다음, 용해 완충액 2 (10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 200 MM NaCl, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.5 MM EGTA, 프로 테아제 억제제를 포함) 6 ML의 세포를 resuspend. 10 분 실온에서 부드럽게 튜브를 록. </li><li> 원심 분리를 반복하고 용해 완충액 3 (프로 테아제 억제제를 포함하는 10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 100 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.5 MM EGTA, 0.1 %의 나트륨 deoxycholate, 0.5 % N - lauroylsarcosine) 2.5 ML에있는 세포를 resuspend . </li><li> 다음, 50 및 60 %의 진폭 사이로 설정 브랜슨 450 Sonifier의 microtip과 얼음 물을 비커에 배치하여 sonication에 대한 중지를 준비합니다. </li><li> 1 분 얼음 30초 지속 버스트 및 냉각을위한 솔루션을 Sonicate. 이러한 펄스에게 10-15 회 반복합니다. 그런 다음 튜브의 내용을 피펫 아래 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다. 추가 5 번 파동과 솔루션을 냉각 계속합니다. </li><li> sonication에 따라 10 %를 추가 트리톤 X - 100 솔루션 볼륨의 1 / 10. 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에 lysates을 전송하고, microcentrifuge에 파편을 스핀. 그런 다음 새로운 튜브에 세포 lysate를 전송할 수 있습니다. </li></ol> 4. 염색질 Immunoprecipitation <ol><li> 이전 염색질의 immunoprecipitation, 또는 칩을, 입력 샘플로 세포 lysate 50 μL를 저장합니다. 그런 다음, Dynabeads 위에서 설명한대로 이전에 작성되었습니다 항체 사전 바운드로 허가 세포 lysate를 결합. 4 ° C 하룻밤에, 50 μL 입력 샘플 이외에, 혼합 록. </li><li> 와시 버퍼 1 ML (50 MM HEPES - 코, 산도 7.6, 0.5 M LiCl, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.7 %의 나트륨 deoxycholate, 1 % NP - 40)와 비즈를 씻으십시오. 그런 다음, 비즈를 수집하고 뜨는을 제거하는 자기 스탠드를 사용합니다. 이 씻어에게 6-8 번 반복합니다. </li><li> 와 최종 세척을 수행 한 ML TE - 플러스 - 50 MM NaCl (10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 50 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 4 2 분 동안 3,000 rpm으로 microcentrifuge에 비즈를 스핀 ° C. 원심 분리 후, 잔여 TE 버퍼를 대기음. </li><li> 그런 다음 샘플에 용출 버퍼 100 μL (50 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % SDS)을 추가합니다. 즉시, 65에서 샘플을 품어 ° C 10~15분하십시오. 정지에있는 구슬을 유지 1.5 ML 튜브 랙마다 이분에 대한 튜브를 스크래치. </li><li> 원심 분리와 자기 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고, PCR 튜브에 뜨는을 전송하기만하면됩니다. 그런 다음 이전에 저장한 입력 샘플을 검색하고 용출 버퍼 3 볼륨을 추가합니다. </li><li> 마지막으로, 65에서 야간 열 자전거 타는 사람에 IP 및 입력 샘플을 배치 ° C를상호 연계를 반대. </li><li> 다음날, 샘플로 TE 버퍼 1 볼륨을 추가합니다. 그런 다음, 0.2 μg / μL의 최종 농도에 RNase A를 추가합니다. 37 1~2시간에 대한 열 자전거 타는 사람의 표본을 품어 ° C. </li><li> 부화 후 0.2 μg / μL의 최종 농도의 proteinase K를 추가합니다. 그런 다음 2 시간 동안 55 ° C에서 열 자전거 타는 사람에 샘플을 품어. </li><li> 다음으로, 페놀 중 하나 볼륨 번 샘플을 추출합니다. 클로로포름 : isoamyl 알콜 페놀 중 하나 볼륨 샘플 잠시 시간을 추출합니다. isoamyl 알콜 : 마지막으로, 클로로포름 중 하나 볼륨 한번 더 샘플을 추출합니다. </li><li> 그런 다음, 각 샘플에 글리코겐의 30 μg를 추가합니다. 또한, 샘플로 에탄올의 0.2 몰라 두 볼륨의 최종 농도에 NaCl을 추가합니다. -80시 30 분 그들을 품어 ° C. 부화 후 샘플을 회전하고 뜨는을 가만히 따르다. 75 % 에탄올 500 μL로 알약을 씻으십시오. 그런 다음 알약을 건조하고는 물 40 μL에 다시 일시 중지합니다. </li><li> sonication 절차에 의해 만들어진 DNA 조각의 크기를 확인하려면, 1.8 % 아가로 오스 겔의 정화 입력 샘플의 5 μg를로드하고 젤을 실행합니다. sonication 절차는 150-350 기본 쌍 범위의 조각을 제작해야합니다. 조각이 범위에 빠지지하지 않은 경우 단, sonication 절차는 파열과 진폭의 수를 변화에 의해 조정되어야합니다. </li><li> 1 IP 샘플 μl 및 입력 샘플의 희석 일련의 유전자 특정 PCR을 수행하여 제어 바인딩을 지역에서 농축을 칩 견고하고 특이성을 확인하려면 다음과 같이하십시오. 두 세 "바운드"지역과 언바운드 컨트롤 지역 IP를 입력 샘플의 품질을 테스트하기 위해 선택해야합니다. </li></ol> 5. 게놈 DNA의 증폭 <ol><li> IP 샘플 또는 입력 샘플 200 NG 34 μl를 시작으로, 최종 수리, 게놈 DNA 샘플 준비 키트를 사용 DNA 조각을 'A'꼬리 추가 및 어댑터의 결합 수행 <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/을 genome_analyzer.ilmn</a> (Illumina, 주식 회사, 샌디에고, CA). </li><li> MinElute PCR의 정제 키트를 사용하여 DNA를 정화하고 50 ° C. 미리 예열되었음을 버퍼 EB (10 MM Club 호텔 트리스, 산도 8.5)에 elute 예를 들어, 각각, IP 및 입력 DNA 샘플의 최종 용리 23 μL와 46 μL를 사용합니다. </li><li> 20 μm의 Sol_PCR_2의 μL 어댑터와 함께 DNA 23 μL를 사용하여 PCR 반응 및 키트 25 μL Phusion DNA의 효소, 20 μm의 Sol_PCR_1 1 μL, 1을 확인하십시오. 다음과 같이 PCR 반응을 실행 2) 10초 98시 ° C, 3) 65 ° C에서 30초; ° C 98 1) 30 초 4) 30 초 72의 ° C, 반복 단계 단계 2-4 18 72에서 시간과 다음 오분 ° C가 드디어 4 ° C. 개최를 </li><li> PCR 증폭에 따라, QIAGEN MinElute PCR의 정제 키트와 함께 DNA 정화. 50 버퍼 EB 사전 따뜻한 15 μL는 ° C와 DNA를 elute. 샘플 1시 4분 0.5 μL를 희석하고 Nanodrop 읽기를 수행합니다. </li></ol> 6. 증폭 제품의 젤 정화 <ol><li> 증폭 제품을 정화, HPLC 등급 물을 사용하여 50 ML의 1.8 % 아가로 오스 겔을 준비합니다. 아가로 오스가 녹은 후 태와 ethidium의 브로마이드를 추가합니다. 그런 다음 젤을 따라줘. 입력 및 IP 샘플을 로딩 버퍼 4 μL를 추가한 후 겔을로드합니다. 그런 다음, 45 분 120 볼트에서 젤을 실행합니다. </li><li> 그것이 실행 후 젤 분석. 젤 150 사이 350 기본 쌍이 ​​생산 범위에 조각을 공개해야합니다. 그들은 길이와 어댑터에서 50 250 기본 쌍 사이의 게놈의 DNA 조각을 나타냅니다. </li><li> 메스로 150 350 기본 쌍 범위에서 자료를 포함하는 젤의 엑사이스 지역. 어댑터 - 어댑터 밴드를 절개하지 않도록 몸조심, 이것은 약 12​​0 기본 쌍에서 실행됩니다. 제조 업체의 지침에 따라 QIAquick 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 복구합니다. 특히, 400 밀리그램 이하의 젤 슬라이스에 대한 QIAquick 젤 추출 키트에서 한 컬럼을 사용합니다. 추출 과정을 시작하려면, 젤 1 볼륨에 버퍼를 QG 3 볼륨을 추가합니다. 이소프로판올 1 볼륨을 추가하고 열에 혼합물을로드합니다. 열을 씻어 QG 0.5 ML를 사용 키트 설명서에 설명된 표준 절차에 의해 따랐다. H 2 O를 사용하여 미리 예열 50 ° C DNA를 elute 수 있습니다. 37 5 분 H 2 O 30 μl로 컬럼을 품어 ° C 내려 회전하기 전에. </li><li> 가열하지 않고 Speed​​vac에서 정확하게 11 μL로 샘플을 건조시킵니다. 샘플 1 μL를 제거하고 Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. </li><li> 마지막으로, 같이에서 설명 Illumina 게놈 AnalyzerIIe 사용하여 농축 유전자 제품 식별 <a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl을</a>/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6. </li></ol> 7. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 다음과 같은 실험의 전반적인 목표는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 게놈 목표를 식별하는 것입니다. (P1)이 적절한 크기의 DNA 조각을 만들어 sonicated됩니다 교차 연결된 염색질의 준비에 의해 이루어진다. (P2) 두 번째 단계로서, RBP2 바운드 DNA 조각은 RBP2 항체와 immunoprecipitated 있습니다. (P3) 다음, 복구 DNA 조각은 끝에 수리하고 어댑터 Illumina 클러스터 역의 흐름 세포에 대한 분석을 위해 게놈 DNA의 라이브러리를 준비하는 게놈 DNA의 끝부분에 출혈도 잡았 있습니다. DNA 라이브러리는 사이클의 낮은 번호를 사용하여 PCR로 증폭됩니다. (P4) 마지막으로, illumina 합성 짧은 고유 인간 게놈에 정렬됩니다 읽고, 중요한 봉우리는 RBP2 풍부한 지역을 파악하기 위해 식별과 가장 가까운 유전자에 주석 있습니다. (P5) 결과는 RBP2 풍부한 지역의 게놈 전체의 신분에 따라 RBP2 대상 유전자와 연관된 분자 기능을 보여줄 것을 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. sonication 절차에 의해 만들어진 DNA 조각의 크기를 확인하려면 염색질 sonication의 결과를 확인, 정화 입력 샘플 5 μg (1 / 10) 1.8 % 아가로 오스 겔에 적재가되었던 것. 예상했던대로, 우리 so​​nication 절차 150-350 BP의 범위에서 조각을 생산. 조각이 범위에 빠지지하지 않은 경우 단, sonication 절차는 파열과 진폭의 수를 변화에 의해 적절하게 조정해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 증폭 제품의 젤 정화가. PCR 제품은 어댑터를 제거하고 클러스터 세대 플랫폼에 템플릿의 크기 범위를 선택하는 젤에서 실행됩니다. 이 젤 150 및 350 기본 쌍 사이의 범위에서 조각이 생성 것을 나타냅니다. 그들은 길이와 어댑터에서 50 250 기본 쌍 사이의 게놈의 DNA 조각을 나타냅니다. 메스로 젤의 우리는 소비세 선택한 영역. 치료는 약 12​​0 기본 쌍에서 실행 어댑터 어댑터 밴드를 피하기 위해 이동해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 이소형 특정 항체는 RBP2의 크고 작은 isoforms 구별하실 수 있습니다. RBP2 단백질 구조가 도메인보기에 표시됩니다. 촉매 히스톤 demethylation JmjC 도메인과 관련된 JmjN 도메인 시퀀스 특정 DNA 바인딩, 잠재적으로 DNA 또는 기타 단백질, 여러 박사 도메인과 상호 작용 수있는 C5HC2 아연 손가락 가능한 건조한 도메인 : RBP2 여러 도메인을 포함하고 있습니다. RBP2 isoforms 구별 수 있도록 두 가지 안티 RBP2 항체는 굵은 선으로 표시된 RBP2 조각에 대한 파생되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="그림 5a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5a"> 그림 5A. 염색체와 유전자 Ensembl와 함께 RBP2 바인딩 지역의 개요. 확인된 풍부한 RBP2의 게놈 좌표가 (모든 isoforms 및 대형 이소형) 바인딩 지역 염색체가 현명 제공됩니다. Ensembl 유전자의 Occupances (버전 54, hg18) 염색체에있는가 (이 그림에서 염색체 10) 검은 바 (맨 위 패널)로 제공됩니다. 각 RBP2 바인딩 지역은 중앙 패널은 모든 RBP2 isoforms에게 염색체 10 일 구속 지역을 표시하는 수직선,로 표시하고, 하단 패널 RBP2 대형 이소형 바인딩 영역을 표시합니다. 중간과 하단 패널은 중복의 개요 및 염색체 10 RBP2 isoforms의 특정 숙박을 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="그림 5b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5b"> 그림 5B. RBP2 대상 유전자의 기능 강화 분석. 히트맵 FDR을 보여주는 풍부한는 RBP2 (모든 대형 isoforms)의 (RBP2 바인딩 영역에 유전자를 가장 가까운) 바운드 유전자 간의 분자 기능 범주를 GO (P - 값 ≤ 0.05) 대폭 수정. 붉은 방향으로 색상이 높은 통계 중요성을 나타내는 노란색이 낮은 통계 중요성을 나타냅니다, 그리고 회색은 통계 중요성을 나타냅니다 없습니다. 농축 분석 RBP2 대상 유전자의 중복과 이소형 특정 분자 기능을 보여줍니다.

<ol><li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li>
<li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li>
<li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li>
<li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

RBP2 isoforms 사이의 기능적 차이는 결정되지 않았습니다. 우리는 RBP2 isoforms에 의해 바운드 게놈 영역을 파악하고이 지역이 대표하는 기능 범주를 정의하는 종합적인 접근 방식을 사용했습니다. 이것은 얻은 일련의 생물 정보학 분석을 읽은 다음에 칩 Seq 분석에 의해 성취되었다. RBP2는 히스톤 꼬리에 methylated 리신 잔류물을 수정합니다. 우리는 RBP2 큰 이소형은 인간의 게놈 (그림 5A)의 다른 지역이 모듈 바인딩 부족 methylated 히스톤 라이신과 RBP2 작은 이소형에 대한 인식 모듈을 포함하는 것으로 나타났습니다. 중요한 것은, 이소형 특정 지역 및 중복 지역은 다른 분자 기능 (그림 5B)와 유전자에 속합니다. 예를 들어, &quot;염색질 결합&quot;및 &quot;전사 인자 바인딩&quot;기능은 RBP2 작은 이소형의 유전자 표적 관찰 작용의 수 있지만하지 RBP2 대형 이소형 (그림 5B). 실제 유전자를 비교하여 큰 이소형가 특별히 특정 유전자에 모집하는 경우에는 모든 isoforms 및 RBP2 대형 이소형 (데이터가 표시되지 않음)에 대해, 우리도 정의할 수 있습니다 생성 설정합니다.

Oligonucleotide 시퀀스 2,006 Illumina, 주식 회사 모든 권리 보유. <ul><li> Sol_PCR_1 순서 5&#39; - AAT GAT GCG ACG ACC ACC 개그 ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC CTT GCT CCG ATC T - 3 &#39; </li><li> Sol_PCR_2 순서 5&#39; - CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T - 3 &#39; </li></ul>

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

자신의 목표를 transcriptional 및 epigenetic 요인 모집들은 규제에서 중요한 단계입니다. 눈에 띄게 특정 히스톤 수정에 바인딩 단백질 도메인은 채용에 등장. 그 중 하나가 도메인을 여러 염색질 결합 단백질에있는 공장 homeodomain (PHD)입니다. epigenetic 계수 RBP2 여러 박사 도메인을 가지고 있지만, 그들은 다른 기능 (그림 4)가. 특히, 인간의 백혈병에 RBP2 종양 발생 융합에있는 C - 터미널 PHD 도메인, 히스톤 H3 (H3K4me3) 1 리신 4 trimethylated에 바인딩합니다. C - 터미널 박사 학위를 포함하는 RBP2의 이소형에 해당하는 성적표는 monocytes이에 promonocytic, 림프종 - 유래, U937 세포의 분화 동안 축적. 데이터의 두 집합과 일치, 게놈 차원의 분석은 차별화된 U937 세포에 RBP2 단백질이 높은 H3K4me3 3에 대한 풍부한 게놈 지역에 현지 도착 것으로 나타났다. 그 목표를 RBP2의 지방화는 RBP2 히스톤 demethylase 활동 및 transcriptional 활동의 감소로 인해 H3K4me3의 감소로 연결합니다. 대조적으로, RBP2의 다른 두 박사 학위가 H3K4me3를 바인딩할 수 없습니다. 특히, RBP2의 C - 터미널 도메인 PHD는 작은 RBP2 이소형 4 결석입니다. 그것은 H3K4me3와 상호 작용을 결여 RBP2,의 작은 이소형가 게놈 위치에 더 큰 이소형 다릅니다 것을 알았기 때문에. RBP2 isoforms의 게놈 위치에 차이는 RBP2 함수에서 관찰된 다양성에 대한 계정 수 있습니다. 특히, RBP2는 retinoblastoma 단백질 (PRB)에 의해 매개 세포 분화에 중요한 선수이다. ;에 RBP2에 의해 바운드 2) 유전자 차별 - 1) 분화의 독립적인 방식으로 RBP2 구속 유전자 : isoforms 사이의 구별없이 이러한 데이터 이전 게놈 차원의 분석과 일치 RBP2 대상 유전자의 서로 다른 두 그룹을 식별 종속 방식. isoforms 사이의 로컬 리 제이션의 차이를 확인하려면 우리는 칩 Seq하여 게놈 차원 위치 분석 수행. 우리 모두가 RBP2 대상을 찾았습니다 모두 RBP2 isoforms을 탐지 항체를 사용하여. 또한 우리는 크고 작은하지 RBP2 이소형 (그림 4) 바인딩 항체 있습니다. 대형 이소형 대상을 식별하는 한, 그 다음 작은 이소형의 목표를 밝혀 모든 RBP2 대상에서 그들을 빼야 수 있습니다. 이러한 데이터는 게놈에서의 바인딩 사이트에 단백질 모집에 염색질 - 상호 작용하는 도메인의 기여를 보여줍니다.

여기서 우리는 히스톤 바인딩 도메인에 차이가 단백질 isoforms의 게놈 차원 위치 분석을 위해 염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로 시저를 발표하고 있습니다. 우리는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 목표물을 식별 칩 Seq 분석에 적용됩니다.

전사 및 후성유전적 인자가 표적 부위로 모집되는 것은 이들의 조절에서 핵심적인 단계입니다. 이러한 모집 과정에서 두드러지게 나타나는 것은...

다음 실험의 전반적인 목적은 RBB2 히스톤 탈메틸화효소인 KDM5A1의 게놈 타겟을 식별하는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 적절한 크기의 DNA 단편을 생성하기 위해 초음파 처리를 거친 교차 결합 크로마틴을 준비함으로써 달성됩니다. RBB2가 결합된 DNA 단편은 RBB2 항체를 사용하여 면역 침전시킵니다.다음으로, 회수된 게놈 DNA를 PCR로 증폭하여 시퀀싱을 진행합니다. 마지막으로, Illumina로 시퀀싱된 short read를 인간 게놈에 고유하게 정렬(align)하고, 유의미한 피크를 식별하여 가장 가까운 유전자에 주석을 답니다. Rbbb two를 식별하기 위해, 게놈 전반의 Rbbb two 농축 영역 식별을 바탕으로 Rrb B two 표적 유전자 두 개와 관련된 분자 기능을 보여주는 결과물을 얻습니다.안녕하세요, 저는 시카고 일리노이 대학교 생화학 및 분자유전학과의 Elizabeth Bencia 박사 연구실 소속 Mike입니다. 그리고 저는 BARCEL 생의학 연구 단지 대학의 NGA 박사가 이끄는 생의학 유전체학 연구실 소속 ala입니다.저는 Danielle Dal입니다. 그리고 저는 William Richter입니다. 저희 둘 다 Benevolence Skill Lab 소속입니다.오늘은 염색질 면역침강 및 시퀀싱 절차에 대해 설명하겠습니다. 저희 실험실에서는 히스톤 탈아세틸레이스의 결합 부위를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.이 절차를 시작하려면, 면역침전법(immunoprecipitation 또는 ip) 1회당 약 10⁸개의 세포를 배양하십시오. 여기서는 미만성 골용해성 림프종 세포를 사용합니다.U 9 37 세포를 사용하며, 세포 성장 후 TPA를 사용하여 96시간 동안 단핵구 분화를 유도합니다. 포름알데히드 용액을 배지에 직접 첨가하여 최종 농도가 1%가 되도록 합니다. 그다음 플라스크를 가볍게 흔들어 섞은 후 실온에서 10분 동안 둡니다. 이어서 배지를 흡입하여 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS 15 milliliters로 세포를 세척합니다. 이 세척 과정을 한 번 더 반복합니다.다음으로, 얼음 위에서 각 플라스크에 6 mL의 lysis buffer one을 첨가합니다. 그런 다음 4 °C에서 20분 동안 플라스크를 흔들어 줍니다. 마지막으로, 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 회수하고 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.이 시점에서 세포는 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 세포를 동결했다면, 이를 해동하십시오. 해동 후 세포를 원심 분리하여 상층액을 제거하십시오.그 다음 세포를 6 mL의 lysis buffer two에 재현탁하고, 실온에서 10분 동안 튜브를 부드럽게 흔들어 줍니다. 원심분리를 반복한 후 세포를 2.5 mL의 lysis buffer three에 재현탁합니다. 다음으로, Branson 450 sonicator의 마이크로 팁을 50~60% 진폭으로 설정하고 현탁액을 얼음물이 담긴 비커에 넣어 초음파 처리를 준비합니다.용액을 32초 동안 일정하게 초음파 처리하고 얼음 위에서 냉각합니다. 1분 동안 이러한 펄스 처리를 10~15회 반복한 다음, 튜브의 내용물을 피펫으로 위아래로 섞어 새로운 튜브로 옮깁니다. 용액에 대해 펄스 처리와 냉각을 계속 진행합니다.초음파 처리 후 5회 더 추가로, 용액 부피의 1/10에 해당하는 10% Triton X 100을 첨가합니다. 그 다음 용해물을 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 크로마틴 면역침강 또는 ChIP을 수행하기 전에 마이크로 원심분리기로 찌꺼기를 제거합니다. 세포 용해물 50 µL를 입력 샘플로 저장합니다.그런 다음, 서면 프로토콜에 기술된 대로 미리 준비한 항체가 결합된 dyna beads를 투명하게 정제된 세포 용해물과 혼합합니다. 50 µL의 입력 시료를 추가하여 혼합물을 4 °C에서 밤새도록 쉐이킹합니다. 1 mL의 세척 완충액으로 비즈를 세척합니다.그 다음 자성 스탠드를 사용하여 비드를 수집하고 상층액을 제거합니다. 이 세척 과정을 6~8회 반복합니다. 마지막으로 1 mL의 TE와 50 mM sodium chloride를 혼합하여 최종 세척을 수행합니다.원심 분리 후 마이크로 원심분리기로 비드를 스핀 다운하고, 잔류 TE 버퍼를 흡입하여 제거합니다. 그 다음, 샘플에 100 µL의 용출 버퍼를 즉시 첨가합니다.샘플을 65 °C에서 10~15분 동안 배양합니다. 비드가 부유 상태를 유지하도록 2분마다 1.5 mL 튜브 랙에 튜브를 가볍게 긁어줍니다. 원심분리와 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 수집하고 SNAT를 PCR 튜브로 옮깁니다.그 다음, 이전에 저장해 둔 입력 샘플을 회수하고 용출 버퍼를 3배 부피만큼 첨가합니다. 마지막으로, IP 샘플과 입력 샘플을 서멀 사이클러에 넣고 65 °C에서 하룻밤 동안 처리합니다. 다음 날 가교 결합을 해제하기 위해 샘플에 TE 버퍼를 1배 부피만큼 첨가합니다.그런 다음 RNAs A를 최종 농도가 0.2 µg/µL가 되도록 첨가합니다. 시료를 서멀 사이클러(thermal cycler)에서 37 °C로 1~2시간 동안 배양합니다. 배양 후, proteinase K를 최종 농도가 0.2 µg/µL가 되도록 첨가합니다.그 후 서멀 사이클러(thermal cycler)에서 샘플을 55 °C로 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 1부피의 페놀(phenol)을 사용하여 샘플을 1차 추출합니다. 이어서 1부피의 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(phenol chloroform isoamyl alcohol)을 사용하여 샘플을 2차 추출합니다.마지막으로 클로로포름-이소아밀 알코올 1부피로 샘플을 다시 한번 추출합니다. 그 다음 각 샘플에 30 µg의 글리코겐을 첨가합니다. 또한, 최종 농도가 0.2 M이 되도록 염화나트륨을 첨가하고, 샘플에 2부피의 에탄올을 첨가합니다.-80°C에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 샘플을 원심 분리하고 상층액을 따라냅니다. 펠렛을 500 µL의 75% ethanol로 세척한 후, 펠렛을 건조시키고 40 µL의 물에 재현탁합니다.SONICATION 과정으로 생성된 DNA 단편의 크기를 확인하려면, 정제된 입력 시료 5 µg을 1.8% 아가로스 겔에 로딩하여 전기영동을 수행하십시오. 초음파 분쇄 과정은 150에서 350 base pairs 범위의 단편을 생성해야 합니다. 만약 단편의 크기가 이 범위에 해당하지 않는 경우, 게놈 DNA 증폭 전에 버스트 횟수와 진폭을 조절하여 초음파 분쇄 과정을 조정해야 합니다.서면 프로토콜에 기술된 대로 샘플의 크기, 농도 및 농축도를 확인하십시오. 게놈 DNA 증폭을 시작하려면, IP 샘플 34 µL와 input 샘플 200 ng를 준비하십시오. 서면 프로토콜에 기술된 대로 Illumina 게놈 DNA 샘플 프렙 키트를 사용하여 DNA 단편에 a-tail 추가 및 어댑터 라이게이션을 수행하고 수선하십시오.mini lut PCR 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제한 후, 50 °C로 예열한 buffer EB로 용출합니다. IP 및 input DNA 샘플에 대해 각각 23 µL와 46 µL를 사용하십시오. 어댑터가 포함된 DNA 23 µL와 키트 제공 fusion DNA polymerase 25 µL를 사용하여 PCR 반응을 수행합니다.20 µM의 sole PCR one 1 µL와 20 µM의 sole PCR two 1 µL를 넣습니다. 서면 프로토콜에 기술된 대로 PCR 반응을 수행합니다. PCR 증폭 후, Qiagen mini loop PCR purification kit를 사용하여 DNA를 정제합니다.15 µL의 buffer EB를 50 °C로 예열하고, 샘플 0.5 µL를 1:4로 희석한 후 NanoDrop 측정을 수행하여 증폭 산물을 정제합니다. HPLC 등급의 물 50 mL를 사용하여 1.8% AGROS 겔을 준비하고, AGROS가 녹은 후 TAE와 bromide를 첨가합니다. 그 다음 겔을 붓고 샘플을 로딩합니다.입력(input) 및 면역침강(IP) 시료에 4 µL의 로딩 버퍼를 추가한 후, 120 V에서 45분 동안 겔 전기영동을 수행합니다. 전기영동이 완료된 후 겔을 분석합니다. 분석 결과 150~350 bp 범위의 단편들이 생성되었음을 확인할 수 있어야 합니다.이들은 길이가 50에서 250 base pairs 사이인 genomic DNA 단편들입니다. 그리고 메스로 150에서 350 base pair 범위의 물질이 포함된 겔 영역을 절제합니다. 이때 약 120 base pairs에서 나타나는 adapter band를 절제하지 않도록 주의하십시오.제조사의 지침에 따라 kayak quick gel extraction kit를 사용하여 DNA를 회수하십시오. 가열하지 않은 상태에서 speed back을 이용해 샘플을 정확히 11 µL가 되도록 건조하십시오. 샘플에서 1 µL를 취해 NanoDrop 분광광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정하십시오.마지막으로, Illumina 게놈 분석기를 사용하여 농축된 유전자 산물을 식별하고, 서면 프로토콜에 기술된 대로 결합 부위와 표적 유전자를 분석합니다. 식별된 농축 RB 결합 단백질 2 또는 RBP2 결합 영역의 게놈 좌표는 염색체별 형식으로 제시됩니다. 염색체 내 앙상블 유전자의 점유 상태는 검은색 막대로 시각화할 수 있습니다.여기서는 염색체 10번의 점유 상태가 나타나 있으며, rbp two 결합 영역이 수직선으로 표시되어 있습니다. 중간 패널에는 염색체 10번 상의 모든 rbp two 이소형 결합 영역이 표시되어 있고, 하단 패널에는 rbp two 대형 이소형 결합 영역이 표시되어 있습니다. 이 정보는 염색체 10번에서 RBP two 이소형들의 중첩 및 특이적 점유 상태에 대한 개요를 제공합니다.여기 rbp에 결합된 유전자들 중, 허위 발견율(false discovery rate) 또는 FDR로 보정하여 유의미하게 농축된 유전자 온톨로지(gene ontology) 또는 go 분자 기능 카테고리를 나타낸 히트맵이 제시되어 있습니다. 빨간색에 가까운 두 가지 색상은 통계적 유의성이 높음을 나타냅니다. 노란색은 통계적 유의성이 낮음을 나타내며, 회색은 통계적 유의성이 없음을 나타냅니다.농축 분석(Enrichment analysis)을 통해 R BP two 표적 유전자의 중첩 및 이소형 특이적 분자 기능을 확인할 수 있습니다. 앞서 이 과정에서 전사 인자 결합 부위를 식별하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차에서는 적절한 크기 범위와 수율의 DNA 단편을 생성하는 것이 중요합니다.이는 초음파 처리(SONICATION) 단계에서 저희의 가이드라인을 따름으로써 달성할 수 있습니다. 이것으로 모두 끝났습니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바라며, 시청해 주셔서 감사합니다.

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Biology

생물학

우리 베이지안 변경 포인트 (BCP)이 알고리즘은 숨겨진 마르코프 모델을 통해 모델링 변화 포인트의 최신 발전을 토대로와 염색질 immunoprecipitation 시퀀싱 (ChIPseq) 데이터 분석에 적용됩니다. BCP는 광범위하고 작은 반점이있는 두 데이터 유형에서 잘 수행하지만, 정확하게 확산 히스톤 농축의 강력한 재현 섬을 식별하는 탁월한.

다양한 ChIPseq 데이터 유형의 게놈 차원의 분석을위한 소설 베이지안 변경 - 포인트 알고리즘

이 비디오에서는 단백질 결합 염색질 단편의 선택적 면역침전을 통해 희소돌기아교세포 전구체 세포의 게놈 DNA의 특정 영역에서 단백질 결합 부위를 식별하는 염색질 면역침전 기술을 보여줍니다. 이 방법은 유전자 조절에 관여하는 전사 인자를 포함한 여러 조절 단백질의 상호 작용을 연구하는 데 도움이 됩니다.

게놈 DNA의 표적 단백질 결합 부위를 확인하기 위한 크로마틴 면역침전(chromatin immunoprecipitation)

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

프로토콜은 대규모 유전자형을 수행 Illumina 사 Infinium의 분석법을 사용하는 것이 기재되어있다. 이러한 분석은 안정적으로 사흘 만에 개인의 DNA 샘플의 수백에 걸쳐 수백만의 SNP 유전자형 수 있습니다. 일단 생성,이 유전자형이 다른 질병 또는 표현형의 다양한 연결을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

대규모 SNP 유전자형 응용 프로그램에 대한 Infinium 분석

이 비디오 문서는 두 개의 구성 요소 시스템 응답 레귤레이터 유전자 표적 및 결합 부위를 결정하기 위해 시험 관내 마이크로 어레이 기반의 방법을 설명한다.

세균에 대한 두 개의 구성 요소 규제 시스템을 유전자 표적을 확인하는 DNA 친화력 - 정제 칩 (DAP-칩) 방법

관심 있는 특정 게놈 영역과 관련된 분자의 식별은 이러한 영역의 기능 조절 메커니즘을 이해하는 데 필요합니다. 이 프로토콜은 특정 게놈 영역과 관련된 단백질 및 RNA를 식별하기 위해 엔지니어링된 DNA 결합 분자 매개 염색질 면역침전(enChIP)을 수행하는 절차를 설명합니다.

특정 게놈 지역과 enChIP으로 관련 분자의 식별의 분리

후 성적인 요소는 유전자 발현을 조절 하 고 B 세포 기능을 조절 하는 유전자 프로그램으로 작용할 수 있습니다. 결합 하 여 체 외에서 B 세포 자극, qRT-PCR, 및 높은 처리량 예측에 관한 시퀀스 및 mRNA 순서 접근, 우리 B 세포에서 miRNA 및 유전자 표현의 epigenetic 변조를 분석할 수 있습니다.

MicroRNAs 받 클래스 스위치 DNA 재조합 및 플라즈마 세포 차별화에 B 세포 유도에서 mRNAs의 게놈 넓은 분석의 HDAC 억제제 중재 변조

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바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

원고는 칩 기반 디지털 PCR 분석 결과를 신선한 냉동 정상에 드문 CDH1 사본 이체 (CDH1a) 및 위 암 환자에서 얻은 종양 조직 검출을 설명 합니다.

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우리는 3차원 염색질 상호 작용을 사용하여 게놈 전체 협회 연구 (GWAS)에 의해 확인된 비 코딩 이체의 기능적인 연루를 확인하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.

크로마틴 구성의 전산 분석을 사용하여 알츠하이머 병 변이체를 대상 유전자에 매핑

이 논문은 ChIP 액체 처리기 플랫폼을 사용하여 특정 히스톤 수정(H3K27ac)과 관련된 DNA 영역의 반자동 마이크로스케일드 ChIP-Seq 프로토콜을 설명하고 태그를 사용하여 라이브러리 준비를 수행합니다. 이 절차는 품질 및 수량 목적에 대한 제어 평가를 포함하고 다른 히스톤 수정 또는 전사 요인에 채택 될 수있다.

대규모 후생유전학 연구를 위한 반자동 ChIP-Seq 절차

학습하세요 ChIP-Seq를 사용하여 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 탈메틸화효소의 게놈 목표를 식별하는 방법을. 이 기법은 단백질-DNA 상호작용 연구와 후성유전학적 조절 메커니즘 이해에 활용됩니다.

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

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