이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 KDM 5, Jared 1, RBB 2의 히스톤 탈메틸화효소의 게놈 표적을 식별하는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 적절한 크기의 DNA 단편을 생산하기 위해 초음파 처리 된 가교 염색질을 준비함으로써 달성됩니다. RBB 2 결합 DNA 단편은 RBB 2 항체로 면역 침전됩니다.

다음으로, 회수된 게놈 DNA는 염기서열분석을 위해 PCR로 증폭됩니다. 마지막으로, Illumina 염기서열 분석된 짧은 판독은 인간 게놈에 고유하게 정렬되며, 가장 가까운 유전자에 유의한 피크가 식별되고 주석이 추가됩니다. rbbb 두 개의 표적 유전자를 확인하기 위해 Rbbb 두 개의 농축 영역의 게놈 전체 식별을 기반으로 Rrb B, 두 개의 표적 유전자와 관련된 분자 기능을 보여주는 결과를 얻습니다.

안녕하세요, 저는 Mike입니다. 그녀는 시카고에 있는 일리노이 대학의 생화학 및 분자 유전학과의 엘리자베스 벤치 박사 연구실에서 왔습니다. 그리고 저는 BARCEL Biomedical Research Park University PO P fea의 Dr.NGA가 이끄는 생물의학 유전체학 실험실의 일원입니다.

저는 다니엘 달입니다. 저는 윌리엄 리히터입니다. 우리 둘 다 자선 기술 연구소에 있습니다.

오늘은 염색질, 면역침전, 염기서열분석 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 피부과 의사의 결합 부위를 연구합니다. 시작하겠습니다.

이 절차를 시작하려면 약 10개의 세포에서 8번째 세포까지 성장합니다. 각 면역침전 또는 IP에 대해. 여기서, 미만성 골용해성 림프종(diffuse osteolytic lymphoma)이 있다.

U 9 37 세포는 포름 알데히드 용액에서 세포 성장 후 96 시간 동안 TPA로 monocytic 분화를 위해 사용 및 유도 1 %의 최종 농도로 매체에 직접 다음 플라스크를 짧게 소용돌이 치고 10 분 동안 실온에 앉아있게 합니다. 그런 다음 배지를 흡인하고 15ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 헹굽니다. 이 세척을 한 번 반복하십시오.

다음으로, 얼음 위의 각 플라스크에 6ml의 용해 완충액을 하나씩 추가합니다. 그런 다음 플라스크를 섭씨 4도에서 20분 동안 흔듭니다. 마지막으로 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확하고 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

이 시점에서 셀은 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다. 세포가 얼었다면 깎아내십시오. 해동되면 세포를 스핀 다운하고 스내트를 버립니다.

그런 다음 6ml의 용해 완충액 2에 세포를 재현탁시키고 실온에서 10분 동안 튜브를 부드럽게 흔듭니다. 원심분리를 반복하고 2.5ml의 lysis buffer 3에 세포를 재현탁합니다. 다음으로, Branson 450 sonier의 마이크로 팁을 50%에서 60% 진폭 사이로 설정하여 얼음물 비이커에 넣어 초음파 처리를 위해 현탁액을 준비합니다.

32번째 일정한 버스트를 위해 용액을 초음파 처리하고 얼음 위에서 식히십시오. 1분 동안 이 펄스를 10-15회 반복한 다음 튜브의 내용물을 위아래로 피펫으로 넣고 새 튜브로 옮깁니다. 용액을 계속 펄스하고 냉각하십시오.

초음파 처리 후 추가로 5회 더 10% Triton X 100을 용액 부피의 10분의 1에 첨가합니다. 그런 다음 용해물을 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮기고 염색질, 면역침전 또는 칩 전에 마이크로 원심분리기에서 파편을 회전시킵니다. 50마이크로리터의 세포 용해물을 입력 샘플로 저장합니다.

그런 다음 투명화된 세포 용해물을 서면 프로토콜에 설명된 대로 이전에 준비된 항체에 결합된 dyna beads와 결합했습니다. 50마이크로리터 입력 샘플과 함께 혼합물을 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 흔들어 놓습니다. 1ml의 세척 버퍼로 구슬을 씻으십시오.

그런 다음 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 수집하고 상층액을 제거합니다. 이 세척을 6-8회 반복합니다. 1ml의 TE와 50mlmolar 염화나트륨으로 최종 세척을 수행합니다.

원심분리 후 마이크로 원심분리기에서 비드를 회전시키고 잔류 TE 완충액을 흡입합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 elu 버퍼를 샘플에 추가합니다. 직후.

샘플을 섭씨 65도에서 10-15분 동안 배양합니다. 비드를 부유 상태로 유지하기 위해 2분마다 1.5ml 튜브 랙에 튜브를 긁습니다. 원심분리와 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 수집하고 SNAT를 A PCR 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 이전에 저장된 입력 샘플을 검색하고 용리 완충액 3개를 추가합니다. 마지막으로, IP와 입력 샘플을 섭씨 65도에서 밤새 열 순환기에 넣습니다. 다음 날 교차 결합을 역전시키려면 샘플에 TE 버퍼 한 부피를 추가합니다.

그런 다음 RNA A를 마이크로리터당 0.2마이크로그램의 최종 농도에 추가합니다. 열 순환기에서 샘플을 섭씨 37도에서 1-2시간 동안 배양합니다. 배양 후 proteinase K를 마이크로리터당 0.2마이크로그램의 최종 농도로 추가합니다.

그런 다음 섭씨 55도의 열 순환기에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, 1 부피의 페놀로 샘플을 한 번 추출합니다. 한 부피의 페닐 클로로포름 이소아밀 알코올로 샘플을 두 번째로 추출합니다.

마지막으로 한 부피의 클로로포름 이소아밀 알코올로 샘플을 한 번 더 추출합니다. 그런 다음 각 샘플에 30마이크로그램의 글리코겐을 첨가합니다. 또한 염화나트륨을 최종 농도 0.2몰로 추가하고 두 부피의 에탄올을 샘플에 추가합니다.

섭씨 영하 80도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 샘플을 회전시키고 스내팅을 디캔팅합니다. 펠릿을 500마이크로리터의 75% 에탄올로 세척한 다음 펠릿을 건조시키고 40마이크로리터의 물에 재현탁시킵니다.

SONICATION 절차에 의해 생성된 DNA 단편의 크기를 확인하려면 정제된 입력 샘플 5마이크로그램을 1.8% agro gel에 넣고 gel을 실행합니다. 초음파 처리 절차는 150 내지 350 염기쌍 범위의 단편을 생성해야 합니다. 그러나 단편이 이 범위에 속하지 않는 경우 게놈 DNA를 증폭하기 전에 버스트 수와 진폭을 변경하여 초음파 처리 절차를 조정해야 합니다.

서면 프로토콜에 설명된 대로 샘플의 크기, 농도 및 농축을 확인합니다. 게놈 DNA의 증폭을 시작하려면 34마이크로리터의 IP 샘플과 200나노그램의 입력 샘플을 얻습니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 Illumina 게놈 DNA 시료 전처리 키트를 사용하여 DNA 단편에 대한 어댑터의 tail 추가 및 ligation을 수행하고 수리합니다.

mini lut PCR purification kit를 사용하여 DNA를 정제한 다음 섭씨 50도로 예열된 완충액 EB에서 용리시킵니다. IP 및 입력 DNA 샘플에 각각 23 마이크로 리터 및 46 마이크로 리터를 사용하십시오. 어댑터와 함께 23 마이크로 리터의 DNA를 사용하여 PCR 반응을 일으키고, 25 마이크로 리터의 융합, 키트의 DNA 중합 효소를 만듭니다.

20 마이크로 몰 단독 PCR 1 마이크로 리터 및 20 마이크로 몰 1 마이크로 리터. 따라서 PCR 2는 PCR 증폭 후 서면 프로토콜에 설명된 대로 PCR 반응을 실행합니다. Qiagen mini loop PCR 정제 키트로 DNA를 정제합니다.

15마이크로리터의 버퍼 EB를 섭씨 50도로 예열하고 DNA를 희석하고 샘플 1-4개를 0.5마이크로리터로 희석한 다음 NanoDrop 판독을 수행하여 증폭된 산물을 정제합니다. HPLC 등급의 물을 사용하여 1.8% AGROS 젤을 준비하고 50ml의 AGROS 젤을 준비하고 AGROS가 녹은 후 TAE와 브로마이드를 추가합니다. 그런 다음 젤을 붓고 젤을 로드합니다.

입력 및 IP 샘플에 4마이크로리터의 로딩 버퍼를 추가한 후 120볼트에서 45분 동안 겔을 실행합니다. 실행 후 젤을 분석합니다. 150에서 350 염기쌍 사이의 단편이 생성된다는 것을 밝혀야 합니다.

그들은 길이가 50에서 250 염기쌍 사이의 게놈 DNA 단편을 나타냅니다. 그리고 어댑터는 150 내지 350 염기쌍 범위의 물질을 포함하는 겔 영역을 메스로 절제합니다. 약 120개의 염기쌍에서 실행되는 어댑터 어댑터 밴드를 절단하지 않도록 주의하십시오.

제조업체의 지침에 따라 카약 퀵 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 복구합니다. 열을 가하지 않고 빠르게 시료를 정확히 11마이크로리터까지 건조시킵니다. 1마이크로리터의 샘플을 제거하고 NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.

마지막으로, Illumina 게놈 분석기를 사용하여 농축된 유전자 산물을 식별하고 서면 프로토콜에 설명된 대로 결합 부위와 표적 유전자를 분석합니다. 식별된 농축 RB 결합 단백질 2 또는 RBP 2 결합 영역의 게놈 좌표는 염색체 현명한 형식으로 표시됩니다. 염색체에서 앙상블 유전자의 점유는 검은색 VAR로 시각화할 수 있습니다.

여기서 염색체 10 점유는 rbp, 두 개의 결합 영역이 수직선으로 표시됩니다. 중간 패널은 염색체 10의 모든 rbp 두 개의 동형 결합 영역을 보여주고 하단 패널은 rbp 두 개의 큰 동형 결합 영역을 보여줍니다. 이 정보는 염색체 10에서 RBP 두 동형의 겹침 및 특정 점유에 대한 개요를 제공합니다.

여기서 히트 맵은 잘못된 발견 비율 또는 FDR이 상당히 강화된 유전자 온톨로지 또는 rbp에 의해 결합된 유전자 중 분자 기능 범주로 표시된 상태로 표시됩니다. 빨간색으로 향하는 두 가지 색상은 통계적 유의성이 높음을 나타냅니다. 노란색은 통계적 유의성이 낮음을 나타내고 회색은 통계적 유의성이 없음을 나타냅니다.

농축 분석은 R BP 두 표적 유전자의 중첩 및 동형 특이적 분자 기능을 보여줍니다. 이 과정에서 전사 인자 결합 부위를 식별하는 방법을 보여 드렸습니다. 적절한 크기 범위와 수율의 DNA 단편을 생산하는 것이 중요합니다.

이는 SONICATION 단계에서 지침에 따라 달성할 수 있습니다. 그게 다야. 실험에 행운을 빌며 시청해 주셔서 감사합니다.