인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법

이 방법의 전반적인 목표는 인간 배아 줄기세포(ES 세포)로부터 생성된 내배엽 세포를 정제하는 것입니다. 이 방법은 내배엽 분화에 관한 줄기세포 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미분화 세포를 제거함으로써 순수한 내배엽 세포 집단을 얻을 수 있다는 점입니다.

절차를 시작하기 전, 6-웰 세포 배양 플레이트의 웰당 1 mL의 기저막 매트릭스를 코팅합니다. 실온에서 최소 30분 동안 유지하십시오. 그 다음, 인간 ES 세포를 수확하기 위해 멸균된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 80~90%까지 컨플루언시(confluent)에 도달한 인간 배아 줄기 세포 배양액의 배지를 흡입하여 제거합니다.

각 웰당 2 mL의 PBS로 세포를 세척합니다. 플레이트를 흔들어 주고 식염수를 흡입하여 죽은 세포와 파편을 제거합니다. 다음으로, 세포가 작은 클러스터로 뚜렷하게 분해될 때까지 37 °C, 5% CO2 조건에서 1 mL의 효소 제거 계대 배양 용액 시약으로 세포 클러스터를 조심스럽게 해리시킵니다.

약 7분 후에 웰에 DMMF12 배지 1 mL를 첨가합니다. 그리고 1 mL 피펫 팁으로 여러 번 파이펫팅하여 남아 있는 세포 응집체를 단일 세포 현탁액으로 분리합니다. 동일한 피펫을 사용하여 세포를 원심분리 튜브로 옮기고, 웰을 1 mL의 신선한 DMMF12 배지로 헹구어 세척액을 튜브에 모두 모읍니다.

세포를 원심 분리한 후, ROCK 억제제가 첨가된 ES 세포 배양액 5 mL에 펠렛을 재현탁합니다. 세포 수를 측정하고, 세포 사멸을 방지하기 위해 ROCK 억제제가 첨가된 배양액을 사용하여 basement membrane matrix가 코팅된 플레이트의 웰당 1.5-4 × 10⁵ 개의 세포를 분주합니다. 세포를 약 24시간 동안 배양합니다.

그런 다음 멸균된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 웰의 배지를 2 milliliters의 원시선 유도 배지로 교체합니다. 24시간 더 배양한 후, 배지를 내배엽 유도 배지로 교체하여 매일 배지를 갈아주며 48시간 동안 배양합니다. 배양 마지막 날, 세포를 수확하기 최소 1시간 전에 신선한 ROCK 억제제를 배양액에 추가합니다.

그 다음 멸균된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 웰에서 배지를 흡입하고, 방금 시연한 대로 효소 미포함 계대 배양 용액 시약을 사용하여 세포를 해리합니다. 단일 세포 현탁액이 만들어지면 세포 수를 측정하고 원심 분리합니다. 이 시점부터는 세포 사멸을 방지하기 위해 모든 배지와 버퍼에 ROCK 억제제가 포함되어 있는지 확인하십시오.

그렇지 않으면, 세포가 수축한 후 제대로 부착되지 않습니다. 1×10⁷개 세포당 ROCK 억제제가 보충된 100 µL의 PEB 버퍼에 펠릿을 다시 현탁하십시오. 그런 다음 세포에 CXCR4 APC 항체를 첨가하십시오.

튜브를 가볍게 튕겨 혼합합니다. 4 °C에서 15분 후, 1~2 mL의 PEB buffer로 세포를 세척하고 멸균된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 흡입하여 제거합니다. 1 × 10⁷ 세포당 80 µL의 PEB buffer로 펠렛을 재현탁하고, 세포에 20 µL의 anti-APC microbeads를 추가합니다.

샘플을 가볍게 튕겨 섞어줍니다. 그런 다음 세포를 4 °C에서 15분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 ROCK 억제제가 첨가된 PEB 버퍼 1~2 mL로 세포를 세척합니다.

그리고 펠렛을 500 µL의 신선한 PEB 버퍼 및 억제제에 다시 현탁합니다. 자성 비드 분리를 통해 CXCR4+ 세포를 분리하려면, 적절한 크기의 자석에 중간 크기의 자성 컬럼을 장착하고 500 µL의 PEB 버퍼 및 ROCK 억제제로 컬럼을 미리 헹굽니다. 세척액이 컬럼 상단에서 모두 빠져나가면, 자성 비드가 표지된 세포 현탁액 전체를 컬럼에 도포하고 통과액을 원추형 튜브에 수집합니다.

PEB 버퍼와 ROCK 억제제가 혼합된 용액 500 µL를 사용하여 컬럼을 3회 세척합니다. 그 후, 자석에서 컬럼을 분리하여 적절한 수집 튜브로 옮깁니다. 그리고 PEB 버퍼와 ROCK 억제제가 혼합된 용액 1 mL를 컬럼에 통과시켜 CXCR4+ 세포를 수집합니다.

선택적으로, 모든 통과 샘플을 각각 수집하고 각 샘플에서 20 microliter씩 분주하여 유세포 분석법으로 각 분주액 내 CXCR4+ 세포의 백분율을 결정할 수 있습니다. 이 절차를 첫 번째 통과액에 대해 반복하여 컬럼에 결합하지 않은 세포를 수집할 수 있습니다. 그 후, 분주된 모든 CXCR4+ 샘플을 하나로 모아 원심분리합니다.

마지막으로, ROCK inhibitor가 첨가된 내배엽 유도 배지 1 mL에 펠릿을 재현탁하고, 기저막 매트릭스로 코팅된 세포 배양 용기에 적절한 밀도로 세포를 분주합니다. 분화 전의 인간 ES 세포는 다능성 마커인 SOX2를 높은 수준으로 발현하는 반면, definitive endoderm 마커인 FOXA2는 검출되지 않습니다.

분화가 진행됨에 따라, ES 세포는 유전자 및 단백질 발현에서 급격한 변화를 겪습니다. 실제로 분화 배지에서 4일이 지나면, 기존 ES 세포의 상당수 핵 내에서 SOX17과 FOXA2가 균일하게 공동 발현되며, 이는 확정 내배엽(definitive endoderm)으로의 분화 결정의 특징입니다. 일부 세포는 분화 과정에 저항하여 두 마커 단백질 중 어느 것도 발현하지 않습니다.

실제로 이들은 다능성 마커인 SOX2 발현을 유지합니다. 이 대표적인 실험에서, 분화 3일 차에 수확한 ES 세포의 약 60%가 CXCR4를 발현했으며, 다능성 세포 및 기타 원치 않는 계통의 세포들을 자기 비드 정렬로 제거한 후 CXCR4의 순도는 85% 이상으로 농축되었습니다. 정제된 CXCR4+ 세포를 파종한 후에는 소수의 SOX2+ 세포만이 검출되었으며, 파종된 세포의 대부분은 FOXA2를 발현하였습니다.

숙련된 경우, 이 기술은 적절히 수행된다면 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에 면역 조직 화학 염색이나 QPCR과 같은 다른 분석을 수행하여 분화 과정에 대한 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 자기 비드 분리를 통해 내배엽 세포를 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.