Name: 인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 배우세요 인간 배아 줄기 세포에서 분화된 내배엽 세포를 자기 비드 분류법으로 정제하는 방법을. CXCR4+ 세포를 효율적으로 분리하여 순수한 세포 집단을 얻고 재생의학 및 발달생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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확실한 내배엽으로 인간의 ESC 1. 차별화 <ol><li> 37 ℃ 배양기에서 인간 배아 줄기 세포 (는 ESC)를 배양하고, 5 % CO 2. </li><li> 코트 기저막 매트릭스 1 ㎖와 새로운 6- 웰 세포 배양 접시에 RT에서 적어도 30 분 동안 배양 도자기 부화. 특정 자세한 내용은 각 제조업체의 지침을 켜십시오. </li><li> 배양 된 인간는 ESC (예 : 4X) 낮은 배율을 사용하여 현미경으로 80 % -90 %의 포화 상태에 도달했는지 확인합니다. 멸균 유리 파스퇴르 피펫으로 매체를 흡입하여 공동의 매체를 기음. 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액으로 한 번 세포를 씻으십시오. 이를 위해 부드럽게 각 웰에 2 ㎖의 PBS를 추가 플레이트를 흔들어 사균 및 세포 파편을 제거하는 용액을 빨아. </li><li> 세포 클러스터의 부드러운 해리에 대한 효소가없는 계대 솔루션 시약의 1 ML을 추가합니다. 37 ° C 형의 세포를 품어D 5 % CO 2 세포가 작은 클러스터로 중단의 명확한 징후를 표시 할 때까지. 주 : 배양 시간을 사용 시약에 따라 달라집니다. 자료 섹션에서 언급 된 효소가없는 계대 솔루션의 경우, 배양 시간은 약 7 분입니다. </li><li> 1 ml의 DMEM / F-12 배지를 추가로 pipetting에 의해 1 ML의 피펫 팁을 사용하여 아래 하나의 세포에 남아있는 세포 집합체을 방해. 표면으로부터 세포를 세척하고, 원심 분리 튜브에 세포를 전송하기 위해를 사용한다. 모든 셀을 검색하려면, DMEM / F-12 배지 1 ㎖ 잘 각각의 세척 및 원심 분리 튜브에 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> g X 300에서 5 분간 세포를 원심 분리기. 상등액을 흡인하고 10 μM의 Rho 키나아제 (ROCK) 억제제를 함유하는 5 ㎖의 ES 세포 배양 배지에서 세포를 재현 탁. </li><li> 혈구를 사용하여 현미경으로 세포를 세어 150,000 시드 - 사용 ES 세포주에 따라 6- 웰 당 또는 다른 플레이트 레이아웃 400,000 세포. 사용 막 다른37 ° C, 5 % CO 2에서 세포 사멸과 문화를 인큐베이터에서 세포를 방지하기 위해 매체를 포함하는 10 μM의 ROCK 저해제를 진짜야. </li><li> 약 24 시간 멸균 유리 파스퇴르 피펫으로 매체 대기음을 파종하고 원시적 인 행진 유도 배지 2 ㎖를 추가 한 후. 참고 :이 매체는 고급 RPMI-1640 배지에 1 % 글루타민, 0.2 % FCS, 5 μM CHIR-99021 50 NG / ㎖ 티빈의 최종 농도가 포함되어 있습니다. 일반적으로, 6 웰 플레이트에서 배양을위한 배지 2 ㎖를 사용합니다. </li><li> 48 시간 시딩 후, 유도 매체를 내배엽 할 수있는 매체를 교체합니다. 매일 매체 변화에 또 다른 48 시간이 매체에 세포를 배양. 참고 :이 매체는 고급 RPMI-1640 배지에 1 % 글루타민, 0.2 % FCS 50 NG / ㎖ 티빈이 포함되어 있습니다. 최종 내배엽을 향해 최선을 다하고 있습니다 세포 표면 마커 CXCR4를 표현한다. CXCR4의 염색 DE 결정 세포 수를 정량화하는데 사용될 수있다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. 유동 세포 계측법 분석을위한 CXCR4 + 확실한 내배엽 세포의 염색 <ol><li> 수확 전 마지막 24 시간 그러나 최소한 1 시간 동안 세포 배양 배지에 10 μM의 ROCK 억제제를 추가합니다. </li><li> 코트 즉, 기저막 행렬 재 파종에 사용되는 세포 배양웨어, 면역 형광 염색법에 대한 qPCR에 분석 또는 챔버 슬라이드 12 웰 플레이트. 실온에서 적어도 30 분 동안 판 또는 슬라이드를 품어. </li><li> 오염 및 / 또는 정렬을 위해 사용되는 분화 된 세포의 웰에서 멸균 유리 파스퇴르 피펫으로 흡인 매체. </li><li> 세포 클러스터의 부드러운 해리에 대한 효소가없는 계대 솔루션 시약의 1 ML을 추가합니다. 세포를 작은 클러스터로 중단 뚜렷한 표시까지 CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션하고 세포를 5 %. 주 : 배양 시간을 사용 시약에 따라 달라집니다. materi에 언급 된 효소가없는 계대 솔루션ALS 부는, 배양 시간은 약 7 분이다. </li><li> 1 ml의 DMEM / F-12 배지를 추가로 pipetting에 의해 1 ml의 팁을 사용하여 아래 하나의 세포로 세포 집합체 남아 방해. 표면으로부터 세포를 세척하고, 원심 분리 튜브에 세포를 전송하기 위해를 사용한다. 모든 셀을 검색하려면, / FCS 오 w DMEM / F-12 배지 1 ㎖ 잘 각각의 세척 및 원심 분리 튜브에 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 혈구를 사용하여 현미경으로 세포를 카운트. 6 잘 판의 세 우물에서 세포 분화의 삼일 후 10 ~ 15 × 10 6 세포에서 발생한다. g X 300에서 5 분간 세포를 원심 분리기. 참고 얻어지는 세포의 정확한 수는 사용 된 분화 다 능성 세포주에 의존 할 것이다. </li><li> 뜨는을 기음과 10 μM의 ROCK 저해제를 포함하는 PEB 버퍼에 세포를 재현 탁. 최대 10 7 세포에 대한 버퍼 100 μl를 사용합니다. staini의 날에 10 μM의 ROCK 저해제 추가NG. (PEB 버퍼 + RI 라 함) 모든 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 버퍼를 사용합니다. 참고 : PEB 버퍼가 0.5 % BSA와 PBS에서 2 mM의 EDTA가 포함되어 있습니다. 이상의 세포가 염색 할 경우, 이에 따라 상기 버퍼 볼륨을 조절한다. </li><li> 이 약 1:10 희석을 대표하는 100 ㎕의 10 7 세포 당 CXCR4-APC 항체의 10 μl를 추가합니다. 참고 : APC 결합 항체의 사용은 필수가 아닙니다. 대신 사용 마이크로 비드에 따라 치환 될 수있다. 이상의 세포가 염색 될 경우 그에 따라 항체 량을 조정한다. </li><li> 부드럽게 손가락으로 튜브를 틀지하여 혼합하고 15 분 동안 냉장고에 4 ° C에서 품어. 1-2 ml의 PEB 버퍼와 세포를 재현 탁. g X 300에서 5 분간 세포를 원심 분리기. </li><li> 멸균 유리 파스퇴르 피펫으로 뜨는을 대기음 10 7 세포 당 80 μL의 PEB에있는 세포 펠렛을 resuspend 20 μl를 방지 APC 마이크로 비드를 추가합니다. 노트: </s이상의 세포가 염색 할 경우 tron​​g&gt; 따라서, 마이크로 비드 볼륨을 조절. </li><li> 부드럽게 손가락으로 튜브를 틀지하여 혼합하고 15 분 동안 냉장고에 4 ° C에서 품어. 1-2 ml의 PEB 버퍼 + RI와 세포를 재현 탁. g X 300에서 5 분간 세포를 원심 분리기. 버퍼를 대기음. 500 μL의 PEB 버퍼 + RI에 재현 탁. </li></ol> CXCR4 + 세포의 3. 자기 분리 <ol><li> 제조 지침에 따라 자기장에 중간 크기의 자석 열을 놓습니다. 500 μL의 PEB 버퍼 + RI와 열을 미리 씻어. 열에 전체 세포 현탁액을 적용합니다. 컬럼에 결합되므로, 모든 셀을 통해 유동을 수집한다. 확인 CXCR4 + 세포의 최적의 검색을 위해 열을 방해하지합니다. </li><li> 칼럼 500 μL의 PEB 버퍼 + RI로 3 회 씻는다. 내지 제 유동을 수집 단계 3.1에서 수집 된 세포와 결합. 자기장에서 자기 열을 제거하고에 배치적절한 포집 관. 컬럼에 1 ML의 PEB 버퍼 + RI를 추가합니다. 세포가 단단히 열에 플런저를 눌러 용출합니다. </li><li> 선택 사항 : 개별적으로 샘플을 통해 모든 흐름을 수집하고 유동 세포 계측법 사용 CXCR4 + 세포의 수를 분석하는 20 ㎕를 각각 사용한다. 그들의 수는 모든 세척 단계로 감소한다. 참고 : 적어도 2 × 10 4 가능한, 게이트 세포가 신뢰할 수있는 결과를 계산해야한다. </li><li> 반복 단계 3.1에서 샘플을 통해 수집 된 흐름과 새 열을 사용하여 단계 3.2에서 샘플을 통해 제 1 유동와 3.1-3.3 단계. 하지 마십시오 이전 칼럼을 다시 사용합니다. 플런저 공기를 사용하여이를 차단하는 열로 가압된다. </li><li> 혈구를 사용하여 현미경으로 세포를 카운트. 6 × 106 세포로 분화 최대의 효율에 따라 초기 정렬 및 절차 107 세포를 사용하는 경우 두 번째 열을 사용하여 다른 1 × 106 세포 수있다. </리&gt; <li> 5 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기. 기음 뜨는 및 멸균 유리 파스퇴르 피펫와 추가로 10 μM의 ROCK 저해제와 단계 1.9에서 1 ml의 내배엽 유도 배지에서 세포를 재현 탁. </li><li> 혈구를 사용하여 현미경으로 세포를 카운트. 적절한 밀도로 세포를 시드 즉, ~ 12 웰 플레이트의 웰 당 4 × 10 5 세포 (응용 프로그램. 3.6 cm 2면) 또는 ~ 8 잘 챔버 슬라이드의 웰 당 1.5 × 10 5 세포. </li></ol> 4. 선택 사항 : 정제 된 결정적인 내배엽 인구의 분석 <ol><li> 면역 형광 염색법의 경우 약 24 시간 최종 내배엽 (DE) 및 / 또는 능성 마커 단백질 4 % 파라 포름 알데히드와 얼룩 시드 후 단계 3.7에서 정제 된 세포를 고정합니다. 참고 : 일반적으로 사용되는 DE 마커 FOXA2 및 SOX17을 포함, 일반적으로 사용되는 만능 마커는 OCT3 / 4, NANOG와 SOX2 6, 8을 포함한다. </li><li> FOR RT-qPCR에 분석, 직접 또는 24 시간 시딩 후 정제 된 세포를 수확 총-RNA 추출하고 추출 된 총-RNA 샘플에서의 cDNA를 전사 역. DE 및 다 능성 마커 유전자 (6), (8)의 발현을 분석하기 위해 RT-qPCR의 반응 (삼중) 당 10 ng의 주형으로서 cDNA를 사용합니다. 참고 : 일반적으로 사용되는 마커 유전자는 단계 4.1에 언급되어있다. 사이클 조건은 곡선 분석을 용융 다음 95 ℃에서 5 분, 95 ° C에서 15 초 40주기와 60 ° C에서 1 분입니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

현재 사용 분화 프로토콜은 거의 100 % 차별화 된 세포에서 발생합니다. 아직 해결해야 할 몇 가지 이유로 세포 분화 과정 레지스트. 사용 된 분화 프로토콜의 효율 및 ESC의 성향에 따라 잔류 다 능성 세포의 소정 수는 일반적으로, 심지어 최종 내배엽으로 분화 후에 관찰되는 광고. 이러한 잔류 세포는 transcriptomics, 단백질 체학 및 miRNA의 발현 분석 등 다운 스트림 분화 또는 추가 분석을 방해 할 수 있습니다. 잔여 만능 세포 또는 기타 원치 않는 계보는 차별화 목표를 방해 할 수 있습니다 분비 효과를 나타낼 수있다. 따라서, 이들 세포의 제거 재현성 향상 될 수있다. CXCR4 내배엽 분화 후 세포를 발현 + 정제 이러한 집단을 풍부하게하고 분화 과정 저항 세포를 제거하는데 사용될 수있다.DE 표면 마커 단백질 CXCR4는 내배엽 세포의 특정의 정제에 사용될 수있다. 손 MACS 정제 프로토콜은 이하에서 2 시간 내에 완료 될 수 있고, 고가의 실험실...

배아 줄기 세포 (는 ESC)와 같은 다 능성 줄기 세포는 신체의 거의 모든 세포 유형으로 분화 할 수있는 능력을 가지고있다. 따라서, 생체 외 분화 프로토콜은 심근 1 간세포 2, 3 베타 세포, 폐 상피 4 또는 5 신경 세포 등 다양한 성인 세포 유형을 생성하기 위해 사용될 수있다. 이는 ESC에게 다양한 퇴행성 질환 (3)의 잠재적 인 치료를위한 유용한 도구를 만든다. 폐, 간, 췌장의 성인 조직으로는 ESC의 체외 분화는 최종 내배엽 (DE) 6 연상 세포로 의사 낭 배기가 필요합니다. 상기 체세포 유형 하류쪽으로 분화 상당히 비효율적이기 때문에, 최적의 내배엽 분화는 7 레이트 제한으로 간주된다. 내배엽 계통을 향해 최선을 다하고 있습니다 세포는 차를 받다이들 유전자 발현 프로파일 racteristic 변한다. 능성 마스터 조절 유전자 다운 규제 예 9. CXCR4가 된 Smad2 의해 transactivated 것으로 알려져 FOXA2, SOX17, HNF1B, GATA 가족 구성원과 CXCR4 높은 6 상향 조절되어 표면 수용체 (8)과 같은 다른 전사 인자의 발현 반면 / 3, 인해 프로모터 영역 (10)의 특정 결합 부위에 결절 / TGF-β 신호 및 SOX17의 하류. 따라서 리포트 6, 8, 11 ~ 13의 번호를 사용 매우 적합한 마커이다. 이러한 발현 변화는 ESC는 먼저 기본 연속 형 세포 집단의 특성을 획득하고이어서 배아 내배엽 층 (6)에 투입하는 의사 낭배 이벤트를 반영한다. 몇 세포가 분화 과정에 저항 또는 다른 의도하지 않은 계통 (14)으로 구별 할 수있다 그러나, 분화 프로토콜은 거의 100 % 효율이 없습니다. 이러한 세포 부정적인 influe있다후부 더 차별화. 또한, 잔여 미분화 세포는 나중에 이식 실험에 대한 큰 위험을 항구 및 기형 종 15-17을 야기 할 수 있습니다. 초기에 표면 마커 CXCR4 드 (18)를 향해 최선을 다하고 있습니다 세포의 정제에 사용할 수있는 이러한 원치 않는 세포를 제거합니다. 여기서는 DE 분화 배양에서 CXCR4 + 세포의 양성 선별을위한 방법을 설명한다. 이를 위해 표면 마커 CXCR4 후 다시 자성 마이크로 비드에 결합 된 항체에 의해 결합된다. FACS 정렬 동안 가혹한 조건 달리 자기 표지 DE 같은 세포를 쉽게 부드러운 정제 방법을 사용하여 벤치 탑 형태로 정제 될 수있다. 이 프로토콜은 DE 분화 과정 저항 세포 집단을 제거하기위한 간단한 방법을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Hues8 인간 배아 줄기 세포주</td><td>하버드 줄기 세포 및 재생 생물학</td><td></td>과 내<td>배엽 생성에 적합한 세포주</td></tr><tr><td>Hes3 인간 배아 줄기 세포주</td><td>ES Cell International</td><td></td><td>내배엽 생성에 적합하고 견고한 세포주</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td>ESC 배양 배지</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1860</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>CD184 (CXCR4)-APC, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-357</td><td></td></tr><tr><td>anti-APC MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>자기장</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>ROCK 억제제</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>Enzyme-free 계대 태징 용액, 대안 : Trypsin / EDTA</td></tr><tr><td>Matrigel *</td> <td>Corning</td><td>354277</td><td>기저막 매트릭스 * -80 °C에서 분취량으로 분해 및 저장; C는 공급업체 설명서에 설명되어 있습니다. 사용 시 얼음에서 해동하고 25ml의 얼음처럼 차가운 녹아웃 DMEM/F-12. 에 희석합니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 1ml를 넣고 실온에서 45분 동안 배양합니다. 마트리겔을 제거하고 즉시 사용하십시오. </td></tr><tr><td>MS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 TaqMan 분석</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00751752_s1</td><td></td></tr><tr><td>Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a</td><td>생명 과학 인간</td><td></td><td></td></tr><tr><td>G6PD REV cga tga TGC ggt TCC AGC CTA T </td><td>생명</td><td></td><td></td></tr><tr>과학 안티<td>SOX2</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>안티 FOXA2</td><td>머크밀리포어</td><td>07-633</td><td></td></tr><tr><td>안티 SOX17</td><td>R & D 시스템</td><td>AF1924</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

배아 줄기 세포 (는 ESC)와 같은 다 능성 줄기 세포의 분화 능력은 세포 대체 요법에 대한 잠재적 인 치료 적 적용을 허용한다. 말단 분화 세포 유형. 각종 퇴행성 질환의 치료에 사용되는 폐, 간 및 췌장 조직을 향해 이러한 세포의 체외 분화는 첫 단계로 최종 내배엽 세포의 생성을 필요로 할 수있다. 이 단계는 속도 제한 인슐린 - 생산 베타 세포, 간세포 등 내배엽 유래의 세포 유형으로 말단 성숙 세포 유형 향해 더 분화된다. 내배엽 계통을 향해 최선을 다하고 있습니다 세포는 매우 같은 FOXA2, SOX17, HNF1B, GATA 가족의 구성원, 표면 수용체 CXCR4 같은 전사 인자의 군중을 표현한다. 그러나, 분화 프로토콜은 거의 100 % 효율이 없습니다. 여기서는 분화 후 CXCR4 + 세포군의 정제 방법을 서술자기 마이크로 비드를 사용하여 DE에. 이 정제는 또한 원치 않는 계통의 세포를 제거합니다. 부드러운 정제 방법은 신속하고 신뢰성 및 하류 어플리케이션 및 분화를 개선하는 데 사용될 수있다.

분화시 는 ESC 유전자와 단백질 발현의 급격한 변화를 겪는다. 1 성공적인 내배엽 분화를 확인하는 데 사용할 수있는 일반적인 마커 유전자를 보여주고있다. 유전자 발현 분석을위한 주요 목표 GSC, FOXA2 및 SOX17있다. 미분화는 ESC에 비해 상대적 유전자 발현 분석에서 특히 FOXA2 및 SOX17는&gt; 000 배 증가된다. GSC 이미 프리미티브 킬 형성시 초기 24 시간 이내 나타낸다 하지만 그럼에도 불구하고 하루 사에&gt; 100 배 유도된다. 이러한 유전자의 발현은 결과적 CXCR4 표면 마커 6을 사용 정렬시 증가된다. 이들 유전자의 발현은 여전히 사일 후 검출하지만 이러한 OCT3 / 4 (POU5F1) 및 NA...

여기서는 하류 어플리케이션 및 상기 분화의 개선을위한 결정적인 내배엽으로 분화 노력하고 인간 배아 줄기 세포의 정제를위한 방법을 설명한다.

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

이 방법의 전반적인 목표는 인간 배아 줄기세포(ES 세포)로부터 생성된 내배엽 세포를 정제하는 것입니다. 이 방법은 내배엽 분화에 관한 줄기세포 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미분화 세포를 제거함으로써 순수한 내배엽 세포 집단을 얻을 수 있다는 점입니다.절차를 시작하기 전, 6-웰 세포 배양 플레이트의 웰당 1 mL의 기저막 매트릭스를 코팅합니다. 실온에서 최소 30분 동안 유지하십시오. 그 다음, 인간 ES 세포를 수확하기 위해 멸균된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 80~90%까지 컨플루언시(confluent)에 도달한 인간 배아 줄기 세포 배양액의 배지를 흡입하여 제거합니다.각 웰당 2 mL의 PBS로 세포를 세척합니다. 플레이트를 흔들어 주고 식염수를 흡입하여 죽은 세포와 파편을 제거합니다. 다음으로, 세포가 작은 클러스터로 뚜렷하게 분해될 때까지 37 °C, 5% CO2 조건에서 1 mL의 효소 제거 계대 배양 용액 시약으로 세포 클러스터를 조심스럽게 해리시킵니다.약 7분 후에 웰에 DMMF12 배지 1 mL를 첨가합니다. 그리고 1 mL 피펫 팁으로 여러 번 파이펫팅하여 남아 있는 세포 응집체를 단일 세포 현탁액으로 분리합니다. 동일한 피펫을 사용하여 세포를 원심분리 튜브로 옮기고, 웰을 1 mL의 신선한 DMMF12 배지로 헹구어 세척액을 튜브에 모두 모읍니다.세포를 원심 분리한 후, ROCK 억제제가 첨가된 ES 세포 배양액 5 mL에 펠렛을 재현탁합니다. 세포 수를 측정하고, 세포 사멸을 방지하기 위해 ROCK 억제제가 첨가된 배양액을 사용하여 basement membrane matrix가 코팅된 플레이트의 웰당 1.5-4 × 10⁵ 개의 세포를 분주합니다. 세포를 약 24시간 동안 배양합니다.그런 다음 멸균된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 웰의 배지를 2 milliliters의 원시선 유도 배지로 교체합니다. 24시간 더 배양한 후, 배지를 내배엽 유도 배지로 교체하여 매일 배지를 갈아주며 48시간 동안 배양합니다. 배양 마지막 날, 세포를 수확하기 최소 1시간 전에 신선한 ROCK 억제제를 배양액에 추가합니다.그 다음 멸균된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 웰에서 배지를 흡입하고, 방금 시연한 대로 효소 미포함 계대 배양 용액 시약을 사용하여 세포를 해리합니다. 단일 세포 현탁액이 만들어지면 세포 수를 측정하고 원심 분리합니다. 이 시점부터는 세포 사멸을 방지하기 위해 모든 배지와 버퍼에 ROCK 억제제가 포함되어 있는지 확인하십시오.그렇지 않으면, 세포가 수축한 후 제대로 부착되지 않습니다. 1×10⁷개 세포당 ROCK 억제제가 보충된 100 µL의 PEB 버퍼에 펠릿을 다시 현탁하십시오. 그런 다음 세포에 CXCR4 APC 항체를 첨가하십시오.튜브를 가볍게 튕겨 혼합합니다. 4 °C에서 15분 후, 1~2 mL의 PEB buffer로 세포를 세척하고 멸균된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 흡입하여 제거합니다. 1 × 10⁷ 세포당 80 µL의 PEB buffer로 펠렛을 재현탁하고, 세포에 20 µL의 anti-APC microbeads를 추가합니다.샘플을 가볍게 튕겨 섞어줍니다. 그런 다음 세포를 4 °C에서 15분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 ROCK 억제제가 첨가된 PEB 버퍼 1~2 mL로 세포를 세척합니다.그리고 펠렛을 500 µL의 신선한 PEB 버퍼 및 억제제에 다시 현탁합니다. 자성 비드 분리를 통해 CXCR4+ 세포를 분리하려면, 적절한 크기의 자석에 중간 크기의 자성 컬럼을 장착하고 500 µL의 PEB 버퍼 및 ROCK 억제제로 컬럼을 미리 헹굽니다. 세척액이 컬럼 상단에서 모두 빠져나가면, 자성 비드가 표지된 세포 현탁액 전체를 컬럼에 도포하고 통과액을 원추형 튜브에 수집합니다.PEB 버퍼와 ROCK 억제제가 혼합된 용액 500 µL를 사용하여 컬럼을 3회 세척합니다. 그 후, 자석에서 컬럼을 분리하여 적절한 수집 튜브로 옮깁니다. 그리고 PEB 버퍼와 ROCK 억제제가 혼합된 용액 1 mL를 컬럼에 통과시켜 CXCR4+ 세포를 수집합니다.선택적으로, 모든 통과 샘플을 각각 수집하고 각 샘플에서 20 microliter씩 분주하여 유세포 분석법으로 각 분주액 내 CXCR4+ 세포의 백분율을 결정할 수 있습니다. 이 절차를 첫 번째 통과액에 대해 반복하여 컬럼에 결합하지 않은 세포를 수집할 수 있습니다. 그 후, 분주된 모든 CXCR4+ 샘플을 하나로 모아 원심분리합니다.마지막으로, ROCK inhibitor가 첨가된 내배엽 유도 배지 1 mL에 펠릿을 재현탁하고, 기저막 매트릭스로 코팅된 세포 배양 용기에 적절한 밀도로 세포를 분주합니다. 분화 전의 인간 ES 세포는 다능성 마커인 SOX2를 높은 수준으로 발현하는 반면, definitive endoderm 마커인 FOXA2는 검출되지 않습니다.분화가 진행됨에 따라, ES 세포는 유전자 및 단백질 발현에서 급격한 변화를 겪습니다. 실제로 분화 배지에서 4일이 지나면, 기존 ES 세포의 상당수 핵 내에서 SOX17과 FOXA2가 균일하게 공동 발현되며, 이는 확정 내배엽(definitive endoderm)으로의 분화 결정의 특징입니다. 일부 세포는 분화 과정에 저항하여 두 마커 단백질 중 어느 것도 발현하지 않습니다.실제로 이들은 다능성 마커인 SOX2 발현을 유지합니다. 이 대표적인 실험에서, 분화 3일 차에 수확한 ES 세포의 약 60%가 CXCR4를 발현했으며, 다능성 세포 및 기타 원치 않는 계통의 세포들을 자기 비드 정렬로 제거한 후 CXCR4의 순도는 85% 이상으로 농축되었습니다. 정제된 CXCR4+ 세포를 파종한 후에는 소수의 SOX2+ 세포만이 검출되었으며, 파종된 세포의 대부분은 FOXA2를 발현하였습니다.숙련된 경우, 이 기술은 적절히 수행된다면 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에 면역 조직 화학 염색이나 QPCR과 같은 다른 분석을 수행하여 분화 과정에 대한 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 자기 비드 분리를 통해 내배엽 세포를 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

a-quick-efficient-method-for-purification-endoderm-cells-generated

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

자기 갱신과 신체의 모든 세포 유형으로 차별화하는 인간 배아 줄기 세포의 능력은 그들이 모두 의료 어플 리케이션을위한 개발과 질병의 근본적인 질문을 해결하기위한 연구 도구로 큰 약속을 개최하는 것이 좋습니다. 여기서 우리는 내부 세포 질량 immunosurgical 절연에 의해 배아에서 인간 배아 줄기 세포의 유도에 대한 간결한, 단계별 절차를 제공합니다.

Immunosurgery에 의해 인간 배아 줄기 세포의 유도

이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

전환 문화에 피더 - 무료 조건에 지속적인 노력에도 불구하고, 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 유도와 문화 마우스 배아 피더 (MEFs)와 공동 문화에 달려 남아 있습니다. 여기, 우리는 신속하게 이전 실험에 hESC 문화에서 피더를 제거 소설 방법을 보여줍니다.

고밀도의 인간 배아 줄기 세포 문화의 급속한 섬유 아세포 제거

당사는 양성 선택을 이용하여 살아있는 인간 배아 줄기세포(hESC)의 식별 및 농축을 위해 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 세포 표면 항원의 결합된 검출을 위한 단일클론 항체 TG30(CD9) 및 GCTM-2의 사용을 기술하고 또한 혼합세포 집단으로부터 hESC를 퍼지기 위한 음성 선택의 사용을 설명한다.

단일 클론 항체 TG30 및 GCTM-2를 사용하여 세포 표면 항원 검출에 의한 인간 배아 줄기 세포의 농축 및 정화

이 프로토콜은 효율적으로기도에게 상피 세포를 성숙 마우스 배아 줄기 세포 유래 최종 내배엽 지시합니다. 분화 기술은 정의 된 무 혈청 배양 환경에서, 폐 계통 사양을 직접 3 차원 decellularized 폐 지지체를 사용한다.

Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 차별화 별개의 조직 패턴으로 자기 조직하는 고유 능력을 가지고; 이 공간 환경 그라데이션의 표현을 필요로하지만. 우리 hPSC 분화 패턴을 제어하기위한 생화학 적 및 기계적 그라디언트를 생성하는 간단하고 강력한 방법으로서 공판 미세 패턴을 제시한다.

차별화 운명의 공간 조직을 프로빙에 대한 인간 다 능성 줄기 세포의 스텐실 미세화

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

이 원고는 hESC 분화 시 활성A및 CHIR99021을 최종 엔도덤(DE)으로 분화하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 기능성 간세포와 같은 세포(HLC)로 분화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

인간 배아 줄기 세포(hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)의 효소적 또는 기계적 패시징과 관련된 한계를 피하기 위해 EDTA 매개 탈유착을 사용하여 인간 포피 섬유아세포의 피더 세포층에 유지되는 hESC 또는 hiPSC 콜로니를 수확하기 위한 빠르고 효과적이며 비용 효율적인 고수율 방법을 확립했습니다.

에틸렌디아민테트라아세트산 매개 탈접착에 의한 공급세포에서 인간 만능 줄기세포의 신속하고 비용 효율적이며 효소 없는 패스페이징

본 프로토콜은 3D 및 2D 배양 조건 모두에서 인간 확장 전위 줄기 세포 (hEPSC)로부터 경미한 세포 독성을 갖는 CD3- / CD45 + CD56 + 세포를 구별하는 방법을 보여줍니다. 이를 통해 복잡한 미세 환경을 파괴하지 않고 일상적인 표현형 검증이 가능합니다.

인간 확장 잠재적 줄기 세포로부터 자연 살해 세포 생성

이 프로토콜은 빠르고 재현 가능한 내배엽 간 오가노이드(eHEPO)의 생성을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 eHEPO를 2주 이내에 생산할 수 있으며 차별화와 기능을 잃지 않고 장기(1년 이상)로 확장할 수 있습니다.

기능성 내배엽 간 오가노이드(endodermal hepatic organoids)의 생성

배우세요 인간 배아 줄기 세포에서 분화된 내배엽 세포를 자기 비드 분류법으로 정제하는 방법을. CXCR4+ 세포를 효율적으로 분리하여 순수한 세포 집단을 얻고 재생의학 및 발달생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법

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