인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법

이 방법의 전반적인 목표는 인간 배아 줄기 세포 또는 ES 세포에서 생성된 내배엽 세포를 정제하는 것입니다. 이 방법은 배엽 분화에 대한 줄기 세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미분화 세포를 제거한 후 순수한 내배엽 세포 집단을 얻을 수 있다는 것입니다.

절차를 시작하기 전에 6개의 웰 세포 배양 플레이트를 웰당 1ml의 기저막 매트릭스로 코팅합니다. 실온에서 최소 30분 동안. 그런 다음 인간 ES 세포를 수확하기 위해 멸균 유리 Pasture 피펫으로 80-90% confluent 인간 배아 줄기 세포 배양액에서 배지를 흡인합니다.

그리고 웰 당 2 밀리리터의 PBS로 세포를 씻으십시오. 플레이트를 흔들고 식염수를 흡인하여 죽은 세포와 파편을 제거합니다. 다음으로, 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 농도로 하여 1ml의 효소가 없는 계류 용액 시약으로 세포군집을 더 작은 군집으로 분열시키는 명확한 징후를 보일 때까지 세포 클러스터를 부드럽게 해리합니다.

약 7분 후 1ml의 DMMF12 배지를 웰에 추가합니다. 그리고 1밀리리터 피펫 팁으로 몇 차례 위아래로 피펫을 사용하여 나머지 세포 응집체를 단일 세포 현탁액으로 분리합니다. 동일한 피펫을 사용하여 세포를 원심분리 튜브로 옮기고 1ml의 새 DMMF12 배지로 웰을 헹구고 세척액을 튜브에 모읍니다.

세포를 회전시킨 후 ROCK 억제제가 보충된 5ml의 ES 세포 배양 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 세포사멸을 방지하기 위해 ROCK 억제제가 보충된 배양 배지의 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에서 웰당 세포와 씨를 1.5:4 곱하여 5번째 세포까지 계수합니다. 약 24시간 동안 세포를 배양합니다.

그런 다음 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 웰의 배지를 2ml의 원시 줄무늬 유도 배지로 교체합니다. 24시간 더 배양한 후 배지를 내배엽 유도 배지로 교체하여 매일 배지를 교체하고 48시간 동안 배양합니다. 배양 마지막 날과 세포를 수확하기 최소 1시간 전에 배양 배지에 새로운 ROCK 억제제를 첨가합니다.

그런 다음 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 웰에서 배지를 흡인하고 방금 시연한 것처럼 효소가 없는 계류 요법 용액 시약으로 세포를 해리합니다. single-cell suspension이 달성되면 세포를 계수하고 원심분리합니다. 이 시점부터 모든 배지 및 버퍼에 ROCK 억제제가 포함되어 있어 세포가 사멸하는 것을 방지해야 합니다.

그렇지 않으면 후퇴 후 제대로 부착되지 않습니다. 펠릿을 100마이크로리터의 PEB 완충액에 다시 현탁시키고, 1배당 ROCK 억제제를 10배에서 7번째 세포로 보충합니다. 그런 다음 CXCR4 APC 항체를 세포에 추가합니다.

튜브를 부드럽게 튕겨 섞습니다. 섭씨 4도에서 15분 후 1-2ml의 PEB 완충액으로 세포를 세척하고 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 흡인합니다. 펠릿을 7번째 세포에 1 곱하기 10당 80마이크로리터의 PEB 버퍼에 다시 현탁시키고 세포에 20마이크로리터의 anti-APC 마이크로비드를 추가합니다.

샘플을 부드럽게 튕기면서 섞습니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 ROCK 억제제가 보충된 1-2ml의 PEB 완충액으로 세포를 세척합니다.

그리고 펠릿을 500마이크로리터의 새로운 PEB 완충액과 억제제에 다시 현탁시킵니다. 마그네틱 비드 분리로 CXCR4+셀을 분리하려면 중간 크기의 마그네틱 컬럼을 적절한 크기의 자석에 로드하고 500마이크로리터 PEB 버퍼와 ROCK 억제제로 컬럼을 사전 헹굽니다. 컬럼 상단에서 세척액이 모두 배출되면 cell volume이라고 표시된 전체 마그네틱 비드를 컬럼에 적용하여 원뿔형 튜브에 흐름을 수집합니다.

500마이크로리터의 PEB 완충액과 ROCK 억제제를 3회 도포하여 컬럼을 세척합니다. 그런 다음 자석에서 컬럼을 적절한 수집 튜브로 옮깁니다. 그리고 컬럼을 통해 PEB 완충액과 ROCK 억제제 1ml를 주입하여 CXCR4+세포를 수집합니다.

선택적으로, 모든 유류 샘플은 개별적으로 수집될 수 있으며 각 샘플에서 20 마이크로리터 분취액을 사용하여 유세포 분석을 통해 각 샘플에서 CXCR4+ 세포의 백분율을 측정할 수 있습니다. 이 절차는 컬럼에 결합하지 않은 세포를 수집하기 위해 첫 번째 플로우 스루와 함께 반복할 수 있습니다. 그런 다음 allouted CXCR4+samples를 모두 풀링하고 원심분리합니다.

마지막으로, ROCK 억제제가 보충된 1ml의 내배엽 유도 배지에 펠릿을 다시 현탁시키고 기저막 매트릭스 코팅된 세포 배양 용기에 적절한 밀도로 세포를 시딩합니다. 분화 전에 인간 ES 세포는 높은 수준의 다능성 마커 SOX2를 발현합니다. 반면, 최종 내배엽 마커인 FOXA2는 검출되지 않습니다.

분화 시 ES 세포는 유전자와 단백질 발현에 급격한 변화를 겪습니다. 실제로, 분화 배지에서 4일 후, SOX17 및 FOXA2는 많은 이전 ES 세포의 핵 내에서 균일하게 동시 발현되며, 이는 결정적인 내배엽 헌신의 특징입니다. 일부 세포는 분화 과정에 저항하여 두 마커 단백질 중 어느 것도 발현하지 않습니다.

그리고 실제로, 다능성 마커 SOX2 발현을 유지합니다. 이 대표적인 실험에서, 분화 3일차에 수확된 ES 세포의 거의 60%가 CXCR4를 발현했으며, 그 순도는 만능 및 기타 원치 않는 계통 세포의 자기 비드 분류 후 85% 이상으로 농축되었습니다. 정제된 CXCR4+세포를 파종한 후 소수의 SOX2+세포만 검출되며 대부분의 파종된 세포는 FOXA2를 발현합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 면역 조직화학 또는 QPCR과 같은 다른 검사를 수행하여 분화 과정에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 마그네틱 비드 분류를 통해 내배엽 세포를 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.