Name: S. cerevisiae 에 단백질 기반 상속에 대 한 높은 처리량 검열 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 탐색하세요 S. cerevisiae에서 단백질 기반 상속을 유도하는 고처리량 선별법을 통해 지속적인 표현형 기억을 일으키는 단백질을 식별하는 방법을. 이 기법은 프리온 생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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우리가 그들의 도움으로 그들의 사려깊은 의견에 대 한 검토자가이 문서에서 사용 되는 분석 실험 개발에 대 한 Sohini Chakrabortee, 산드라 존스, 데이비드 가르시아, Bhupinder Bhullar, 아멜리아 장, 리처드 그녀와 Susan Lindquist 감사 합니다.

<ol><li>Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions%2C+protein+homeostasis%2C+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity.</a> Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).</li>
<li>Byers, J. S., Jarosz, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pernicious+pathogens+or+expedient+elements+of+inheritance%3A+the+significance+of+yeast+prions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions.</a> PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).</li>
<li>Jarosz, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-kingdom+chemical+communication+drives+a+heritable%2C+mutually+beneficial+prion-based+transformation+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism.</a> Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).</li>
<li>True, H. L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion+provides+a+mechanism+for+genetic+variation+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity.</a> Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146 (3), 448-461 (2011).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+polymerization+underlies+signal+transduction+in+antiviral+immune+defense+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation.</a> Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).</li>
<li>Majumdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+amyloid-like+oligomers+of+Drosophila+Orb2+in+the+persistence+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory.</a> Cell. 148 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Khan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+Oligomerization+Transforms+Drosophila+Orb2+from+a+Translation+Repressor+to+an+Activator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator.</a> Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).</li>
<li>Fioriti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Persistence+of+Hippocampal-Based+Memory+Requires+Protein+Synthesis+Mediated+by+the+Prion-like+Protein+CPEB3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3.</a> Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+affect+the+appearance+of+other+prions%3A+the+story+of+%5BPIN%28%2B%29%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)].</a> Cell. 106 (2), 171-182 (2001).</li>
<li>Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+identifies+prions+and+illuminates+sequence+features+of+prionogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins.</a> Cell. 137 (1), 146-158 (2009).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+chaperone+protein+Hsp104+in+propagation+of+the+yeast+prion-like+factor+%5Bpsi%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+].</a> Science. 268 (5212), 880-884 (1995).</li>
<li>Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Support+for+the+prion+hypothesis+for+inheritance+of+a+phenotypic+trait+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast.</a> Science. 273 (5275), 622-626 (1996).</li>
<li>Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BURE3%5D+as+an+altered+URE2+protein%3A+evidence+for+a+prion+analog+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">[URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 264 (5158), 566-569 (1994).</li>
<li>Sondheimer, N., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rnq1%3A+an+epigenetic+modifier+of+protein+function+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast.</a> Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).</li>
<li>Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amyloid-forming+peptide+from+the+yeast+prion+Sup35+reveals+a+dehydrated+beta-sheet+structure+for+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).</li>
<li>Glover, J. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9182769">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li>
<li>King, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-inducing+domain+2-114+of+yeast+Sup35+protein+transforms+in+vitro+into+amyloid-like+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104+catalyzes+formation+and+elimination+of+self-replicating+Sup35+prion+conformers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers.</a> Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).</li>
<li>Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+the+yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+by+guanidine+hydrochloride+is+the+result+of+Hsp104+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation.</a> Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).</li>
<li>Caudron, F., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+super-assembly+of+Whi3+encodes+memory+of+deceptive+encounters+by+single+cells+during+yeast+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship.</a> Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).</li>
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<li>Roberts, B. T., Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+activity%3A+a+prion+that+propagates+by+covalent+autoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation.</a> Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistability+in+the+lactose+utilization+network+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli.</a> Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

첫 번째 효 모 prions는 그들의 특이 한 고기 및 상속의 복잡 한 패턴에 의해 확인 되었다. 이러한 prions의 특성 다음 알고리즘 및 계산 도구 추가 프리온 단백질에 대 한 화면을 사용 했다. 여기서 설명 하는 방법을 반대로 실험 이며 지속적인 변화는 안정 상태 인코딩된 단백질 구조에서 만들 과도 overexpression에 의존. 그러나, "시드" 어떤 주어진된 단백질에 대 한 overexpression에 의해 프리온 어셈블리의 효율성 매우 낮은 경우에, 그 단백질이 유형의 overexpression 화면에서 거짓으로 지속적으로 나타날 것입니다. 이 문제를 해결 하려면 같은 한 수정 단백질 overexpression 미래에 대 한 2-미크론 플라스 미드를 사용 하 여 실험 것입니다. 마지막으로, 각 유발된 프리온에는 그것의 자신의 독특한 성장 고기 고 것입니다 하지 될 모든 조건에서 분석. 따라서, 다른 조건과 테스트 복용량 수 안타의 수를 제한 합니다.
중요 한 것은...

생물 학적 시스템 자주 단백질 풍부에 일시적인 동요를 경험 한다. 이러한 표현 형 유기 체 또는 미래 세대의 형성에 지속적인 영향을 미칠 여부 불분명 남아 있습니다. 이 생물학의 가장 잘 알려진 인스턴스 단백질, prions, 게놈 수정 없이 상속 특성의 출현을 드라이브의 드문 클래스를 포함 합니다. 대신, 이러한 프로teinaceous 그리고 에fectious 입자 고기 자기 영속적인 변화 단백질 구조1,2를 통해 전송합니다. 상속의이 유형은 치명적인 신경 퇴행 성 질병의 특이 한 상속 패턴의 원인으로 발견 되었다. 그러나, 유기 체 균 류에서 포유류3,4,5,6,7,8,,910 에 이르기까지 연구 이후 프리온 같은 요소 적응 값을 부여 수 있습니다 밝혀 있다. 그럼에도 불구 하 고, prions는 희귀 생물 이상한 하지만 매혹적인로 간주 되었습니다.
이 통용 지혜는 단백질 기반 상속의 특성 오래 예의 작은 세트에 의해 제한 되어 있기 때문에 부분에서 개최 됩니다. 최근 체계적인 심사 노력 식별 하 여 여러 가지 새로운 진실 fide prions11 명의 거의 단백질 도메인12 연료 프리온 같은 구조적 변환 용량이 사진을 크게 확대 했습니다. 그러나, 이러한 방식을 일반적으로 강한 아미노산 시퀀스 편견에 초점을 맞춘, 때문에 발견 되었습니다 prions 창립 효 모 prions [PSI+]13,14,15, [URE3] 및 [RNQ+]11,16의 생 화 확 적인 속성을 공유 합니다. 이러한 포함: 1) 모듈형 도메인을 아스파라긴 (N)과 글루타민 (Q), 2) 어셈블리는 녹말 체 [프리온+] 나 란17,,1819로 긴 고분자 뻗어 풍부 하 고 3) disaggregase 어머니 딸13,,2021에서 충실 한 전파에 대 한 Hsp104 함수에 대 한 의존도 완료. 실제로, 많은 진실 fide prions, 포함 한 [르+], [한-s], 그리고 원래 프리온 PrP (Sc), 이러한 엄격한 조건에서 놓친 것 이다. 아마도 더 중요 한 것은, 그들은 것입니다 수 없습니다 단백질 기반 상속22의 새로운 메커니즘을 캡처. 따라서, 이러한 현상의 진정한 생물학적 폭 자연 이전 생각 보다 훨씬 더 일반적인 수 있습니다.
이 문제를 조사, 높은 처리량, 프로테옴 전체 전략 고용 되었다. PrPSc, [르+]를 포함 하 여 모든 prions의 특징 [한-s]은 인과 단백질의 과도 overexpression 강하게 프리온 수집15,23,,2425,26의 비율을 증가. 우리는 뚜렷이 개별 단백질의 overexpression를 유도 하 여 안정적인 단백질 기반, 후 상태를 시작할 수 경우 체계적으로, 전체에 걸쳐 ORFeome, 효 모에이 기능을 이용을 했다. 잘 알려진 그 단백질 overexpression 고기27를 변경할 수 있습니다. 그러나 그들의 임시 과잉 생산 초기 overexpression 후 세대의 많은 수백에 대 한 상속을 표현 형에서 변화 하기 때문에, 프리온 단백질 평소 되지 않습니다. 우리는 이전 단백질 기반 유전 요소, heritably phenotypic 풍경 게놈28변경 하지 않고 다시 배선 수 있는 단백질의 수십을 식별 하기 위해 특이 한 상속 패턴 뿐만 아니라이 기능을 이용 했다. 비록 일부 확인 된 단백질 이전로 알려져 있었다 prions, 대부분, 새로운 형태의 단백질 기반 상속을 밝히기 위해이 접근의 힘을 강조 했다.

<table><tbody><tr><td>구아니딘 염산염</td><td>시그마</td><td>Cat#G3272-25G</td><td>화학</td></tr><tr><td>망간 클로라이드</td><td>시그마</td><td>Cat#M8054-100G</td><td>화학</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>시그마</td><td>E1510</td><td>화학</td></tr><tr><td>5-플루오로로트산</td><td>시그마</td><td>Cat#F5013-50MG</td><td>화학</td></tr><tr><td>BY4741 MATa (his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 LYS2 met15&Delta; 0 ura3&델타; 0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>효모 균주</td></tr><tr><td>BY4741 MAT&alpha; (his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 lys2&델타; 0 MET15 ura3&Delta; 0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>효모 균주</td></tr><tr><td>Hsp70 (K69M)&nbsp;</td><td>Jarosz et al., 2014b</td><td>N/A</td><td>플라스미드</td></tr><tr><td>FLEXGene 라이브러리</td><td>Hu et al., 2007</td><td>N/A</td><td>플라스미드 라이브러리</td></tr><tr><td>포도당(포도당)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>미디어 구성 요소</td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Sigma</td><td>R0250-25G</td><td>미디어 구성</td></tr><tr><td>요소 갈락토스</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td>미디어 구성</td></tr><tr><td>요소 CSM</td><td>Sunrise Science</td><td>1001-100</td><td>미디어 구성 요소</td></tr><tr><td>: CSM-URA</td><td>Sunrise Science</td><td>1004-100</td><td>미디어 구성</td></tr><tr><td>요소: CSM-LYS</td>, <td>Sunrise Science</td><td>1032-100</td><td>미디어 구성</td></tr><tr><td>요소: CSM-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1019-100</td><td>미디어 구성</td></tr><tr><td>요소: CSM-LYS-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1035-100</td><td>미디어 구성</td></tr><tr><td>요소: 효모 추출물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td>미디어 구성 요소</td></tr><tr><td>펩톤</td><td>연구 제품 국제</td><td>P20240-5000</td><td>미디어 구성 요소</td></tr><tr><td>bacto-peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>미디어 구성 요소</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-2</td><td>미디어 구성</td></tr><tr><td>요소 효모 질소 염기 (아미노산 제외)</td><td>BD</td><td>291920</td><td>미디어 구성 요소</td></tr><tr><td>한천</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49172</td><td>매체 성분</td></tr><tr><td>아데닌 설페이트</td><td>시그마</td><td>A3159-25G</td><td>매체 성분</td></tr><tr><td>아세트산 칼</td>륨 <td>시그마</td><td>P1190-500G</td><td>매체 성분</td></tr><tr><td>우라실</td><td>시그마</td><td>U0750-100G</td><td>매체 성분</td></tr><tr><td>히스티딘</td><td>시그마</td><td>H8000-100G</td><td>매체 성분</td></tr><tr><td>류신</td><td>시그마</td><td>L8000-25G</td><td>미디어 구성 요소</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Sigma</td><td>L5501-25G</td><td>미디어 구성 요소</td></tr><tr><td>RNase I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0601</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>biotinylated DNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1906</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>zymolyase 100T (yeast lytic enzyme)</td><td>Sunrise Science</td><td>N0766555</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Microplate stacker</td><td>BioTek</td><td>BioStack3</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Plate 필러</td><td>BiotTek</td><td>EL406</td><td>장비</td></tr><tr><td>액체 취급 로봇</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>장비</td></tr></tbody></table>

s. cerevisiae 에 단백질 기반 상속에 대 한 높은 처리량 검열

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

미래 세대에 액세스할 수 있는 생물 학적 정보의 인코딩 변화 DNA 시퀀스를 통해 일반적으로 달성 된다. 수명이 긴 상속 단백질 구조 (보다는 오히려 순서)으로 인코딩된는 오래 패러다임 변화 하지만 드문으로 간주 되었습니다. 최고의 특징이 같은 후 성적인 요소는 prions, 새로운 고기의 상속 징후를 구동할 수 자가 조립 동작을가지고 있습니다. 많은 archetypal prions는 눈에 띄는 N/Q-풍부한 시퀀스 바이어스를 표시 하 고 녹말 체 접이식으로 조립. 이러한 비정상적인 기능 대부분 심사 노력 새로운 프리온 단백질 식별을 통보 했다. 그러나, 적어도 3 개의 알려진된 prions (를 포함 하 여 창립 프리온, PrPSc)이 생 화 확 적인 특성 항구 하지 않습니다. 우리는 따라서 대량 작업의 속성에 따라 단백질 기반 상속의 범위를 조사 하는 대체 방법 개발: 프리온 단백질의 과도 overexpression 증가 주파수는 그들은 자체 템플릿 구조 확보. 이 문서에서는 단백질 기반 상속을 유도 하는 효 모 ORFeome의 용량을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 이 전략을 사용 하 여, 우리가 이전에 발견 하는 &gt; 1% 효 모 단백질의 수명이 긴, 안정, 그리고 유전자 변이 보다는 더 빈번 하 게 발생 생물학 특성의 출현을 연료 수. 이 방법은 전체 ORFeomes 또는 특정 유전자 네트워크 또는 환경 자극에 대 한 대상된 심사 패러다임으로 높은 처리량에 사용할 수 있습니다. 앞으로 유전 스크린 수많은 발달 및 신호 경로 정의 하는 것 처럼 이러한 기술을 생물학 과정에서 단백질 기반 상속의 영향을 조사 하는 방법을 제공 합니다.

단백질 과발현은 세포 표현형을 극적으로 변화시키는 것으로 알려져 있습니다27. 실제로 초기 스크리닝 접근법을 통해, 단 10가지의 스트레스 요인만을 사용하여 효모 ORFeome 클론의 과발현으로부터 수백 가지의 새로운 표현형을 재현성 있게 회복했습니다. 그러나 위에서 설명한 분석법들을 통해, 이러한 과발현 이후에 세포가 장기적으로 안정적인 표현형을 유지하는지 여부를 평가할 수 있습니다. 이러한 상태를 유도할 수 있는 단백질 중 하나가 Psp1입니다. Psp1은 기능이 알려지지 않은 단백질로, 복제 기전의 돌연변이(예: pol alpha34)를 억제할 수 있습니다. PSP1 ORF의 과발현은 다양한 스트레스 요인에서 세포 표현형을 조절했습니다. 특히, 한 가지 표현형(염화망간 저항성)은 과발현이 중단된 후 한참이 지난 세포에서도 수백 세대 동안 유지되었습니...

이 프로토콜 기능 S. cerevisiae에 단백질 기반 상속에 대 한 화면을 높은 처리량 방법을 설명 합니다.

S. cerevisiae 에 단백질 기반 상속에 대 한 높은 처리량 검열

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

이 고처리량 효모 표현형 분석의 전반적인 목표는 단백질 기반 유전의 대리 지표로서, 과거의 발현으로 인해 지속적인 표현형 기억을 유도하는 단백질을 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 효모 프리온 분야의 핵심 질문, 예를 들어 얼마나 많은 단백질이 이러한 유형의 유전을 유도할 수 있는지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 편향되지 않은 방식으로 많은 단백질과 경로를 스크리닝할 수 있다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 기술된 대로, 30 °C의 96-웰 플레이트에서 적절한 효모 세포를 배양하여 이 절차를 시작하십시오. 배양액이 포화 상태인지 시각적으로 확인하십시오. 각 웰의 바닥에 세포가 눈으로 보여야 합니다. 액체 핸들링 로봇을 사용하여 웰당 45 µL의 적절한 배지가 포함된 384-웰 플레이트를 준비하십시오.먼저, 384-웰 플레이트의 웰에 Scal-URA를 분주합니다. 그다음, 두 번째 플레이트의 웰에 Scal-URA와 분석 대상 스트레스 요인을 함께 분주하며, 본 실험에서는 20 mM의 염화 망간을 스트레스 요인으로 사용합니다. 세 번째로, 플라스미드 발현을 유도하지 않는 SD-URA와 염화 망간을 또 다른 플레이트에 분주합니다.배양이 담긴 96-웰 플레이트를 액체 핸들링 로봇 위에 내리고, 96-웰 플레이트의 각 웰에서 1 µL씩을 서로 다른 배지가 채워진 384-웰 플레이트의 각각 4개 웰에 1x4 배열로 접종합니다. 세포가 담긴 플레이트를 즉시 상온 및 대기 중 이산화탄소 농도 조건의 마이크로플레이트 스태커에 배치합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 600 nm에서 광학 밀도를 측정하도록 72시간 연속 루프 프로토콜을 설정합니다.성장 측정 후, 단백질 과발현이 일어난 SCal-URA 유도 배양액을 웰당 1 µL씩, 플라스미드의 단백질 발현을 허용하지 않는 ST-URA 배지가 웰당 45 µL씩 들어 있는 새로운 384-웰 플레이트로 옮깁니다. 동시에, 스트레스 요인이 있는 ST-URA에서 배양된 배양액을 웰당 45 µL의 ST-URA가 들어 있는 두 번째 384-웰 플레이트 세트에 동일하게 접종합니다. 플레이트를 가습 챔버에 넣고 30 °C에서 48시간 동안 포화 상태가 될 때까지 배양합니다.48시간 후, 해당 플레이트를 사용하여 웰당 45 µL의 ST-URA가 들어 있는 384웰 플레이트에 웰당 1 µL씩 다시 접종합니다. 그 다음, 동일한 소스 플레이트에서 웰당 1 µL를 취해 스트레스 요인이 포함된 웰당 45 µL의 ST-URA가 들어 있는 별도의 384웰 플레이트에 다시 접종합니다. 세포가 담긴 플레이트를 즉시 상온 및 대기 중 이산화탄소 조건의 마이크로스태커(microstacker)에 넣고, 마이크로플레이트 리더로 600 nm에서 흡광도를 측정하도록 48시간 연속 루프 프로토콜을 설정합니다.성장 측정이 완료되면, 플레이트 리더 소프트웨어를 사용하여 시간 대비 600 nm에서의 광학 밀도 측정값을 XY 테이블로 내보냅니다. 각 생물학적 반복 실험에 대한 광학 밀도 측정값 열을 함께 그룹화하고 평균을 계산합니다. 시간 대비 600 nm에서의 광학 밀도 XY 플롯을 작성하여 성장 곡선을 생성합니다.조상 단백질의 과발현 여부에 따라 특정 스트레스 요인에 대해 유의미한 성장 차이를 보인 배양액의 경우, 각 생물학적 반복 시료에서 1 µL를 취해 10 mL의 물로 희석한 후, 5-FOA가 포함된 플레이트에 50 µL를 도말합니다. 30 °C에서 3일 동안 배양합니다. 플레이트당 콜로니 수가 너무 많거나 적은 경우, 희석 배수를 적절히 조절하십시오.플레이트당 100~200개의 콜로니가 형성되는 것이 이상적입니다. 고압증기멸균된 이쑤시개를 사용하여 8~32개의 단일 콜로니를 선택하고, 웰당 150 µL의 SDCSM이 들어 있는 96웰 플레이트에 접종합니다. 플레이트를 가습 챔버에 넣고 30 °C에서 48~72시간 동안 포화 상태가 될 때까지 배양합니다.이 배양액을 사용하여 SDCSM이 웰당 150 µL씩 담긴 두 세트의 새로운 96-웰 플레이트에 접종하며, 한 세트에는 스트레스 요인을 처리하고 다른 세트에는 처리하지 않습니다. 플레이트를 마이크로플레이트 스태커에 놓고, 600 nm에서 광학 밀도를 48시간 동안 연속적으로 측정하도록 프로토콜을 설정합니다. 48시간 후, 앞서 설명한 방식대로 데이터를 분석하여 이전에 관찰된 유의미한 성장 차이가 플라스미드 소실 후에도 유지되는지 확인합니다.유도된 표현형을 유지하는 세포들을 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 단백질 기반 유전의 전형적인 특징들에 대해 테스트합니다. 이 단백질 기반 유전 스크리닝을 통해 PSP1 오픈 리딩 프레임의 일시적인 과발현이 염화망간에 대한 저항성을 유도하며, 이러한 저항성은 과발현이 중단된 후에도 세포 내에서 수백 세대 동안 유지된다는 것이 밝혀졌습니다. 프리온 예측 알고리즘은 PSP1의 말단 부위가 중간 정도의 프리온 유사성을 가진 것으로 평가했습니다.이와 대조적으로, 이 대표 분석에서 나타난 바와 같이, 알고리즘은 스크리닝을 통해 회수된 대부분의 유도 단백질에서 프리온 유사 서열 특징이 거의 나타나지 않을 것으로 예측했습니다. 망간 클로라이드를 처리한 균주 및 SDCSM의 성장 측정치를 해당 나이브 PSP1 마이너스 대조군으로 정규화하여 분석한 결과, HSP104 디아그레가제(disaggregase)의 억제는 PSP1 의존적 망간 클로라이드 내성에 영향을 주지 않는 반면, HSP70 샤페론과 PSP1 유전자의 제거는 이 표현형을 유전적으로 소실시킨다는 것이 확인되었습니다. PSP1 의존적 표현형 상태를 가진 균주와 나이브 균주 간의 교배에서 얻은 단일 사분체(tetrad)의 모든 포자가 망간 클로라이드 내성을 보였으며, 이는 해당 표현형이 비멘델식으로 유전됨을 나타냅니다.전달 물질로서 모의 용해물(mock lysates)과 PSP1 함유 용해물 간의 단백질 형질전환 감염력을 비교한 결과, PSP1이 접종된 나이브 세포(naive cells)의 53% 이상이 그에 상응하는 염화 망간 저항성 표현형을 나타냈습니다. 이 기술을 숙달하면 배양 단계를 포함하여 몇 주 안에 완료할 수 있으며, 플레이트 수가 많더라도 대부분의 스크리닝 준비 단계는 하루에 2시간 미만으로 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 사전에 테스트하려는 내용을 정확하게 계획하고 실험 규모를 고려하는 것이 중요합니다.이제 이 부분은 해당 기술의 초보자들에게 특히 중요합니다. 이 절차를 따른 후, 텍스트 프로토콜에 기술된 것과 같은 다른 방법들을 수행하여 스크리닝에서 관찰된 표현형이 진정한 프리온 유사(Prion-like) 유전 패턴을 보이는지 결정할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 후성유전학 분야의 연구자들은 sacralis service CI에서 프리온 생물학의 광범위를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 효모에서 단백질 기반 유전의 새로운 형태를 찾기 위해 비편향적 및 표적 방식 모두로 고처리량 스크리닝을 설계하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.DNA 손상 유발제와 같은 특정 화학적 스트레스 요인은 매우 위험할 수 있으므로, 본 실험 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장구 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

GFP - 퓨전 단백질은 널리 공촛점 현미경에 의해 organelles을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, organelles의 형태에 영향을 변이에 대한 검사는 일반적으로 개별적인 돌연변이 유발이 필요하며 시간이 소요됩니다. 여기, 우리는 동시에 효모 거의 5000이 아닌 필수적인 유전자에 organelle - GFP 표식을 통합하는 방법을 보여줍니다.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

여기에 플라스미드 overexpression 화면...

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

거의 전체 (S)를 포함하는 단백질 마이크로 어레이를 사용하여 cerevisiae의 프로테옴은 병렬 단백질 - 단백질 상호 작용의 수천의 신속한 편견 심문 프로브된다. 이 방법은 단백질 - 소분자, 번역 후 수정 및 높은 처리량의 다른 분석을 위해 이용 될 수있다.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

효모 단백병증 모델은 질병과 관련된 단백질의 독성 및 응집을 평가하는 데 유용한 도구입니다. 여기에서는 Hsp104 변이체 라이브러리에서 독성 억제제를 스크리닝하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 효모에서 독성이 있는 단백질의 독성 억제자에 대해 모든 단백질 라이브러리를 스크리닝하는 데 적용할 수 있습니다.

효력을 더 Hsp104 변종 사용 효모 Proteinopathy 모델을 분리

여기에서는 발아 효모에서 화학적-유전적 상호 작용을 정의하기 위한 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 이 접근 방식은 효모 분자 생물학의 기본 기술을 기반으로 하며 중소 규모의 화학 물질 및 기타 매체 환경에 대한 기계론적 조사에 매우 적합합니다.

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 지시된 진화 캠페인을 위한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

이 문서는 기준점과 플라스 미드 라이브러리를 사용 하 여 신진 효 모에 overexpression 심사를 용이 하 게 하 짝짓기 기반 메서드를 제공 합니다.

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

미생물 공학의 '설계-구축 테스트' 주기의 병목 현상은 균주의 기능적 스크린을 수행할 수 있는 속도입니다. 우리는 액적 기반 RNA 시퀀싱을 활용하는 실험당 수백에서 수천 개의 효모 세포에 적용되는 균주 스크리닝을 위한 높은 처리량 방법을 설명합니다.

액적 기반 RNA 시퀀싱을 통한 높은 처리량 효모 균주 현상태핑

이 연구는 Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 유전자 스크리닝을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스크린은 게놈 전체 플라스미드 라이브러리를 사용하여 질의 돌연변이 균주와 관련된 기능 상실 표현형의 억제인자 클론(들)을 식별합니다. ell1 null 돌연변이체의 신규한 유전자 억제인자를 이 스크린을 사용하여 확인하였다.

Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 인자의 식별을위한 유전자 스크리닝

이 프로토콜은 관심 항원에 결합하는 단백질 변이체를 풍부하게 하기 위해 효모 표면 디스플레이 선택 캠페인을 수행하기 위한 필수 단계를 설명합니다.

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

탐색하세요 S. cerevisiae에서 단백질 기반 상속을 유도하는 고처리량 선별법을 통해 지속적인 표현형 기억을 일으키는 단백질을 식별하는 방법을. 이 기법은 프리온 생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

S. cerevisiae 에 단백질 기반 상속에 대 한 높은 처리량 검열

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