S. cerevisiae 에 단백질 기반 상속에 대 한 높은 처리량 검열

이 고처리량 효모 표현형의 전반적인 목표는 단백질 기반 유전의 대용물로서 발현을 통과한 지속적인 표현형 기억을 불법화하는 단백질을 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 효모 프리온 분야의 주요 질문, 예를 들어 얼마나 많은 단백질이 이러한 유형의 불법 유전을 할 수 있는지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 편향되지 않은 방식으로 많은 단백질과 경로를 스크리닝할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 섭씨 30도의 96웰 플레이트에서 적절한 효모 세포를 성장시켜 이 절차를 시작합니다. 배양물을 육안으로 검사하여 배양물이 포화 상태인지 확인하고 세포는 각 웰의 바닥에서 눈으로 볼 수 있어야 합니다. 액체 핸들링 로봇을 사용하여 웰당 45마이크로리터의 적절한 매체를 포함하는 384개의 웰 플레이트를 준비합니다.

먼저 Scal-URA를 384웰 플레이트의 웰에 분배합니다. 그런 다음 Scal-URA와 관심 스트레스 요인을 두 번째 플레이트의 웰에 분배하고 20 밀리몰의 염화망간이 이 실험에서 스트레스 요인으로 사용됩니다. 셋째, 플라스미드 발현을 유도하지 않는 SD-URA와 염화망간을 다른 플레이트에 분배합니다.

배양물을 포함하는 96웰 플레이트를 액체 취급 로봇 위로 내리고 96웰 플레이트의 각 웰에서 1마이크로리터로 구성된 1-4개의 어레이를 서로 다른 매체로 채워진 각 384웰 플레이트의 4개의 별도 웰에 접종합니다. 즉시 셀이 있는 플레이트를 실온과 대기 중 이산화탄소가 있는 마이크로플레이트 스태커에 놓습니다. 72시간 연속 루프에 대한 프로토콜을 설정하고 마이크로플레이트 리더로 600나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다.

성장 측정 후, 단백질 과발현을 경험한 SCal-URA 유도 배양액의 웰당 1마이크로리터를 플라스미드의 단백질 발현을 허용하지 않는 웰당 45마이크로리터의 ST-URA 배지를 포함하는 새로운 384 웰 플레이트로 옮깁니다. 동시에, 스트레스 요인이 있는 상태에서 ST-URA에서 성장한 배양물로부터 ST-URA당 45마이크로리터를 포함하는 384웰 플레이트의 두 번째 세트에 대한 유사한 접종을 수행합니다. 플레이트를 가습 챔버에 놓고 섭씨 30도에서 포화 상태까지 48시간 동안 플레이트를 성장시킵니다.

48시간 후, 플레이트를 사용하여 ST-URA당 45마이크로리터를 포함하는 384웰 플레이트에 웰당 1마이크로리터를 다시 접종합니다. 그런 다음, 동일한 소스 플레이트에서 웰당 1마이크로리터의 스터스터가 있는 ST-URA 웰당 45마이크로리터를 포함하는 별도의 384웰 플레이트로 별도의 재접종을 수행합니다. 즉시 마이크로스태커의 셀과 함께 플레이트를 실온과 대기 중 이산화탄소에 배치하고 48시간 연속 루프에 대한 프로토콜을 설정하여 마이크로플레이트 리더로 600나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다.

성장 측정이 완료되면 플레이트 리더 소프트웨어를 사용하여 600나노미터 측정값에서 광학 밀도 대비 시간을 XY 테이블로 내보냅니다. 각 생물학적 복제에 대한 광학 밀도 측정의 열을 그룹화하고 평균을 계산합니다. 600나노미터에서 광학 밀도 대비 시간의 XY 플롯을 생성하여 성장 곡선을 생성합니다.

조상 단백질의 과발현에 의존하는 주어진 스트레스 요인에 대한 반응으로 유의미한 성장 차이를 선택한 배양액의 경우, 각 생물학적 복제물에서 1마이크로리터를 취하여 10ml의 물로 희석한 다음 5-FOA가 포함된 플레이트에 50마이크로리터를 도금합니다. 섭씨 30도에서 3일 동안 자랍니다. 이로 인해 플레이트당 콜로니가 너무 많거나 너무 적으면 그에 따라 희석 계수를 조정하십시오.

플레이트당 100-200개의 콜로니가 이상적입니다. 오토클레이브 이쑤시개로 8-32개의 단일 콜로니를 선택하고 웰당 150마이크로리터의 SDCSM이 포함된 96개의 웰 플레이트에 고정합니다. 플레이트를 가습 챔버에 넣고 섭씨 30도에서 48-72시간 동안 포화 상태로 성장합니다.

이러한 배양물을 사용하여 스트레스 요인이 있거나 없는 상태에서 SDCSM당 150마이크로리터를 포함하는 96웰 플레이트의 새로운 두 세트를 접종합니다. 플레이트를 마이크로플레이트 스태커에 놓고 48시간 연속 루프에서 600나노미터의 광학 밀도를 측정하도록 프로토콜을 설정합니다. 48시간 후, 앞서 보여진 것과 같이 데이터를 분석하고 앞서 나타난 유의미한 성장 차이가 플라스미드 손실 후에도 유지되는지 확인합니다.

그런 다음 유도된 표현형을 유지하는 세포는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 기반 유전의 고전적인 특징에 대해 테스트됩니다. 이 단백질 기반 유전 스크리닝은 PSP1 개방형 판독 프레임의 일시적인 과발현을 밝혀냈으며, 이는 과발현이 중단된 후에도 오랫동안 세포에서 수백 세대 동안 유지되었던 염화망간에 대한 내성을 유발합니다. 프리온 예측 알고리즘은 PSP1의 말단 종점을 프리온과 적당히 유사한 것으로 평가했습니다.

이와는 대조적으로, 알고리즘은 이 대표적인 분석에서 볼 수 있듯이 스크린에서 회수된 대부분의 유도 단백질에서 유의미한 프리온과 유사한 염기서열 특징을 거의 예측하지 못했습니다. 해당 순진한 PSP1 마이너스 대조군으로 정규화된 염화망간을 사용한 균주 및 SDCSM의 성장 측정은 HSP104 디스어그레가제의 억제가 PSP1 의존성 염화망간 저항성을 손상시키지 않는 반면 HSP70 샤페론 및 PSP1 유전자의 제거는 이 표현형을 유전적으로 제거하는 것으로 나타났습니다. PSP1 의존 표현형 상태와 순진한 균주를 품고있는 균주 간 십자가의 단일 테트라드에서 나온 모든 포자는 염화망간 저항성을 나타내며, 이는 표현형의 비 멘델 유전을 나타냅니다.

모의 용해물과 용해물을 전염 가능한 물질로 함유한 PSP1 사이의 단백질 변형에 대한 감염성을 비교한 결과, 파종된 PSP1로 형질전환된 미숙 세포의 53% 이상이 해당 염화망간 저항성 표현형을 받은 것으로 나타났습니다. 이 기술을 마스터하면 배양 단계를 포함하여 몇 주 안에 완료할 수 있으며 대부분의 스크리닝 단계 준비는 많은 수의 플레이트를 사용하더라도 하루에 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 사전에 테스트하려는 대상을 정확히 계획하고 실험의 규모를 염두에 두는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이제 이것은 기술 초보자에게 특히 중요합니다. 이 절차에 따라, 텍스트 프로토콜에 설명된 것과 같은 다른 방법을 수행하여 스크리닝에서 관찰된 표현형이 진정한 프리온과 같은 유전 패턴을 나타내는지 확인할 수 있습니다. 개발 후,이 기술은 후성 유전학 분야의 연구자들이 sacralis 서비스 CI에서 프리온 생물학의 폭을 탐구 할 수있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청 한 후, 편향되지 않고 표적화 된 방식으로 효모에서 새로운 형태의 단백질 기반 유전을위한 높은 처리량 스크린을 설계하는 방법을 잘 이해해야합니다.

DNA 손상제와 같은 특정 화학적 스트레스 요인은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.