효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

이 방법은 어떤 유전적 요인과 경로가 질병 관련 단백질의 독성을 조절하는지와 같은 신경퇴행성 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 효모 짝짓기의 고효율 프로세스가 많은 라이브러리 유전자 컬렉션에 대해 효모 모델을 스크리닝하는 데 사용된다는 것입니다. 이 방법은 신경퇴행성 질환 단백질의 독성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 스트레스 조건의 내성과 같은 효모의 다른 세포 과정에 대한 연구에도 적용할 수 있습니다.

배열된 플라스미드 라이브러리에서 웰당 5마이크로리터의 플라스미드 DNA를 둥근 바닥 96웰 플레이트로 분주하여 이 절차를 시작합니다. 접시를 섭씨 4도로 유지하십시오. 다음으로, 500ml 플라스크에 150ml의 효모 펩톤 포도당 또는 YPD 배지를 반수체 효모 균주 W303 Alpha의 콜로니를 접종합니다.

섭씨 30도에서 배양물을 배양하고 밤새 200rpm으로 흔듭니다. 다음 날 아침, 하룻밤 배양의 OD600을 측정 한 후 배양물을 YPD 2 리터에 0.1의 OD600으로 희석합니다. 섭씨 30도에서 200rpm으로 흔들면서 약 5시간 동안 배양하여 배양액이 0.4 - 0.6의 OD600에 도달할 때까지 배양합니다.

효모 배양액을 수확하려면 멸균 250ml 원심분리기 병 8개를 채우고 실온에서 10분 동안 3000xG로 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 붓습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 효모를 세척하고 세포를 두 개의 원심분리 튜브로 통합합니다.

각 세포 펠릿을 25ml의 0.1몰 리튬 아세테이트 용액에 재현탁합니다. 재현탁된 세포를 결합하고, 연어 정자 DNA 5ml를 첨가한 다음, 150ml 플라스크로 옮긴다. 섭씨 30도에서 225rpm으로 30분 동안 흔들면서 배양합니다.

30분 후, 세포 혼합물을 멸균 일회용 시약 저장통에 붓습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 35마이크로리터의 세포 혼합물을 이전에 준비된 라이브러리 플라스미드 DNA를 포함하는 둥근 바닥 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 96웰 플레이트를 1분 동안 1000rpm으로 소용돌이칩니다.

접시를 섭씨 30도에서 30분 동안 흔들지 않고 배양합니다. 열이 더 효율적으로 전달될 수 있도록 플레이트를 쌓지 마십시오. 섭씨 30도 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 1000rpm에서 30초 동안 혼합합니다.

각 웰에 125마이크로리터의 변형 버퍼를 추가한 다음 1분 동안 1000rpm으로 플레이트를 와류로 회전시킵니다. 플레이트를 섭씨 30도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 42도의 인큐베이터에 15분 동안 넣어 효모에 열 충격을 가합니다.

3000 xG에서 플레이트를 5분 동안 원심분리합니다. 쓰레기통 위에 플레이트를 뒤집고 플레이트에서 버퍼를 강제로 버려 우물에서 변형 버퍼를 제거합니다. 깨끗한 종이 타월로 거꾸로 된 플레이트를 빠르게 닦아서 플레이트 위에 있는 액체를 제거합니다.

라이브러리 플라스미드에서 선택 가능한 마커에 해당하는 200마이크로리터의 최소 드롭아웃 매체를 각 웰에 추가하여 세포를 헹굽니다. 여기에는 합성 우라에서 매체를 뺀 값이 사용됩니다. 3000 xG에서 플레이트를 5분 동안 원심분리합니다.

앞에서 설명한 대로 쓰레기통 위의 상층액을 제거합니다. 각 웰에 2%포도당을 함유한 160마이크로리터의 최소 우라에서 배지를 뺀 값을 넣고 1분 동안 1000rpm으로 플레이트를 소용돌이칩니다. 섭씨 30도에서 48시간 동안 흔들지 않고 플레이트를 배양합니다.

48 시간 후, 변형 된 효모 펠릿이 각 우물의 바닥에서 볼 수 있어야합니다. 액체 디스펜서를 사용하여 포도당을 포함하는 100마이크로리터의 우라에서 배지를 뺀 배지를 새로운 96웰 플레이트 세트의 각 웰에 추가합니다. 변형된 효모가 포함된 플레이트를 1000rpm에서 30초 동안 소용돌이칩니다.

멸균 플라스틱 96핀 복제기를 사용하여 변형된 효모가 들어 있는 웰에 핀을 넣은 다음 배지로 채워진 새 플레이트의 해당 웰에 접종합니다. 새 플레이트를 섭씨 30도에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후, 성공적으로 변형된 효모가 들어 있는 각 웰의 바닥에서 효모 펠릿을 볼 수 있어야 합니다.

이러한 효모 균주를 글리세롤 스톡으로 저장하려면 각 웰에 50%글리세롤 50마이크로리터를 추가하고 1000rpm에서 30초 동안 플레이트를 볼텍스하고 알루미늄 호일로 플레이트를 밀봉하고 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 글리세롤 스톡에서 라이브러리 균주를 되살리려면 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 96웰 플레이트를 꺼내 알루미늄 호일을 제거한 다음 효모를 실온에서 약 30분 동안 해동합니다. 효모가 해동되면 멸균 플라스틱 96핀 복제기를 사용하여 글리세롤 스톡을 160마이크로리터의 신선한 우라에서 96웰 플레이트에 2% 포도당을 함유한 배지를 뺀 상태로 접종하고 섭씨 30도에서 24시간 동안 배양합니다.

라이브러리 균주를 사용한 직후, 플레이트를 밀봉하고 영하 80도의 냉동고에 반납하십시오. 라이브러리 균주가 해동되는 당일, 쿼리 효모 균주에 50ml의 YPD를 접종하고 밤새 250rpm으로 흔들면서 섭씨 30도에서 성장합니다. 다음 날 아침, 쿼리 효모 균주를 멸균 일회용 시약 저장소에 붓고 쿼리 균주 160마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 분취합니다.

액체 디스펜서를 사용하여 웰당 160마이크로리터의 YPD 매체를 96웰 플레이트에 분배합니다. 쿼리 스트레인과 라이브러리 스트레인 플레이트를 포함하는 96웰 플레이트를 간단히 와류시킨 다음 멸균 96핀 리플리케이터를 사용하여 라이브러리 스트레인을 쿼리 스트레인이 접종된 YPD 플레이트로 전송합니다. YPD 플레이트를 섭씨 30도에서 24시간 동안 배양합니다.

24시간이 지나면 각 우물의 바닥에 효모 알갱이가 보일 것입니다. 쿼리 스트레인의 플라스미드와 라이브러리 플라스미드에서 선택 가능한 마커에 해당하는 2% Raffinose를 포함하는 최소 droupout 배지로 96웰 플레이트를 채웁니다. 멸균 96핀 리플리케이터를 사용하여 YPD 짝짓기 배양에서 선택적 배지로 효모를 이동합니다.

96웰 플레이트를 섭씨 30도에서 48시간 동안 배양합니다. 이배체 세포가 짝짓기를 하고 형성되어 query plasmid와 library plasmid를 모두 포함하는 효모 세포만이 이 배지에서 성장할 수 있습니다. 선택적 배지를 함유한 Raffinose에서 48시간 동안 성장한 후 이배체 세포를 포함하는 웰 바닥에서 펠릿이 보이는 것을 관찰합니다.

96웰 플레이트를 1분 동안 1000rpm으로 소용돌이칩니다. 로봇 탐지기를 사용하여 2%갈락토스와 2%한천을 포함하는 ura-his-droupout 플레이트와 2%포도당과 2%agar를 포함하는 ura-his-droupout 플레이트의 4배로 한천 플레이트에서 효모를 찾습니다. 얼룩이 생기면 한천 플레이트를 건조시킨 다음 섭씨 30도의 인큐베이터에 거꾸로 4일 동안 넣습니다.

24시간마다 한천 플레이트를 촬영하여 효모의 성장을 기록합니다. ALS 관련 단백질 FUS의 독성은 이배체 효모에서 처음으로 조사되었습니다. FUS를 유발하는 갈락토오스를 함유한 한천 플레이트에서 알 수 있듯이 FUS 독성은 이배체 효모와 반수체 효모 모두에서 일관됩니다.

형질전환 기반 방법에서 FUS 독성 억제 인자로 이전에 확인된 5개의 유전자를 짝짓기 방법으로 테스트했습니다. lane one은 두 개의 empty vector로 형질전환된 control yeast strain 입니다. 2번째 열은 FUS의 발현이 매우 독성이 있는 빈 벡터를 가진 이배체 FUS 효모 균주입니다.

3번에서 7번 레인은 FUS를 발현하는 이배체 효모와 억제 유전자를 보여줍니다. 5개의 유전자 모두 이배체 효모에서 FUS의 독성을 구제하여 짝짓기 방법이 효과적이었음을 나타냅니다. 그런 다음 이 짝짓기 기반 방법을 940개 유전자의 과발현 라이브러리 스크리닝에 적용했습니다.

그리고 하나의 대표 플레이트의 사진이 표시됩니다. FUS와 라이브러리 유전자가 발현되는 갈락토스 플레이트에 표시된 바와 같이, FUS는 이배체 효모 세포에 독성이 있었습니다. 녹색 사각형으로 표시된 라이브러리 유전자는 FUS 독성을 구제했습니다.

빨간 사각형으로 표시된 라이브러리 유전자는 독성을 높였습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 120시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 스크리닝에 사용되는 표현형이 반수체 짝짓기 유형에 의존하지 않는다는 것을 미리 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 효모에서 질병 관련 단백질의 독성을 구제하는 과발현 시 유전적 요인을 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 개발 후,이 기술은 신경 퇴행성 질환 분야의 연구자들이 효모 모델에서 질병 관련 단백질의 세포 독성 메커니즘을 탐구 할 수있는 길을 열 수 있습니다. 이 절차에 따라 베타 갈락토시다아제 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 구조가 특이적인지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.