Name: 효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 배우세요 효모 짝짓기 기반 과발현 스크리닝 방법으로 신경퇴행성 질환 단백질 독성 유전자를 효율적으로 분석하는 기술입니다. 이 방법은 다양한 세포 과정 연구에도 활용됩니다.

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우리는 주 실험실 및 종 실험실, 라이트 주립 대학에서 재정 지원의 구성원과 사려깊은 토론에 대 한 감사.

참고: 여기에 설명 된 프로토콜 10 96 잘 접시에 포함 된 라이브러리 플라스 미드를 상영을 위해 설계 되었습니다 하지만 확장 될 수 있습니다 또는 그에 따라 아래로. 프로토콜은 라이브러리 전체 심사를 완료 하는 데 반복 될 필요가 있다. 일반적으로, 라이브러리 유전자의 10 판에 대 한 심사 때마다 1 사람이 편안 하 게 처리할 수 있습니다.
1. 96 잘 누 룩 변환에 대 한 준비
참고:이 단계는 수행 이전 설명된7,10.
<ol><li>Aliquot 5 µ L (약 50-100 ng)의 플라스 미드 DNA 라운드 아래 96 잘 접시의 각 음에 기준점과 플라스 미드 도서관에서. 참고: 이러한 라이브러리의 예로 효 모 유전자 overexpression 라이브러리10것입니다.</li>
	<li>단일 효 모 스트레인 W303α의 식민지 (2-3 m m 직경)와 500 mL 플라스 크에 효 모 펩 포도 당 (YPD) 미디어의 150 mL 접종 떨고 (200 rpm)와 30 ° C에서 그들을 밤새 품 어.</li>
	<li>다음 아침, 하룻밤 문화의 OD600 을 측정 하 고 OD600 효 모 문화를 희석 = 0.1 YPD 2 L (을)에서. 품 어 그것 동요 (200 rpm)와 30 ° c ~ 5 h에 대 한 문화 OD600 에 도달할 때까지 = 0.4-0.6.</li>
</ol>2. 누 룩 변환
<ol><li>8 살 균 250 mL 원심 병 작성 및 10 분에 대 한 3000 x g 에서 실내 온도에 그들을 centrifuging 효 모 문화는 펠 렛을 방해 하지 않고 부는 상쾌한 어 추수. 참고: 상 온에서 원심 분리 단계를 모두 수행 합니다.</li>
	<li>워시 살 균 증류수 H2o.와 누 룩 이 위해 살 균 H2O의 100 mL에 추가 각 원심 병 및 소용돌이 그것 셀 펠 릿 resuspend. 2 병 및 원심 분리기 3000 x g 5 분에서 부는 상쾌한 어로 씻어 세포를 결합 합니다.</li>
	<li>각 병 100 mL에 0.1 M LiOAc/1XTE (100mm LiOAc; 10 mM Tris, pH 8.0; 1 mM EDTA)의 세포를 세척 하 고 5 분 부는 상쾌한 오프에 대 한 3000 x g 에서 원심.</li>
	<li>Centrifuging, 하는 동안 3 분에 대 한 블록 히터를 사용 하 여 100 ° C에서 연어 정자 DNA (10mg/mL)의 5 mL을 삶아 고 얼음에 그것을 냉각.</li>
	<li>각 병에 0.1 M LiOAc/1XTE의 25 mL에 셀 펠 릿을 resuspend, resuspended 셀을 결합 하 고 150 mL 플라스 크에 그들을 전송. 사전 냉각된 연어 정자 DNA의 5 mL을 추가 하 고 30 분 (225 rpm)을 떨고와 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>멸 균 일회용 시 저수지로 셀 혼합물을 부 어 하 고, 세포 혼합물의 35 µ L을 라운드-96-잘 바닥판 포함 하는 라이브러리 플라스 미드 DNA의 각 영역 전송 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여. 소용돌이 96 잘 접시 1000 rpm에서 1 분 동안 접시 vortexer를 사용 하 여. 동요 하지 않고 30 ° C에서 30 분 동안 접시를 품 어. 참고: 열 보다 효율적으로 전송할 수 있도록, 접시를 스택을 하지 않습니다. 우리는 vortexing 1000 rpm에서 96 잘 접시는 우물 밖으로 유출에 액체를 발생 하지 않습니다 하지만 안전 소용돌이 속도 단계를 수행 하기 전에 테스트 해야 합니다 발견.</li>
	<li>플라스 크에 40 %PEG3350 마지막 농도, 10 %DMSO, 그리고 0.1 M LiOAc 변환 버퍼의 200ml를 준비 합니다. 즉시 사용 하기 전에 변환 버퍼를 준비 하 고 떨고에 의해 철저 하 게 혼합.</li>
	<li>30 ° C 배양 기에서 제거 96 잘 접시와 30에 대 한 그들을 섞어 접시 vortexer를 사용 하 여 1000 rpm에서 s. 추가 변환 버퍼의 125 µ L 각 잘 그리고 소용돌이를 1 분 동안 접시 1000 rpm.</li>
	<li>30 분 동안 30 ° C에서 번호판을 품 어 그리고 15 분 동안 42 ° C 인큐베이터에 접시를 배치 하 여 충격 누 룩을 열. 참고: 판 스택을 하지 않습니다.</li>
	<li>3000 x g에 5 분 동안 격판덮개 원심 폐기물 빈 위에 접시를 반전 하 고 강제로 격판덮개에서 버퍼를 덤핑 하 여 우물에서 변환 버퍼를 제거 합니다. 신속 하 게 거꾸로 번호판 번호판 위에 어떤 액체를 제거 하는 깨끗 한 종이 타월에 오 점.</li>
	<li>최소한의 강하 중간에 해당 하는 라이브러리 플라스 미드에 선택 가능한 마커의 접시 200 µ L을 추가 하 여 셀을 씻어. 참고: 우리는 합성 우 라-매체를 사용합니다.</li>
	<li>3000 x g 에 5 분 동안 접시를 원심 고 단계 2.10에서 폐기물 bin에는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>최소한의 우 라-매체 포함 2% 포도의 160 µ L를 추가 합니다. 와 동 1000 rpm에서 1 분 동안 접시 및 48 h 30 ° C에서 흔들어 없이 그들을 품 어. 48 h 후 note 변형된 효 모의 공 각의 맨 아래에 표시 됩니다.</li>
	<li>액체 디스펜서를 사용 하 여, 96 잘 접시의 새로운 세트의 각 음에 우 라-미디어 포함 포도 당 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>와 동 30 1000 rpm (단계 2.13)에서 변형 된 효 모에 포함 된 접시 살 균 플라스틱 96 핀 복제기를 사용 하 여 s., 핀 변환 된 효 모에 포함 된 우물에 놓고 새로운 접시의 해당 우물에 그들을 예방합니다 미디어를 가득합니다. 24 h 30 ° C에서 새로운 번호판을 품 어. 참고: 10 접시를 사용 하는 경우 매체 수 또한 될 적절 멀티 채널 펫을 사용 하 여 수동으로.</li>
	<li>24 h 후 효 모의 펠 릿은 성공적으로 변환 된 효 모에 포함 된 각의 맨 아래에 표시 되어야 합니다. 글리세롤 주식으로 이러한 효 모 종자 저장, 각 음에 50% 글리세롤의 50 µ L을 추가 소용돌이 30 접시 1000 rpm에서 s 바다 표범 어업 테이프와 플레이트를 밀봉 하 고-80 ° c.에서 그들을 멈추게 참고: 위의 단계를 한 번 수행 해야 합니다. 동일한 라이브러리 일회용 시 저수지에 대해 다른 효 모 모델의 미래 상영 글리세롤 주식에서 시작 하 고 단계에서 즉시 진행 수 있습니다.</li>
</ol>3. 쿼리 효 모 라이브러리 유전자를 포함 하는 셀 간의 짝짓기
<ol><li>글리세롤 주식에서 라이브러리 긴장을 회복, 96 잘 접시-80 ° C 냉동 고, 제거는 씰링 테이프, 고 누 룩 약 30 분 동안 실 온에서 녹여 밖으로 걸릴.</li>
	<li>효 모는 해 동 되 면 살 균 플라스틱 96 핀 복제기를 사용 하 여 글리세롤 주식 96 잘 접시에 신선한 우 라-미디어 포함 2% 포도의 160 µ L 접종을 라이브러리 긴장 사용 후에 즉시 24 h. 30 ° C에서 그들을 품 어 바다 표범 어업 테이프와 번호판을 봉인 하 고-80 ° C 냉장고에 반환.</li>
	<li>라이브러리 긴장 (W303α)는 해 동 하는 같은 날에 접종 쿼리 효 모 스트레인 (여기, W303a에는 FUS) YPD 50 mL를 하룻밤 250 rpm에서 떨고와 30 ° C에서 그것을 성장 하 고.</li>
	<li>다음날 아침, 멸 균 일회용 시 저수지, 그리고 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시의 각 음에 쿼리 스트레인의 aliquot 160 µ L를 쿼리 효 모 스트레인을 붓는 다.</li>
	<li>액체 디스펜서를 사용 하 여 10 96 잘 접시의 각 음에 160 µ L YPD 미디어의 분배. 라이브러리 효 모와 쿼리 효 모 스트레인 짝짓기 나중이 접시를 사용 합니다.</li>
	<li>짧게 소용돌이 96 잘 접시 쿼리 긴장과 다음 사용 하 여 쿼리를 전송 하는 살 균 96 핀 복제기를 포함 하는 YPD 번호판 스트레인.</li>
	<li>짧게 소용돌이 라이브러리 변형 판 및, 각 라이브러리 스트레인 플레이트를 사용 하 여 새로운 살 균 96 핀 복제기 쿼리 긴장으로 주사 하는 YPD 번호판 라이브러리 긴장을 전송. 참고: 셀 글리세롤에 여러 동결 눈 녹은 물 주기 후 그들의 생존 능력을 잃게됩니다. 돌아가서 라이브러리 긴장 장기 보관 (-80 ° C 냉동 고) 가능 한 한 빨리 좋은 품질, 라이브러리를 유지 하 고 나중을 위해 준비 됩니다. 제대로 유지, 글리세롤 재고 냉동 고 10 시간 이상 해 동. 우리는 또한 강력 하 게 작업 복사본 및 글리세롤의 백업 복사본을 유지 것이 좋습니다. 작업 사진, 작동 하지 않을 때 즉시 새로운 확인 작업 복사본 백업 복사본에서.</li>
	<li>YPD 접시 24 h. 참고는 효의 펠 릿 표시 됩니다 각 우물의 바닥에서 24 시간 후에 30 ° c를 품 어.</li>
	<li>2% 유, 해당 하는 라이브러리 (예를 들어, 여기 우 라-그의-)를 플라스 미드에 뿐만 아니라 쿼리 스트레인에 플라스 미드에 선택 가능한 마커를 포함 하는 최소의 강하 매체와 채우기 96 잘 접시.</li>
	<li>살 균 96 핀 복제기를 사용 하 여 선택적 미디어 문화를 짝짓기 하는 YPD에서 누 룩을 전송. 48 h; 30 ° C에서 96 잘 접시를 품 어 만 성관계를 셀을 효 모와 형성 2 중 세포, 따라서 두 쿼리 플라스 미드를 포함 고 라이브러리 플라스 미드가이 미디어에서 성장할 수 있을 것입니다. 2 일 후 관찰 펠 릿 우물의 하단에 표시 됩니다.</li>
</ol>4. 분석 결과 보 이나
<ol><li>
유에 포함 된 선택적 미디어에 성장의 48 h 후 한 천 배지에서 효 자리.
	<ol>
<li>2 %agar 분명 폴리스 티 렌 플레이트, 1 개 포함 2% 갈 락 토스와 다른 포함 2% 포도 당을 사용 하 여 포함 된 우 라 그의 강하 격판덮개의 2 세트를 준비 합니다.</li>
		<li>1000 rpm에서 1 분 동안 소용돌이 96 잘 접시 다음 누 룩 2% 갈 락 토스와 2 %agar (FUS 및 라이브러리 유전자 유도 된다)를 포함 하는 우 라 그의 강하 번호판과 포도 당 2%와 2 %agar (FUS 및 라이브러리 유전자를 포함 하는 우 라 그의 강하 번호판 자리 억압)는 각 문화 잘 발견 quadruplicate에 한 천 배지 위에 로봇 탐지 기계를 사용 하 여 (즉, 1에서 문화 잘 발견 한 접시에 4 반점에).</li>
		<li>구경, 후 한 천 배지, 건조 하 고 다음 거꾸로 30 ° C 배양 기에서 그들을 배치 하자. 쿼리 스트레인에 독성 구조는 더 빨리/더 효 모 성장 기록 또는 기록 쿼리 스트레인에 독성 악화 됩니다 느린/덜 성장 한 천 배지 모든 24 h에 사진. 4 일에 대 한 번호판을 품 어. 참고: 각 문화 잘 발견하실 수 있습니다 한 천 배지 1-1에 이전 변환 기반 방법10에서 같이. 그러나, 1-에-4 여기 안보 (로봇 탐지 기계를 사용 하 여 편리 하 게 설정할 수 있습니다)이 크게 잘못 된 반응의 수를 줄여 분석 결과의 견고성을 증가. 긍정적인 안타 때 동일한에서 모든 4 식민지 잘 유사한 표현 형을 표시만 여겨진다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 짝짓기 사용 하 여 효 모 모델에 플라스 미드 도서관을 소개 하는 효 모에 플라스 미드 overexpression 화면 수행 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 신경 퇴행 성 질병 단백질 독성의 여러 효 모 모델 수 상영 플라스 미드 도서관으로 변형 하는 효 모의 동일한 컬렉션을 사용 하 여. 변화의 힘 드는 과정만는 고효율 효 모 후 쿼리 스트레인에 플라스 미드 도서관을 소개 하는 짝짓기 한 번 수행 해야 합니다. 이 프로토콜은 미디어와 한 천 배지 위에 자리 효 모 문화 분배를 로봇 장비의 사용에 의존지 않습니다. 프로토콜의 로봇 장비를 사용 하지 않고 수행할 수 있습니다, 하는 동안 그것은 더 많은 시간이 소요 됩니다. 이 메서드는 성공적으로 FUS의 독성을 수정할 수 있는 유전자에 대 한 화면을 사용.
FUS 2 중 효 모 배경에서 약간 덜 독성은 관찰 합니다. 이 대부분 유전자 사본 수와 2 중 효의 성장 율에 차이. 하지 않는 한 공부...

싹 트는 효 모 Saccharomyces cerevisiae 널리 사용 되었습니다 기본 과학 연구1 에 직접 인간의 질병에 관련 된 세포 프로세스를 이해 하. 또한, 그것은 사용 되는 모델 생물으로 가장 흔한 신경 퇴행 성 질환, 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 헌팅턴 병, 그리고 루를 포함 하 여에 연결 등 인간의 질병 관련 단백질, 공부에 대 한 옆 경화 증 (ALS)2. 효 모 모델의 장점은는 게놈 넓은 스크린 따라서 그들의 독성의 메커니즘에 대 한 통찰력을 주는 질병 관련 단백질의 독성에 관련 된 세포 경로 식별 하기 위해 수행할 수 있는 용이성입니다. 이러한 한 화면은 기준점과 라이브러리에 5500 효 모 유전자 각각의 어떤 유전자 독성 overexpressed 때 수정할 수 있습니다 식별 하는 효 모 모델로 변환 됩니다 overexpression 라이브러리 화면을 이라고 합니다. 이 검사 방법은 여러 신경 퇴행 성 질환 관련 단백질의 Huntington의 질병3, 파 킨 슨 병4,5 α-synuclein huntingtin 포함 효 모 모델에 성공적으로 적용 된 , 알 츠 하이 머 병6, FUS 및 TDP-43 ALS7,,89Aβ. 일반적으로는 높은 처리량 방법10에서 이루어집니다, 하는 동안 화면의 가장 노동 집약적인 단계는 개별적으로 기준점과 라이브러리에서 5500 효 모 유전자 변형 시키는. 심사, 반복 때마다가이 단계를 수행 해야 합니다 그리고 때마다 새로 설립된 된 효 모 모델 공부 될 필요가 있다. 그것은이 작업을 수행 하는 더 효율적인 방법을 찾을 수 해야 합니다.
효 모 세포는 단일과 2 중 형태로 안정적으로 존재할 수 있습니다. 두 유형의 단일 셀, 짝짓기 형식 짝짓기 반대는 각 짝짓기의 α. 단일 셀 생산을 입력 하 고 짝짓기 형식 셀 반대만 응답 하는 그들의 자신의 특정 짝짓기 페로몬을 분 비 하는 고. 이로써 간의 짝짓기는 생산 안정 된 2 중 세포, / α α 세포. 이 과정은 자발적이 고 매우 효율적인11. 우리 플라스 미드 도서관 소개 S. cerevisiae 의이 독특한 라이프 사이클의 활용할 수 있습니다. 좀 더 구체적으로, 기준점과 플라스 미드 도서관에서 각 유전자 한 짝짓기 종류, 즉, α 셀의 단일 세포로 변형 됩니다. 라이브러리 유전자를 포함 하는 이러한 셀 다음 글리세롤 주식 기준점과 96 잘 형식에서에 저장 됩니다. 상영 하는 각 효 모 모델, 라이브러리 유전자를 포함 하는 효 모 세포 글리세롤 주식에서 재개 수 있습니다 되 고 반대 짝짓기 종류, 즉, 짝짓기 종류의 효 모 모델 짝짓기를 통해 심사를 할 수 있는 한. 효 모에 두 개의 유전자를 함께가지고 짝짓기를 사용의이 아이디어를 새로운 되지 않습니다. 2 하이브리드 심사, 있는 미끼 생성 한 짝짓기 형식에 (즉, Gal4 DNA 바인딩 도메인 융해) 소집 짝짓기 기준점과 라이브러리에서 먹이 구조를 통해 높은 처리량 효 모에 성공적으로 적용 된 그러나 12.,이 전략 적 overexpression 라이브러리 검 진, 항상 전통적인 변환 방법 사용에 적용 되었습니다.
우리의 실험실 이전 ALS 관련 단백질 FUS7의 효 모 모델을 설립. 변환 메서드를 사용 하 여 overexpression 라이브러리 심사를 통해 우리 FUS overexpressed 때의 독성을 구출 하는 5 개의 효 모 유전자를 (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, 및 VHR1)을 발견 했다. 이들이 발견 했다 독립적으로 확인 하지 비슷한 연구와 다른 그룹8. hUPF1, ECM32의 인간 상 동 기관 나중 기본 신경 세포13 와 ALS14 도의 동물 모델에서 독성을 억제 하기 위해 표시 했다. 이 5 개의 유전자를 사용 하 여 원리의 증거로, 그들은 짝짓기에 의해 FUS 효 모 모델에 소개 될 때 모든 5 개의 유전자 마찬가지로 FUS 독성을 구조 설명 합니다. 라이브러리 유전자를 포함 하는 효 모 세포 글리세롤 주식에 영구적으로 저장 하 고 필요할 때마다 부활 수 있습니다, 이후이 짝짓기 기반 메서드 변환 라이브러리에 대 한 검사를 해야 할 때마다 시간이 많이 걸리는 단계를 제거 합니다. 짝짓기 하는 것이 없는 플라스 변환 관련 고효율 이후이 전략 또한 크게 정화 및 큰 플라스 미드 도서관의 변화와 관련 된 비용을 줄입니다. 우리 도서관 FUS의 효 모 모델에 대 한 심사를 성공적으로이 메서드를 적용 됩니다.
짝짓기 기반 검사 절차 그림 1에 간략하게 설명 되어 있습니다. 처음, 기준점과 플라스 미드 도서관 종류 α 96 잘 접시의 각 잘 포함 효 모 특정 라이브러리 플라스 미드로 변형 되어 있는 높은 처리량 효 모 전이 프로토콜을 사용 하 여 짝짓기의 단일 효 모 긴장으로 변화 됩니다. 이 컬렉션 변환 효 해 동 하 고 나중에 사용 하기 위해 부활 수 있는 글리세롤 주식으로 저장 됩니다. 이 경우 FUS 독성에 관심사의 효 모 모델 반대 짝짓기 형식과 단일 효 모 스트레인에 생성 해야 합니다 (유형 짝짓기는). 살 균 96 핀 복제기를 사용 하 여 높은 처리량으로, FUS 긴장과 플라스 미드 도서관을 포함 하는 효 모 종자는 96 잘 접시 포함 된 리치 미디어를 전송 하며 수 친구. 짝짓기, 각 작은 볼륨 다음 짝짓기 문화의 잘 96 잘 접시 합성 강하 미디어 모두 FUS를 포함 하는 2 중 효 모에 포함 된 전송 및 라이브러리 유전자 성장할 수 있다. 로봇 탐지 기계는 FUS 및 라이브러리 유전자의 표정을 유도 된 한 천 배지 위에 각 우물에서 효 모 문화를 전송에 사용 됩니다.  또한, 효 모 문화는 어디 FUS 및 라이브러리 유전자 표현 되지 않는다 하는 한 천 배지를 제어 하 발견 됩니다. 한 천 배지에서 성장, 다음 구조 또는 악화 FUS 독성 유전자 식별 합니다.

<table><tbody><tr><td>연어 정자 DNA (SS-DNA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>&nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD 국물</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Granulated Agar</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td><td>Research Products Products International (RPI)</td><td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>합성 Ura- 드롭아웃 매체</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>효모 아미노산 드롭아웃 보충제 -Histidine/-Uracil</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>아미노산 및 황산암모늄 없는 효모 질소 염기</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 (DMSO)</td> <td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>리튬 아세테이트, 무수</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 3350 (PEG-3350)</td> <td>스펙트럼 화학&nbsp;</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>96 핀 리플리케이터&nbsp;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 웰 어세이 플레이트, 뚜껑이 있는 둥근 바닥</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>미처리, 멸균</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; 연구 플러스 멀티채널 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>30-300ul 볼륨</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Isotemp 디지털 건조 욕조/블록 히터</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R 원심분리기</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI 원심분리기</td><td>Beckman</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX 다중 모드 디스펜서</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor HDA&nbsp; &nbsp;</td><td>싱어 악기</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

효 모에 짝짓기 기반 overexpression 라이브러리 심사

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

싹 트는 효 모 단백질 인간의 질병와 관련 된 공부에 모델로 널리 사용 되었습니다. 게놈 전체 유전자 검사는 일반적으로 효 모 연구에 사용 되는 강력한 도구입니다. 다양 한 효 모에 신경 퇴행 성 질환 관련 단백질의 식이 세포 독성 및 집계 형성, 업과 연구 결과 이러한 장애를 가진 환자에서 발생 합니다. 여기, 그 독성의 한정자 루 경화 증 관련 단백질 FUS의 효 모 모델을 검사 하는 방법을 설명 합니다. 변환을 사용 하 여, 대신이 새로운 심사 플랫폼 효 모 모델에 플라스 미드의 기준점과 라이브러리를 소개 하는 효의 짝짓기에 의존 합니다. 짝짓기 방법에는 두 명확한 이점이 있다: 첫째로, 그것은 매우 효율적인; 둘째, 플라스 미드의 사전 변환 된 기준점과 라이브러리 저장할 수 있습니다 글리세롤 주식으로 장기적이 고 신속 하 게 효 모 모델에 변환의 노동 집약 단계 없이 다른 스크린에 적용에 대 한 각 시간. 어떻게이 방법은 성공적으로 사용할 수 있습니다 설명 수정 FUS의 독성 유전자에 대 한 화면으로.

ALS 관련 단백질 FUS, RNA/DNA 의무적인 단백질, 단일 효 모7,8이전 연구 했다. 유전자 검사를 사용 하 여 변환 기반 방법 FUS 독성을 억제 하는 여러 효 모 유전자 발견. 효 모 유전자의 인간 상 동 기관 나중 기본 신경 세포 및 ALS13의 쥐 모델에서 독성 억제에 효과적인 것으로 입증 되었다. 여기, 우리는 사용 하 여 동일한 효 모 모델 overexpression 라이브러리 심사 효과적으로 결합 하 여 수행할 수 있습니다 보여로 변환 하 여.
FUS는 모두 단일과 2 중 효 모 세포에 독성 FUS 및 후속 overexpression 라이브러리 심사의 이전 효 ...

이 문서는 기준점과 플라스 미드 라이브러리를 사용 하 여 신진 효 모에 overexpression 심사를 용이 하 게 하 짝짓기 기반 메서드를 제공 합니다.

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

이 방법은 어떤 유전적 요인과 경로가 질병 관련 단백질의 독성을 조절하는지와 같은 신경퇴행성 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 효모 짝짓기의 고효율 프로세스가 많은 라이브러리 유전자 컬렉션에 대해 효모 모델을 스크리닝하는 데 사용된다는 것입니다. 이 방법은 신경퇴행성 질환 단백질의 독성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 스트레스 조건의 내성과 같은 효모의 다른 세포 과정에 대한 연구에도 적용할 수 있습니다.배열된 플라스미드 라이브러리에서 웰당 5마이크로리터의 플라스미드 DNA를 둥근 바닥 96웰 플레이트로 분주하여 이 절차를 시작합니다. 접시를 섭씨 4도로 유지하십시오. 다음으로, 500ml 플라스크에 150ml의 효모 펩톤 포도당 또는 YPD 배지를 반수체 효모 균주 W303 Alpha의 콜로니를 접종합니다.섭씨 30도에서 배양물을 배양하고 밤새 200rpm으로 흔듭니다. 다음 날 아침, 하룻밤 배양의 OD600을 측정 한 후 배양물을 YPD 2 리터에 0.1의 OD600으로 희석합니다. 섭씨 30도에서 200rpm으로 흔들면서 약 5시간 동안 배양하여 배양액이 0.4 - 0.6의 OD600에 도달할 때까지 배양합니다.효모 배양액을 수확하려면 멸균 250ml 원심분리기 병 8개를 채우고 실온에서 10분 동안 3000xG로 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 붓습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 효모를 세척하고 세포를 두 개의 원심분리 튜브로 통합합니다.각 세포 펠릿을 25ml의 0.1몰 리튬 아세테이트 용액에 재현탁합니다. 재현탁된 세포를 결합하고, 연어 정자 DNA 5ml를 첨가한 다음, 150ml 플라스크로 옮긴다. 섭씨 30도에서 225rpm으로 30분 동안 흔들면서 배양합니다.30분 후, 세포 혼합물을 멸균 일회용 시약 저장통에 붓습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 35마이크로리터의 세포 혼합물을 이전에 준비된 라이브러리 플라스미드 DNA를 포함하는 둥근 바닥 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 96웰 플레이트를 1분 동안 1000rpm으로 소용돌이칩니다.접시를 섭씨 30도에서 30분 동안 흔들지 않고 배양합니다. 열이 더 효율적으로 전달될 수 있도록 플레이트를 쌓지 마십시오. 섭씨 30도 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 1000rpm에서 30초 동안 혼합합니다.각 웰에 125마이크로리터의 변형 버퍼를 추가한 다음 1분 동안 1000rpm으로 플레이트를 와류로 회전시킵니다. 플레이트를 섭씨 30도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 42도의 인큐베이터에 15분 동안 넣어 효모에 열 충격을 가합니다.3000 xG에서 플레이트를 5분 동안 원심분리합니다. 쓰레기통 위에 플레이트를 뒤집고 플레이트에서 버퍼를 강제로 버려 우물에서 변형 버퍼를 제거합니다. 깨끗한 종이 타월로 거꾸로 된 플레이트를 빠르게 닦아서 플레이트 위에 있는 액체를 제거합니다.라이브러리 플라스미드에서 선택 가능한 마커에 해당하는 200마이크로리터의 최소 드롭아웃 매체를 각 웰에 추가하여 세포를 헹굽니다. 여기에는 합성 우라에서 매체를 뺀 값이 사용됩니다. 3000 xG에서 플레이트를 5분 동안 원심분리합니다.앞에서 설명한 대로 쓰레기통 위의 상층액을 제거합니다. 각 웰에 2%포도당을 함유한 160마이크로리터의 최소 우라에서 배지를 뺀 값을 넣고 1분 동안 1000rpm으로 플레이트를 소용돌이칩니다. 섭씨 30도에서 48시간 동안 흔들지 않고 플레이트를 배양합니다.48 시간 후, 변형 된 효모 펠릿이 각 우물의 바닥에서 볼 수 있어야합니다. 액체 디스펜서를 사용하여 포도당을 포함하는 100마이크로리터의 우라에서 배지를 뺀 배지를 새로운 96웰 플레이트 세트의 각 웰에 추가합니다. 변형된 효모가 포함된 플레이트를 1000rpm에서 30초 동안 소용돌이칩니다.멸균 플라스틱 96핀 복제기를 사용하여 변형된 효모가 들어 있는 웰에 핀을 넣은 다음 배지로 채워진 새 플레이트의 해당 웰에 접종합니다. 새 플레이트를 섭씨 30도에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후, 성공적으로 변형된 효모가 들어 있는 각 웰의 바닥에서 효모 펠릿을 볼 수 있어야 합니다.이러한 효모 균주를 글리세롤 스톡으로 저장하려면 각 웰에 50%글리세롤 50마이크로리터를 추가하고 1000rpm에서 30초 동안 플레이트를 볼텍스하고 알루미늄 호일로 플레이트를 밀봉하고 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 글리세롤 스톡에서 라이브러리 균주를 되살리려면 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 96웰 플레이트를 꺼내 알루미늄 호일을 제거한 다음 효모를 실온에서 약 30분 동안 해동합니다. 효모가 해동되면 멸균 플라스틱 96핀 복제기를 사용하여 글리세롤 스톡을 160마이크로리터의 신선한 우라에서 96웰 플레이트에 2% 포도당을 함유한 배지를 뺀 상태로 접종하고 섭씨 30도에서 24시간 동안 배양합니다.라이브러리 균주를 사용한 직후, 플레이트를 밀봉하고 영하 80도의 냉동고에 반납하십시오. 라이브러리 균주가 해동되는 당일, 쿼리 효모 균주에 50ml의 YPD를 접종하고 밤새 250rpm으로 흔들면서 섭씨 30도에서 성장합니다. 다음 날 아침, 쿼리 효모 균주를 멸균 일회용 시약 저장소에 붓고 쿼리 균주 160마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 분취합니다.액체 디스펜서를 사용하여 웰당 160마이크로리터의 YPD 매체를 96웰 플레이트에 분배합니다. 쿼리 스트레인과 라이브러리 스트레인 플레이트를 포함하는 96웰 플레이트를 간단히 와류시킨 다음 멸균 96핀 리플리케이터를 사용하여 라이브러리 스트레인을 쿼리 스트레인이 접종된 YPD 플레이트로 전송합니다. YPD 플레이트를 섭씨 30도에서 24시간 동안 배양합니다.24시간이 지나면 각 우물의 바닥에 효모 알갱이가 보일 것입니다. 쿼리 스트레인의 플라스미드와 라이브러리 플라스미드에서 선택 가능한 마커에 해당하는 2% Raffinose를 포함하는 최소 droupout 배지로 96웰 플레이트를 채웁니다. 멸균 96핀 리플리케이터를 사용하여 YPD 짝짓기 배양에서 선택적 배지로 효모를 이동합니다.96웰 플레이트를 섭씨 30도에서 48시간 동안 배양합니다. 이배체 세포가 짝짓기를 하고 형성되어 query plasmid와 library plasmid를 모두 포함하는 효모 세포만이 이 배지에서 성장할 수 있습니다. 선택적 배지를 함유한 Raffinose에서 48시간 동안 성장한 후 이배체 세포를 포함하는 웰 바닥에서 펠릿이 보이는 것을 관찰합니다.96웰 플레이트를 1분 동안 1000rpm으로 소용돌이칩니다. 로봇 탐지기를 사용하여 2%갈락토스와 2%한천을 포함하는 ura-his-droupout 플레이트와 2%포도당과 2%agar를 포함하는 ura-his-droupout 플레이트의 4배로 한천 플레이트에서 효모를 찾습니다. 얼룩이 생기면 한천 플레이트를 건조시킨 다음 섭씨 30도의 인큐베이터에 거꾸로 4일 동안 넣습니다.24시간마다 한천 플레이트를 촬영하여 효모의 성장을 기록합니다. ALS 관련 단백질 FUS의 독성은 이배체 효모에서 처음으로 조사되었습니다. FUS를 유발하는 갈락토오스를 함유한 한천 플레이트에서 알 수 있듯이 FUS 독성은 이배체 효모와 반수체 효모 모두에서 일관됩니다.형질전환 기반 방법에서 FUS 독성 억제 인자로 이전에 확인된 5개의 유전자를 짝짓기 방법으로 테스트했습니다. lane one은 두 개의 empty vector로 형질전환된 control yeast strain 입니다. 2번째 열은 FUS의 발현이 매우 독성이 있는 빈 벡터를 가진 이배체 FUS 효모 균주입니다.3번에서 7번 레인은 FUS를 발현하는 이배체 효모와 억제 유전자를 보여줍니다. 5개의 유전자 모두 이배체 효모에서 FUS의 독성을 구제하여 짝짓기 방법이 효과적이었음을 나타냅니다. 그런 다음 이 짝짓기 기반 방법을 940개 유전자의 과발현 라이브러리 스크리닝에 적용했습니다.그리고 하나의 대표 플레이트의 사진이 표시됩니다. FUS와 라이브러리 유전자가 발현되는 갈락토스 플레이트에 표시된 바와 같이, FUS는 이배체 효모 세포에 독성이 있었습니다. 녹색 사각형으로 표시된 라이브러리 유전자는 FUS 독성을 구제했습니다.빨간 사각형으로 표시된 라이브러리 유전자는 독성을 높였습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 120시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 스크리닝에 사용되는 표현형이 반수체 짝짓기 유형에 의존하지 않는다는 것을 미리 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 비디오를 시청한 후에는 효모에서 질병 관련 단백질의 독성을 구제하는 과발현 시 유전적 요인을 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 개발 후,이 기술은 신경 퇴행성 질환 분야의 연구자들이 효모 모델에서 질병 관련 단백질의 세포 독성 메커니즘을 탐구 할 수있는 길을 열 수 있습니다. 이 절차에 따라 베타 갈락토시다아제 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 구조가 특이적인지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

이 문서에서는 호스트와 두 개의 직교 방법의 조합을 사용 병원균의 단백질 사이의 높은 자신감 상호 작용 집합의 식별에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 HT-GPCA이라는 포유 동물 세포에서 높은 처리량의 상호 작용 분석에 의해 따랐다.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 지시된 진화 캠페인을 위한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

이 프로토콜 기능 S. cerevisiae에 단백질 기반 상속에 대 한 화면을 높은 처리량 방법을 설명 합니다.

S. cerevisiae 에 단백질 기반 상속에 대 한 높은 처리량 검열

효 모 2 잡종 스크린의 일괄 처리 먹이 융해 단백질의 매우 복잡 한 세트로 여러 미끼 단백질의 상호 작용 프로필의 직접 비교 가능합니다. 여기, 우리는 새로운 시 약, 세련 된 방법과 같은 화면에 대 한 그들의 사용을 구현 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

선물이 분열에 간단한 억압 화면 프로토콜 효 모. 이 방법은 효율적, 돌연 무료이 고 단일 게놈 소재 시에 자주 발생 하는 돌연변이 대 한 선택적입니다.  프로토콜은 진압 완화 돌연변이 또는 약물에 의해 발생 하는 액체 문화에서 성장 결함 격리 적합 합니다.

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

여기, 우리는 향상 된 효 모 프로토콜 식별 관심 인간의 DNA 영역을 바인딩할 수 있는 녹음 방송 요인 (TFs)을 심사 한 하이브리드 제시. 이 메서드 사용 하 여 높은 처리량 검열 파이프라인의 바인딩 심문 수입니다 &gt; 1000 TFs 단일 실험에서.

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

이 연구는 Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 유전자 스크리닝을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스크린은 게놈 전체 플라스미드 라이브러리를 사용하여 질의 돌연변이 균주와 관련된 기능 상실 표현형의 억제인자 클론(들)을 식별합니다. ell1 null 돌연변이체의 신규한 유전자 억제인자를 이 스크린을 사용하여 확인하였다.

Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 인자의 식별을위한 유전자 스크리닝

단백질-단백질 상호 작용과 같은 생체 분자의 상호 작용은 생물학적 기능의 분자 기초입니다. 특별히 관련 상호작용이 없는 상호작용 null/손상된 돌연변이를 분리할 수 있다면, 이 상호작용의 기능을 이해하는 데 크게 도움이 될 것입니다. 이 문서에서는 interaction-null/impaired mutant를 격리하는 효율적인 방법을 제시합니다.

Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리

이 프로토콜은 관심 항원에 결합하는 단백질 변이체를 풍부하게 하기 위해 효모 표면 디스플레이 선택 캠페인을 수행하기 위한 필수 단계를 설명합니다.

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

배우세요 효모 짝짓기 기반 과발현 스크리닝 방법으로 신경퇴행성 질환 단백질 독성 유전자를 효율적으로 분석하는 기술입니다. 이 방법은 다양한 세포 과정 연구에도 활용됩니다.

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

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