의 탐지를위한 동결 건조 루프 - 매개 등온 증폭 시약의 개발 Coxiella burnetii의

이 실험의 전반적인 목표는 환자 샘플에서 C.burnetii를 검출하기 위해 동결건조 시약을 사용하는 간단한 LAMP 방법을 개발하는 것입니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 시약 보관에 대한 코칭이 필요하지 않다는 것입니다. 이 방법은 Q 발열이 풍토병인 리소스가 제한된 환경에서 사용하기에 이상적입니다.

절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 Tatiana가 맡을 것입니다. C.burnetii RSA493의 표적 유전자 IS1111a에 대한 DNA를 시작으로 260나노미터의 분광광도계로 플라스미드 농도를 측정합니다. 다음 계산을 사용하여 플라스미드 DNA 농도를 복제 수로 변환하며, 여기서 6330은 플라스미드의 길이 및 염기쌍과 같고 마이크로리터당 34.2나노그램은 분광 광도계를 사용하여 측정된 플라스미드의 농도입니다.

그런 다음 플라스미드의 8-10배 연속 희석액을 준비하여 마이크로리터당 다음과 같은 복제 수에 도달합니다. LAMP 반응을 위한 DNA 템플릿을 준비하려면 200마이크로리터의 인간 혈장 샘플로 시작하고 DNA miniprep 키트로 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA를 추출합니다. 최종 샘플을 20마이크로리터 부피로 희석합니다.

다음 시약을 결합하여 1밀리리터의 2x LAMP 반응 버퍼를 준비합니다. 10초 동안 펄스 볼텍싱으로 혼합합니다. 표준 LAMP 반응을 수행하려면 0.2 millil PCR 튜브에서 12.5 μlit의 2x LAMP buffer, 1.2 μl의 primer mix, 1 μl의 Bst DNA polymerase 및 5.3 μl의 물을 혼합합니다.

다음으로, 20 마이크로 리터 반응에 5 마이크로 리터의 DNA를 첨가하고 잘 혼합 한 다음 섭씨 60도에서 수조 또는 가열 블록에서 60 분 동안 배양합니다. 배양 후 튜브에 5마이크로리터의 10x 겔 로딩 버퍼를 추가하여 반응을 종료합니다. 그런 다음 삽입 핵산 염색으로 염색된 2% 아가로스 겔에 5마이크로리터의 반응 생성물을 로드합니다.

100볼트에서 1x TBE로 젤을 35분 동안 실행한 다음 UV 광선을 사용하여 결과를 시각화합니다. 재구성된 시약으로 LAMP 반응을 수행하려면 다음 시약을 결합하여 1ml의 재구성 완충액을 준비합니다. 10초 동안 펄스 볼텍싱으로 혼합합니다.

다음으로, 밀봉된 알루미늄 호일 백에서 동결건조된 시약이 들어 있는 튜브를 제거합니다. 4.2단계의 경우 알루미늄 호일 백을 열기 전에 제대로 밀봉되었는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 알루미늄 백이 밀봉되지 않았거나 손상된 경우 튜브를 사용하지 마십시오.

각 시약 튜브에 20마이크로리터의 재구성 완충액을 추가하고 위아래로 5회 피펫팅하여 혼합합니다. 동결건조된 시약이 완전히 재현탁되었는지 확인합니다. 그런 다음 재구성된 시약에 5마이크로리터의 DNA 템플릿을 추가하고 잘 혼합합니다.

섭씨 60도의 수조 또는 가열 블록에서 60분 동안 배양합니다. 배양 후 반응을 종료하려면 5마이크로리터의 10x 겔 로딩 버퍼를 추가한 다음 삽입 핵산 염색으로 염색된 2% 아가로스 젤에 5마이크로리터의 반응 생성물을 추가합니다. 100볼트의 1x TBE 버퍼에서 35분 동안 겔을 실행한 다음 UV 광선으로 결과를 시각화합니다.

하이드록시나프톨 블루(HNB) 또는 삽입염료로 LAMP 반응을 수행하려면 HNB 또는 형광 삽입염료를 포함하는 다음 시약을 결합하여 1ml의 재구성 완충액을 준비합니다. 10초 동안 펄스 볼텍싱으로 혼합합니다. 방금 설명한 대로 LAMP 반응을 수행하고 UV 광선 또는 육안을 사용하여 결과를 시각화합니다.

튜브 스캐너로 LAMP 반응을 수행하려면 형광 삽입 염료를 포함하는 재구성된 시약에 5마이크로리터의 DNA를 추가한 다음 닫힌 튜브를 튜브 스캐너에 삽입합니다. 배양 온도를 섭씨 60도로 설정하고 520나노미터에서 60분 동안 형광을 측정합니다. 이 그림은 새로 준비된 시약과 동결건조된 시약을 사용한 아가로스 겔에 대한 LAMP 반응 결과를 보여줍니다.

동결건조된 시약이 활성을 유지하는 것을 관찰하십시오. 두 시약으로 준비한 LAMP 반응에서 DNA 템플릿 사본 25개가 검출되었습니다. 이 그림에서는 반응에서 HNB 또는 형광 삽입 염료를 사용한 반응 생성물의 검출이 표시됩니다.

반응에 HNB를 추가하면 보라색에서 파란색으로 시각적 색상 변화가 발생하며 반응에 존재하는 25, 50 및 100개의 DNA 템플릿 사본이 있습니다. 또한, 반응에 fluorescent intercalating dye를 포함하면 유사한 DNA copy number가 존재할 때 UV light와 함께 강한 형광 신호를 보여줍니다. 다음은 튜브 스캐너를 사용하여 형광 삽입 염료로 형광 신호를 실시간으로 모니터링한 결과입니다.

형광 신호는 14분, 18분, 21분 및 23분 후에 기준선 위에 있으며 반응에서 10^6, 10^4, 10^3 및 100개의 DNA 템플릿 사본이 있습니다. 이 과정을 완전히 익히면 90분 안에 완료할 수 있습니다. 개발 후 이 분석법은 자원이 제한된 지역에서 Coxiella burnetii 감염을 신속하게 진단할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 동결건조된 LAMP 시약을 재구성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 환자 샘플은 전염성이 있을 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 안전 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.