의 탐지를위한 동결 건조 루프 - 매개 등온 증폭 시약의 개발

본 실험의 전반적인 목표는 환자 검체 내 C.burnetii 검출을 위해 동결 건조 시약을 이용한 간편한 LAMP법을 개발하는 것입니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 시약 보관을 위한 냉동 보관이 필요하지 않다는 점입니다. 이 방법은 Q열이 풍토병인 자원 제한 지역에서 사용하기에 이상적입니다.

우리 실험실의 기술자인 Tatiana가 절차를 시연하겠습니다. C.burnetii RSA493의 표적 유전자인 IS1111a DNA를 사용하여, 260 nanometers에서 분광광도계로 플라스미드 농도를 측정합니다. 다음 계산식을 사용하여 플라스미드 DNA 농도를 복제 수로 변환합니다. 여기서 6330은 플라스미드의 길이와 염기쌍 수를 나타내며, 34.2 nanograms per microliter는 방금 분광광도계를 사용하여 측정한 플라스미드의 농도입니다.

그 다음, 마이크로리터당 다음의 카피 수가 되도록 플라스미드를 8~10배 연속 희석하여 준비합니다. LAMP 반응을 위한 DNA 템플릿을 준비하려면, 200 µL의 인간 혈장 샘플을 사용하여 DNA miniprep kit의 제조사 프로토콜에 따라 DNA를 추출합니다. 최종 샘플을 20 µL 부피로 희석합니다.

다음 시약들을 혼합하여 2x LAMP 반응 버퍼 1 milliliter를 준비합니다. 10초 동안 펄스 볼텍싱으로 혼합합니다. 표준 LAMP 반응을 수행하려면, 0.2 milliliter PCR 튜브에 2x LAMP 버퍼 12.5 microliters, 프라이머 믹스 1.2 microliters, Bst DNA polymerase 1 microliter, 그리고 물 5.3 microliters를 혼합합니다.

다음으로, 20 µL의 반응액에 5 µL의 DNA를 추가하고 잘 혼합한 후, 항온수조 또는 히팅 블록에서 60 °C로 60분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 튜브에 10x gel loading buffer 5 µL를 첨가하여 반응을 종료시킵니다. 그런 다음, 핵산 삽입 염색제로 염색된 2% agarose gel에 반응 생성물 5 µL를 로딩합니다.

1x TBE에서 100V로 35분 동안 겔 전기영동을 수행한 후, UV 램프를 사용하여 결과를 시각화하십시오. 재구성된 시약을 사용하여 LAMP 반응을 수행하려면, 다음 시약들을 혼합하여 1mL의 재구성 버퍼를 준비하십시오. 10초 동안 펄스 보텍싱하여 혼합하십시오.

다음으로, 밀봉된 알루미늄 호일 백에서 동결건조 시약이 들어 있는 튜브를 꺼냅니다. 단계 4.2에서는 백을 열기 전에 알루미늄 호일 백이 제대로 밀봉되어 있는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 알루미늄 백이 밀봉되어 있지 않거나 손상된 경우 튜브를 사용하지 마십시오.

각 시약 튜브에 reconstitution buffer 20 µL를 넣고 피펫팅을 5회 반복하여 섞어줍니다. 동결 건조된 시약이 완전히 재현탁되었는지 확인하십시오. 그 후, 재현탁된 시약에 DNA template 5 µL를 넣고 잘 섞어줍니다.

항온수조 또는 히팅 블록에서 60 °C로 60분 동안 배양합니다. 배양 후 반응을 종료시키기 위해 10x 젤 로딩 버퍼 5 µL를 첨가한 다음, 반응 생성물 5 µL를 핵산 삽입 염색약으로 염색된 2% agarose 젤에 로딩합니다. 1x TBE 버퍼에서 100 V로 35분 동안 전기영동을 수행한 후, UV 광선을 통해 결과를 시각화합니다.

hydroxynaphthol blue(HNB) 또는 인터칼레이팅 염료를 이용해 LAMP 반응을 수행하려면, HNB 또는 형광 인터칼레이팅 염료가 포함된 다음 시약들을 혼합하여 1 milliliter의 재구성 버퍼를 준비하십시오. 10초 동안 펄스 보텍싱하여 혼합합니다. 앞서 설명한 대로 LAMP 반응을 수행하고, UV 광원 또는 육안으로 결과를 확인하십시오.

튜브 스캐너를 사용하여 LAMP 반응을 수행하려면, 형광 삽입 염료가 포함된 재구성된 시약에 5 µL의 DNA를 첨가한 후 닫힌 튜브를 튜브 스캐너에 삽입하십시오. 배양 온도를 60 °C로 설정하고 60분 동안 520 nm에서 형광을 측정하십시오. 이 그림은 갓 제조한 시약과 동결 건조된 시약을 사용한 아가로스 겔 상의 LAMP 반응 결과를 보여줍니다.

동결건조된 시약이 활성을 유지하는지 관찰하십시오. 두 시약으로 준비된 LAMP 반응 모두 25 copies의 DNA 템플릿을 검출하였습니다. 이 그림에서는 HNB 또는 형광 인터칼레이팅 염료를 이용한 반응 생성물의 검출 결과가 나타나 있습니다.

반응액에 HNB를 추가하면 DNA 템플릿이 25, 50, 100 copy 포함된 반응에서 보라색에서 파란색으로의 시각적 색상 변화가 나타납니다. 또한, 반응액에 형광 인터칼레이팅 염료를 포함시키면 유사한 DNA copy 수가 존재할 때 UV 광원 하에서 강한 형광 신호가 나타납니다. 여기에는 형광 인터칼레이팅 염료를 사용하여 튜브 스캐너로 형광 신호를 실시간으로 모니터링한 결과가 제시되어 있습니다.

반응액에 DNA 템플릿이 각각 10^6, 10^4, 10^3, 100 copy 포함된 경우, 14, 18, 21, 23분 후에 형광 신호가 기선(baseline) 위로 나타납니다. 숙달되면 이 절차는 90분 이내에 완료할 수 있습니다. 본 분석법은 개발 이후 자원이 제한된 지역에서 Coxiella burnetii 감염을 빠르게 진단할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청하고 나면 동결건조된 LAMP 시약을 재구성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 환자 검체는 감염성이 있을 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 안전 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.