내부 양성 대조군과 양적 재조합 효소 중합 효소 증폭 분석 개발

다음 실험의 전반적인 목표는 정량적 재조합효소 중합효소 단순화를 사용하여 미지 샘플의 DNA 농도를 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 표적 DNA 내부 양성 대조군, DNA 프라이머 및 형광 표지 프로브를 반응에 추가함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 반응을 Real-Time PCR 기계에 배치하여 반응을 가열하여 효소를 활성화하고 프로브의 형광을 모니터링하여 표적 생성을 감지하고 앰플리콘을 제어합니다.

다음으로, 표준 곡선을 생성하고 분석을 검증하기 위해 스크립트를 사용하여 형광 데이터를 분석합니다. 결과는 HIV 단일 표적 DNA를 정량화하는 데 사용되는 검증 실험을 기반으로 올바른 농도의 한 단계 내에서 DNA 샘플을 정확하게 정량화할 수 있음을 보여줍니다. Real-Time 정량 PCR과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 RPA가 등온이므로 값비싼 열 순환기가 필요하지 않다는 것입니다.

RPA는 또한 온도까지 더 낮은 증폭이 필요하고, 더러운 샘플에 내성이 있으며, 몇 분 내에 검출 가능한 수준까지 표적을 증폭하고, lly 효소를 사용하여 실온에서 쉽게 운반하고 보관할 수 있습니다. 먼저 50% 표백제 용액으로 모든 벤치 탑 및 장비 표면을 청소하여 깨끗한 사전 증폭 작업 공간을 만들고 섭씨 영하 20도의 냉동고에서 280밀리몰의 마그네슘 아세테이트 용액, 재수화 완충액 및 반응 펠릿을 제거하고 용액을 실온에서 해동합니다. 그런 다음 383.5마이크로리터의 재수화 완충액을 41.6마이크로리터의 뉴클레아제 자유수가 있는 새로운 마이크로 퓨지 튜브로 버퍼로 옮기고 와류를 통해 35마이크로리터의 마그네슘 아세테이트를 별도의 튜브에 혼합하여 마스터 믹스를 조립합니다.

재수화 완충액에 있는 마그네슘 아세테이트를 냉동실에 다시 넣습니다. 그런 다음 섭씨 4도의 냉장고에서 프라이머와 프로브쿠아스를 가져옵니다. 사전 증폭 작업 공간에 배치하고 조명을 꺼서 마스터 믹스에 대한 10마이크로몰 정방향 및 역방향 프라이머 각각의 27.3마이크로리터에서 광 노출을 최소화합니다.

다음은 HIV 1D NA로 표시된 10 마이크로 몰 육각의 7.8 마이크로 리터입니다. 마스터 믹스로 프로브하고 튜브를 와류로 만듭니다. 그런 다음 프라이머와 프로브 원액을 보관 시약에 다시 넣고, 내부 양성 대조군을 위해 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 여기에 추가하여 QRPA 반응을 조립할 수 있습니다. 먼저 동결 건조된 효소 펠릿을 2개의 개별 튜브, 저층 8웰 PCR 튜브 스트립, 마스터 믹스 37.5마이크로리터를 펠릿이 들어 있는 튜브에 피펫으로 넣습니다.

피펫 팁으로 튜브의 내용물을 부드럽게 저어 거품이 생기지 않도록 펠릿을 녹입니다. 부피 손실을 방지하고 각 튜브 간에 피펫 팁을 교체해야 합니다. 마스터 믹스를 냉각시키기 위해 최소 5분 동안 튜브를 냉각된 96웰 콜드 블록으로 옮깁니다.

그 동안 thermal cycler 소프트웨어에 프로토콜을 로드하면 플레이트 레이아웃이 텍스트 프로토콜에 표시됩니다. 다음으로, 투명 플라스틱 마이크로 밀봉 접착제 두 스트립을 PCR 튜브보다 약간 넓게 자릅니다. 또한 두 개의 편평한 PCR 튜브 스트립 뚜껑을 얻고 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 HIV one plasmid template을 분취합니다.

그런 다음 10마이크로리터의 템플릿을 적절한 PCR 튜브에 추가합니다. 다시 피펫 팁으로 혼합물을 부드럽게 저어줍니다. 다음으로, 각 튜브 캡에 2.5마이크로리터의 마그네슘 아세테이트를 추가한 다음 완전히 밀봉되지 않도록 반응 튜브 위에 캡을 부드럽게 놓습니다.

마그네슘 아세테이트는 캡을 통해 명확하게 볼 수 있어야 합니다. PCR 튜브 스트립을 마이크로 원심분리기에 넣고 튜브를 10초 동안 원심분리하여 튜브 바닥에 있는 모든 액체를 모으고 기포를 제거합니다. 마그네슘 아세테이트 용액과 마스터 믹스를 결합하면 QRPA 반응이 시작됩니다.

PCR 튜브를 콜드 블록으로 빠르게 제거하여 반응을 중단시킵니다. 다음으로, 반응 오염을 방지하기 위해 뚜껑을 천천히 제거하고 투명한 마이크로 밀봉 필름으로 튜브를 밀봉합니다. 플레이트 레이아웃의 위치에 따라 튜브를 열 순환기로 옮깁니다.

열 순환기의 덮개를 닫고 실행 시작을 클릭합니다. 실행이 완료되면 실험의 파일 이름을 지정해야 합니다. 원시 형광 데이터를 보고 스프레드시트로 내보내면 quantification amplification results라는 파일이 생성됩니다.

표준 곡선을 만듭니다. 먼저 표준 곡선 스크립트를 다운로드한 다음 MATLAB 또는 유사한 데이터 분석 프로그램을 엽니다. 스크립트를 열고 run을 눌러 스크립트를 실행합니다.

메시지가 표시되면 분석할 데이터 파일의 수를 입력합니다. 다음으로, 각 훈련 파일에 표본 수와 반복 실험 수를 입력합니다. 명령 창에서.

표준 곡선을 만드는 데 사용된 로그 기반 10개 사본에 가장 낮은 DNA 농도를 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 여기 예제에서. 가장 낮은 농도는 10 복사를 기준으로 한 로그입니다.

그런 다음 명령 프롬프트에 각 DNA 표준물질 간의 농도 차이를 입력하고 여기에 Enter 키를 누릅니다. 농도 간격은 10개 사본 기준 1개의 로그입니다. 그런 다음 명령 창에 경사 임계값을 입력하고 Enter 키를 누릅니다.

이 값은 일반적으로 3에서 5 사이입니다. Z라고도 하는 양수 임계값에 대한 배경 위의 표준 편차 수를 입력한 다음 Enter 키를 누릅니다.일반적인 Z 값 범위는 1에서 5까지입니다. 그런 다음 이 경우 데이터를 수집하는 데 사용된 장비를 지정합니다.

thermal cycler에 대해 하나를 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 내부 양성 대조군이 있는 경우 새 임계값이 필요한지 여부에 따라 Y 또는 N을 입력하여 임계값의 기본값 또는 새 값을 선택합니다. 마지막으로 표준 곡선을 작성하는 데 사용할 모든 스프레드시트 파일을 선택합니다.

그러면 스크립트가 모든 데이터를 자동으로 가져오고 분석합니다. HIV 1D NA의 서로 다른 복제 수를 포함하는 중복 샘플에 대해 실시간 QRPA를 수행했습니다. 형광의 증가로 나타나는 검출 가능한 증폭의 시작은 복제 수가 낮은 샘플보다 DNA 복제 수가 높은 샘플에서 더 일찍 발생합니다. 원시 형광 데이터는 HIV 1D NA의 알려진 농도의 증폭에서 표준 곡선을 생성하는 데 사용되었습니다. 이러한 데이터는 지수 곡선에 적합했으며 R 제곱 값은 높은 적합도를 나타냅니다.

표준 곡선은 알려진 농도의 추가 DNA 샘플의 농도를 예측하는 데 사용되었습니다. Z의 값을 1로 조정하면 낮은 DNA 농도를 정확하게 예측할 수 있습니다. 대조적으로, 높은 DNA 농도는 Z 값이 5일 때 더 잘 예측됩니다.

이 절차를 시도할 때 RPA에는 DNA 증폭 속도를 제한하는 실제 주기가 없다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 증폭 속도를 정밀하게 제어해야 합니다. 실험 간의 일관성이 중요하므로 모든 실험에 동일한 프라이머 부분 표본을 사용해야 합니다.

열과 빛으로부터 반응 성분을 보호하십시오. 데이터 수집이 시작되기 직전에 마그네슘 아세테이트를 첨가하고 반응이 시작될 때까지 콜드 블록에서 반응을 유지합니다. 실험.