세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영 Coxiella burnetii의 트랜스포존 돌연변이

이 절차의 전반적인 목표는 대규모로 식별하는 것입니다. COE 요인은 감염 주기의 주요 단계와 관련이 있으며, 여기에는 숙주 세포로의 진입, 박테리아 복제 틈새 생성, 지속성 등이 포함됩니다. 이는 먼저 돌연변이 유발에 대한 전치(transpose)에 의해 GF PT co 돌연변이 라이브러리를 생성함으로써 달성됩니다.

다음으로, 숙주 세포는 고립된 모든 돌연변이에 감염됩니다. 그런 다음 콕시엘라 감염에 가장 해로운 돌연변이를 식별하기 위해 마이크로플레이트 리더를 사용하여 모든 돌연변이의 세포 내 복제를 실시간으로 추적합니다. 마지막으로, 콕시엘라(coxiella) 감염 세포를 자동 현미경으로 분석합니다.

궁극적으로, 자동화된 이미지 분석을 통해 얻은 모든 표현형의 형태학적 특성화를 통해 돌연변이된 각 유전자를 콕시엘라 감염 주기의 추정 기능과 연관시킬 수 있습니다. 이 방법은 전체 세포와 상호 작용하고 분자 기계를 유리하게 장악하는 데 필요한 주어진 병원체의 필수 유전자를 대규모로 식별하는 것과 같은 숙주 병원체 상호 작용 분야의 주요 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 COE 콜로니의 도금 및 격리를 달성하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

실제로 COE는 소프트 ACCM 2 aro에서 조심스럽게 추출해야 하는 매우 작은 군체를 형성합니다. 이 방법이 coccal lab 감염에 대한 통찰력을 제공하는 방법. 또한 살모넬라균, 뷰렐, 마이코박테리움 등과 같은 다른 세포 내 병원성 박테리아에도 적용할 수 있습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 유능한 콕시엘라를 트랜스포손 및 트랜스포사제 코팅 플라스미드로 형질전환시킨 후, 개별 돌연변이를 분리하기 위해 용융된 0.5%aros 10ml와 2개의 X accm, 2개의 미생물 안전 캐비닛 또는 MSC에 10ml를 혼합하여 바닥 aros를 준비하고 적절한 항생제를 즉시 페트리 접시에 붓고 뚜껑을 덮지 않고 30분 동안 식힌 다음 20분 동안 자연 건조합니다. 탑 백 아로스를 준비하려면 15ml 폴리스티렌 튜브에 1.25ml의 2 x accm 2와 0.75ml의 물을 섞습니다. 적절한 항생제를 추가하고 섭씨 37도에서 배양합니다.

그런 다음 100마이크로리터의 박테리아 배양액을 1-5초 동안 첨가하고 소용돌이칩니다. 다음으로, 녹은 아로 믹스 0.5ml를 넣고 즉시 바닥 아로스 위에 붓습니다. 접시를 20분 동안 식히십시오.

뚜껑을 덮고 섭씨 4도에서 20분 동안 배양하여 굳히는 데 도움이 됩니다. 그런 다음 뚜껑을 제거하고 플레이트를 20분 동안 자연 건조시킨 후 5%의 이산화탄소와 2.5%의 산소가 함유된 섭씨 37도의 가습 인큐베이터로 6-7일 동안 옮깁니다. 콜로니가 검출되면 1ml 피펫 팁의 끝을 자르고 이를 사용하여 단일 콜로니가 포함된 플러그를 분리하여 콜로니를 수집합니다.

그런 다음 1.5 ml의 accm 2를 포함하는 24 웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 표준 곡선을 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 웰당 5마이크로리터의 10% Triton X 100을 분배하여 각 박테리아 현탁액을 정량화합니다. 검은색 벽과 바닥이 있는 96웰 마이크로플레이트에서 각 웰에 50마이크로리터의 박테리아 현탁액을 추가하고 플레이트 셰이커에서 10분 동안 배양합니다.

실온에서 하나의 XTE 버퍼를 사용하여 이중 가닥 DNA 정량 시약 1에서 200으로 희석하고 각 샘플에 희석된 시약 55마이크로리터를 추가합니다. 96웰 마이크로플레이트에서 플레이트 셰이커를 잘 혼합한 후 실온에서 2-5분 동안 암막 속에서 배양하고 형광 마이크로플레이트 리더와 표준 플루오레세인 파장에 대한 필터를 사용하여 샘플의 형광을 측정합니다. 박테리아 DNA 농도 플롯을 얻기 위해 이전에 준비된 표준 곡선의 형광 판독값을 DNA 농도를 콕시엘라 게놈의 질량으로 나누어 박테리아 농도를 얻습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 단일 프라이머 콜로니 PCR 및 DNA 염기서열분석을 수행한 후 밀리리터당 게놈 등가물로 결과를 표현합니다. 염기서열 분석 소프트웨어를 사용하여 Coxiella Burnett I 4 93 NM one의 완전한 주석이 달린 게놈을 참조 기능에 정렬하고 blast N을 사용하여 염기서열 결과를 로드 및 정렬하고 전치 부위를 결정합니다. RPMI 배지에서 밀리리터당 10 내지 5 셀의 Vero 세포 현탁액을 준비한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 바닥이 평평하고 투명한 검은색 96 웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 현탁액을 분배하고, 400배 G에서 플레이트를 원심분리하고 5분 동안 공간을 두고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 5% 이산화탄소를 배양합니다.

다음날 실온에서 콕시엘라 돌연변이를 포함하는 96웰 플레이트를 내리고 페놀 레드 및 FBS가 없는 300마이크로리터의 RPMI에 150마이크로리터의 박테리아 현탁액을 희석한 후 깊은 웰 96웰 플레이트에서 Vero 세포에서 배지를 제거하고 희석된 콕시엘라 돌연변이체를 웰당 100마이크로리터를 분배합니다. A 1 웰을 음성 대조군으로, 웰 2 및 3을 포지티브 대조군으로 사용하여 에어로졸 밀폐 원심 분리기 플레이트 홀더를 사용하여 플레이트를 400배 G와 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 5% 이산화탄소의 가습 분위기에서 섭씨 37도의 플레이트를 2시간 동안 배양한 후 박테리아 함유 배지를 형광 마이크로플레이트 리더와 플루오레세인 필터가 있는 새로운 완전한 RPMI 배지 웰당 100마이크로리터로 교체합니다.

감염 후 7일째 되는 날에 7일 동안 매일 GFP 형광을 측정하고 플레이트에서 배지를 제거하고 1-1000 희석된 세포 투과성 형광 염료를 포함하는 새로운 완전한 배지 웰당 50마이크로리터로 교체합니다. 배양 후 30-60 분 동안 세포를 배양하고, 배지를 PBS 인큐베이트에서 30 분 동안 실온에서 4 % PFA의 웰 당 50 마이크로 리터로 교체하십시오. 그런 다음 PBS를 사용하여 웰을 세 번 세척하기 전에 PFA 함유 완충액을 제거합니다.최종 세척을 제거한 후 각 웰에 50마이크로리터의 차단 용액을 분배하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 차단 용액을 웰당 40마이크로리터, 새로운 차단 용액 및 1-500 희석의 램프 방지 항체로 교체합니다. 실온에서 30분 동안 배양한 후 용액을 제거하고 플레이트 세척기를 사용하여 PBS 웰당 100마이크로리터를 적용하여 웰을 5회 세척합니다. 그런 다음 적절한 형광 2차 항체를 함유하고 3, 3, 2, 5, 8을 밀리리터당 5마이크로그램으로 걸린 차단 용액 웰당 40마이크로리터를 추가합니다.

실온에서 30분 동안 배양합니다. 샘플을 5번 세척하고 최종 PBS 세척은 건조되지 않도록 웰에 그대로 둡니다. 이미지 획득을 수행하려면 20 x 대물렌즈와 3 4 88 5 55 및 6개의 15 나노미터 채널이 장착된 epi 형광 자동 현미경을 사용하십시오.

샘플당 최소 5,000개의 세포를 이미지화하기 위해 웰당 21개의 독립적인 필드를 획득합니다. 숙주 세포 핵 채널을 참조로 사용하여 자동 초점을 적용합니다. 마지막으로, 자동화된 이미지 분석을 사용하여 획득한 이미지에서 여러 관련 기능을 외삽합니다.

이 그림은 돌연변이의 생존 능력을 평가하는 Genes aen 성장 곡선에서 16점 ICM Coxe L의 돌연변이에 대한 38개의 전치를 보여줍니다. 여기. 상피 세포와 함께 배양된 콕시엘라 돌연변이의 세포 내 성장 곡선은 콕시엘라 게놈의 삽입에 대한 전치와 관련된 표현형에 대한 정량적 분석을 제공합니다. 이 그림에서는 숙주 세포 핵, 세포 윤곽, 리소좀 및 콕시엘라 콜로니를 식별하고 특성화하기 위해 자동화된 이미지 획득이 수행되었습니다.

콕시엘라 콜로니(coxiella colonies)와 세포 및 리소좀(lysosome)을 연관시키면 액포를 함유한 콕시엘라(coxiella)의 형태학적 분석이 가능합니다. 콕시엘라 군집과 숙주 세포 윤곽을 연관시키면 감염된 세포의 형태학적 분석이 가능합니다. 마지막으로 4개의 채널이 병합됩니다.

콕시엘라 군집의 평균 면적은 콕시엘라의 세포 내 복제 또는 숙주 세포에 침입하는 박테리아의 능력에 영향을 미치는 돌연변이를 식별하기 위해 세포당 군집의 수에 대해 표시됩니다. 돌연변이는 3개의 클러스터, 즉 콕시엘라(coxiella)의 세포 내 성장, 콕시엘라(coxiella), 세포 내 콕시엘라(coxiella) 내재화, 그리고 유의하지 않은 표현형(non-significant phenotype)에 영향을 미치는 돌연변이에서 관찰되었다. 여기서, 콕시엘라 군집의 평균 면적은 감염에서 살아남은 숙주 세포의 수에 대해 그래프를 그려 콕시엘라의 발달 후 세포독성을 부여하는 돌연변이를 식별합니다.

이 기술은 세균 감염 분야의 연구자들이 숙주 병원체의 상호 작용을 대규모로 탐구할 수 있는 길을 열었으며 감염병에 대응하기 위한 새로운 치료법 개발을 위한 숙주 및 박테리아 표적을 식별했습니다.