Name: 세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영 Coxiella burnetii의 트랜스포존 돌연변이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 학습하세요 Coxiella burnetii 형광 트랜스포존 돌연변이체를 생성하고 세포 내 복제 및 세포독성 표현형을 자동 분석하는 방법을. 이 기법은 병원균 감염 주기의 필수 유전자를 대규모로 식별하는 데 활용됩니다.

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이 작업은 Matteo Bonazzi에게 Avenir/ATIP 보조금을, Eric Martinez에게 Marie Curie CIG(N° 293731)를 지원했습니다. 저자는 C. burnetii 균주, 항체 및 도구를 공유해 준 Robert Heinzen 박사와 기술 지원 및 데이터 분석을 제공한 Virginie Georget와 Sylvain DeRossi(Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier)에게 감사를 표합니다.

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

호스트 / 병원균 상호 작용의 연구는 세균 감염을 이해하고 전염성 질환에 대응하기 위해 대체 전략을 개발하는 놀라운 방법이 될 입증되었습니다. 그러나, 다른 병원성 세균에 의해 정교 전략의 다양성, 박테리아 독성 인자의 감염시 타겟팅 신호 경로 호스트의 식별 및 특성은 실제 도전을 나타낸다. 이것은 키 호스트 / 병원균 작용 허브 대규모 식별 새로운 접근법의 개발을 요구한다. 혁신적인, 높은 처리량과 높은 콘텐츠 스크리닝 기법의 최근의 개발은 세포 내 박테리아 병원균 (15)의 연구에 적용 할 수있는 귀중한 자원을 나타낸다. 여기서는 트랜스포존 돌연변이 유발 및 형광 계 분석을 결합 스크리닝 방법을 개발하는 모델로 인수 공통 세균성 병원체 Coxiella burnetii에 사용 하였다. ImportanTLY이 스크리닝 방법은, 침략 복제하고 감염된 세포 내에서 유지하기 위해이 세균에 의해 개발 된 전략 개요를 제공하는 글로벌, Coxiella 세포주기의 여러 단계의 동시 모니터링을 허용한다. 여기에 설명 된 접근법을 성공적 세균성 병원균의 연구에 적용되어 두 개의 잘 확립 된 기법, 트랜스포존 돌연변이 유발 및 형광 계 분석에 기초한다. 높은 처리량 / 높은 컨텐츠 화면의 문맥에서 이들 기술을 조합하면 우리는 이벤트의 매우 높은 번호 (세균의 돌연변이 당 전형적으로 15,000 감염된 세포 영상화 및 분석한다)를 분석함으로써 세균의 돌연변이 높은 수의 효과를 평가할 수있다. 이것은, 자연, 높은 변동 될 수 있습니다 숙주 세포 및 세포 내 복제의 세균 침입으로 사건의 중요한 통계 분석을 제공합니다. 이 EP 이외의 해당 셀 라인을 주목하는 것이 중요하다ithelial은이 유형의 스크리닝에 사용될 수있다. 숙주 세포 소기관 감지하기 쉽다 그러나, 편평 상피 세포 및 대형 이미지 분석을 위해 최적이다. 자동화 현미경의 대부분이 자동 판의 다수를 처리 할 수​​ 있기 때문에, 동시에 스크리닝 할 수있는 돌연변이의 수를 실질적으로 제한이 없다. 병원체에 따라 사용자 캔 특권 또는 표면 형광 공 초점 현미경의 사용. 화상 취득의 시간은 주로 웰 당 시야 당 획득 채널 수에 취득 된 필드의 수에, 현미경 카메라의 감도에 의존 할 것이다. 사용자는 선별 프로토콜을 최적화하기 위해 이러한 인자를 조절하는 방법을 결정할 수있다. 예로서, 우리는 5.1 포인트로 지시 한 조건을 이용하여 96 웰 플레이트 / 시간을 묘화. 이미지 분석은 주로 사용되는 기계 (또는 기계 클러스터)에 따라 달라집니다. 우리는 12 코어 (2 × 3.06 GHz의 6 코어) 48 기가 바이트 RAM의 워크 스테이션을 사용합니다. 이 기계는 approxi이 필요합니다후면부로 40 분 한 판에서 획득 된 영상을 분석합니다. 이러한 분석법을 개발하는 새로운 세트 업 (또는 기존의 최적화) 샘플들의 다수의 조작 및 처리를 허용하는 프로토콜 인 경우 중요한 측면이 고려되어야한다. 전형적인 예는 우리가 급속 증폭을 허용 단일 콜로니 PCR 프라이머 접근법의 개발은 매우 작은 샘플들로부터, 각각의 트랜스포존의 삽입 위치를 포함하는 서열 Coxiella DNA 단편. 우리의 경험에 기초하여, 고성능 폴리머 엄선하고 재현 가능한 결과를 수득하기 위해 테스트되어야한다. 이 방법의 유일한 제한은, 대부분의 경우에, 처리 된 샘플의 약 30 %가 악용되지 않으며, 관측 PCR 또는 서열 분석에 의한 단계를 숨길 수있다. 그러나, 새로운 Coxiella 트랜스포존 돌연변이 체의 분리가 속도 - 제한 단계가 아님을 고려하면, 이는 파트 : 않는다주요 문제를 보냈습니다. 마찬가지로, 돌연변이 주식의 세균 농도를 정량화 할 수있는 신뢰할 수있는 분석의 개발이 방법의 핵심이었다. 서스펜션의 집계 Coxiella의 경향으로 인해, 광학 밀도 수치를 사용했다 Coxiella의 문화와 만 기존 대안의 농도 정량 PCR (qPCR에)을 계산하기 위해 적용 할 수 없습니다. 여기서, 형광 태그 DNA에 인터 제의 사용은 크게 박테리아 정량을 가속화. 이 접근법은 또한 사용될 병원체에 따라 여러 가지 세포 내 구획 용 형광 마커를 발현하는 안정한 세포주의 사용을 활용할 수있다. 또 다른 중요한 측면은 페놀 레드없는 세포 배양 배지의 사용이다. 우리는이 산도 표시등이 자동 형광 판독기에 기록 된 신호를 포화 빨간색과 녹색 스펙트럼에 걸쳐 자연 형광을 가지고 관찰했다. 티그는 여기에 제시된 전략은 임의 트랜스포존 돌연변이 유발에 의존한다. 관심의 돌연변이를 들어, 우리는 남부 얼룩과 트랜스포존 삽입 부위의 PCR의 증폭을 사용하여 고유의 트랜스 포지션의 유효성을 검사 (및 clonality) 좋습니다. 프로토콜 절에 설명 된 장치 외에, 여기에 제시된 스크리닝 방법을 사용하고자 팀, 데이터 수집, 데이터 저장을위한 서버 및 신속한 화상 분석 워크 스테이션 관계형 데이터베이스의 셋업에서 큰 장점을 취할 것이다. 중요한 것은, 여기에 다른 세포 내 세균 병원균의 연구를 위해 적합하다 기재된 방법은 무작위 돌연변이 유발 법은 병원체 존재 제공 세포주 병원체에 의해 감염 될 수 있으며,이 중 하나는 감염시 특정 표현형을 표시한다.

신흥, 풍토 박테리아 Coxiella burnetii는 Q의 발열, 심한 건강과 경제에 미치는 영향 1 쇠약 독감 등 인수 공통 질병의 대규모 발생에 대한 책임이 있습니다. Coxiella의 주요 저수지 국내 및 농장 동물, 이는 US의 젖소의 90 % 이상을 가지고 C. 것으로 추정되고 2 burnetii. 인간은 오염 된 에어로졸의 흡입에 의해 감염 우발적 호스트입니다. 인간의 Q 열이 명단 중 65 % 1,3에 도달 사망률과 치명적인 합병증을 가질 수있는 급성 또는 만성 질환, 등. (1)의 감염 복용량 - 10 생물, Coxiella 알려진 가장 전염성 병원체이며, 그것은 잠재적 인 생물 무기 (4)로 조사되었다. 네덜란드 (2,007에서 2,010 사이)에서 Q 열병의 최근 폭발 발생의 경우 연간 2,000에 182에서 확대와 함께,이 병원균의 심각한 독성의 예를 들어 서5. Coxiella 감염의 놀라운 효율은 가능성이 세포를 호스트하는 독특한 적응과 함께 환경 스트레스에 대한 저항과 관련이있다. 실제로, Coxiella 여러 가혹한 조건 (탈수, 온도 등)에 대한 내성이 현저하게 대사 비활성 소세포 변이체 (SCV) 형태의 환경에 존재한다. 비 식세포의 침윤이 Coxiella 접착 / 침입하는 OmpA 7 아직 미확인 수용체에 의해 매개되는 동안 SCVs 최대 3 인테그린 6 β α의 V를 통해 식세포에 의해 촬영된다. 흡수 후, Coxiella은 Rab5 및 EEA1 8 초기 엔도 좀 마커에 대한 긍정적 인 꽉 끼는 액포,에 있습니다. 박테리아는 도트 / ICM 4 형 분비 시스템 (T4SS) (9) 대사 활성 대 세포 변형 (상용차)로 변환하고 활성화하여 엔도 좀의 산성화에 응답, 레지오넬라 뉴모 필라 (10)의 고도로 상동. 도트 / ICM 이펙터의 분비 Coxiella 박테리아가 번성하고 적극적 아폽토시스 11에서 감염된 세포를 보호 할 수있는 활성 리소좀 효소를 포함하는 대형 LAMP1 양성 산성 칸을 생성 할 수있다. 따라서, Coxiella의 세포주기 세균성 이펙터 (12)의 도트 / ICM 매개 전위에 의해 제어된다, 그러나, 숙주 세포 침윤, 박테리아 복제 및 감염의 보급에 관련된 미생물의 미지의 요인이 크게 남아있다. 숙주 세포 내에서 1) 내재화, 2) 세포 내 복제, 3) 셀 간 전파 : 트랜스포존 돌연변이 유발 및 형광 계 분석을 결합하여, 우리는 Coxiella 감염의 주요 단계에 관여하는 박테리아 인자의 동시 식별 공평 접근법을 개발 및 4) 지속성. 지금까지 우리는 1,000m에 걸쳐 상영 한Coxiella의 병인 (7)을 조절 호스트 병원체 상호 작용에 대한 전례없는 통찰력으로 우리를 제공하는 500 Coxiella 코딩 시퀀스에서 utations. 참고로,이 접근법은 Coxiella으로 세포 생물학 기능을 공유하는 다른 세포 내 병원체의 연구에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>구연산</td><td>: 시그마</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr><tr><td>구연산 나트륨</td><td>: 시그마</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr><tr><td>인산 칼</td>륨 <td>시그마</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>시그마</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr><tr><td>염화 칼슘</td><td>시그마</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr> 황<tr><td>산철</td> 시<td>그마</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr><tr>염화<td>나트륨</td><td>시그마</td><td>S9625-500G</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr><tr><td>L-시스테인</td><td>시그마</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr><tr><td>Bacto Neopeptone</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr><tr><td>카사미노산</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>223050</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr><tr><td>메틸-B-사이클로덱스트린</td><td>Sigma</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr><tr><td>RPMI w/glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 중간 성분</td></tr><tr><td>RPMI w/glutamax, 페놀 없음</td><td>Red Gibco</td><td>32404-014</td><td>세포 배양 및 감염용</td></tr><tr><td>태아 혈청</td><td>GE 헬스케어</td><td>SH30071</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>트립신 EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>사포닌</td><td>시그마</td><td>47036</td><td>면역형광 염색용</td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>시그마</td><td>A9434</td><td>면역형광 염색용</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A2153</td><td>면역형광 염색용</td></tr><tr><td>Electroporation 큐벳 0.1 cm</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>Coxiella 변환용</td></tr><tr><td>Trackmates 캡이 있는 스크류 탑 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>2D 바코드 스크류캡</td></tr><tr><td>검은색 벽과 바닥이 있는 96웰 마이크로플레이트</td><td>Greiner</td><td>655076</td><td>평평한 어두운 바닥, dsDNA 정량용</td></tr><tr><td>96웰 PCR 마이크로플레이트</td><td>Biorad</td><td>2239441</td><td>DNAse/RNAse free</td></tr><tr><td>96-well plate, deepwell</td><td>Labcon</td><td>949481</td><td>Coxiella 돌연변이 감염</td></tr><tr><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td><td>dsDNA 정량화용</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>dsDNA 정량화용</td></tr><tr><td>Phusion 고충실도 DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>단일용 프라이머 콜로니 PCR</td></tr><tr><td>Celltracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td>이미징</td></tr><tr><td>용 Anti-LAMP1 항체</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>면역 형광 염색 용</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>L1418</td><td>이미징</td></tr> 형<tr><td>광 마이크로 플레이트 리더 용 Infinite 200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence 자동 현미경 셀로믹스</td><td>써모 사이언티픽(Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>)

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

내습 및 세균성 병원균에 의한 숙주 세포의 콜로니가 파괴 및 키 호스트 기능을 조작 할 수있는 독성으로 정의 원핵 인자 단백질의 다수의 활성에 의존한다. 호스트 / 병원균 상호 작용의 연구는 세균 감염을 이해하고 전염성 질환에 대응하기 위해 대체 전략을 개발하는 것이 매우 중요하다. 이 방법은 그러나, 세균 독성 결정의 편견, 자동 식별 및 특성화를위한 새로운 높은 처리량 분석의 개발이 필요합니다. 여기서는 트랜스포존 돌연변이 유발에 의해 GFP 표지 된 돌연변이 체 라이브러리를 생성하는 방법을 설명하고 높은 콘텐츠 스크리닝의 개발은 여러 트랜스포존 관련 표현형의 동시 식별에 접근한다. 우리의 작업은 SE 모델과 연관된 세포 내 세균 병원체 Coxiella burnetii의, Q의 동물 원성 감염증의 발열 병인 에이전트이며베르는 필연적 건강과 경제적 부담으로 발병이. 이 병원균의 의무적 세포 내 성격은, 최근까지 심각한 Coxiella의 높은 처리량 / 높은 콘텐츠 접근 방식의 구현을위한 이상적인 모델을 만들고, 호스트 병원체 상호 작용에 관여하는 세균 요인의 식별을 방해하고있다.

트랜스포존 돌연변이 체의 분리 후, 단일 콜로니 PCR 프라이머는 각 변이체에 대한 트랜스포존 삽입 부위를 식별하기 위해 강력하고 높은 처리량 방법이다. 이 접근법은 전형적인 중첩 PCR 프로토콜에서 유래하지만 여기에 단일 프라이머 어닐링 온도 (도 1a)의 엄격함에 따라 주형 DNA에 특이 적 및 / 또는 비 - 특이 적 혼성화. 전형적인 PCR 제품 고유 대부분 여러 DNA 단편 (도 1b)로 구성된다. 오른쪽 트랜스포존 ITR의 상류 및 증폭 프라이머에 의해 인식 서열의 하류 어닐링 다른 시퀀싱 프라이머의 사용은 시퀀싱 공정 (도 1C)에 대한 특이성을 제공한다. 서열 분석을위한 자동화 된 소프트웨어는 트랜스포존 삽입 (도 1C)의 정확한 위치를 제공 Coxiella 게놈에 얻어진 서열 정렬. 모든 트랜스포존 삽입은 앤 될 수 있습니다Coxiella 게놈 (그림 1D)에 otated. 각 Coxiella 돌연변이 격리 및 저장 중 또는 스크리닝 이전 ACCM -2- axenically 배지에서 증폭된다.이 16 도트 / ICM Coxiella 유전자 (도 2A)에서 38 트랜스포존 돌연변이의 예를 도시한다. Coxiella 돌연변이의 생존력을 평가하기 위해, 무균 성장 곡선은 1.5 (Figurie 2B)에 기재된 세균 농도 분석을 접종 후 7 일간 배양 박테리아를 샘플링하고 적용함으로써 얻어진다. 증폭 된 돌연변이 후 7 일간 중으로 96- 웰 플레이트에서, 상피 세포와 함께 배양한다. 생성 된 모든 Coxiella 돌연변이 GFP 표지 된 세포 내 성장 곡선은 물론, 매 24 시간을 매의 GFP의 형광 강도를 측정하고, 시간의 함수 (도 2C)로 측정 값을 플로팅하여 수득된다. INTR무 세포 성장 곡선 Coxiella 게놈의 모든 트랜스포존 삽입과 관련된 표현형의 정량 분석을 제공한다. 같은 트랜스포존 돌연변이에 대한 질적 정보를 추가하기 위해, 우리는 자동화 된 이미지 수집 및 분석을 선택했다. 이레는 매 4에 기재된 그러한 CellProfiler (넓음 연구소 5. 자동화 된 이미지 분석 소프트웨어에 기재된 자동화 표면 형광 현미경을 이용하여 분석으로 면역을 위해 처리, 고정, 게시물 감염 <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com를</a> 취득 채널을 처리) 독립적으로 세그먼트 비교 분석 (그림 3)에 대한 개체를 확인했다. 이 숙주 세포의 핵, 세포 윤곽, 리소좀과 Coxiella 식민지 (그림 3 상단 패널)의 식별 및 형태 학적 특성을 수 있습니다. 세포와 리소좀으로 Coxiella 식민지 상호 연계 identificati 수 있습니다에와 (긍정적 램프 1, 그림 3 왼쪽 하단 패널입니다) Coxiella 함유 액포의 특정 형태 학적 분석. 숙주 세포의 윤곽과 Coxiella 식민지를 상호 연계하는 식별 및 감염된 세포의 특정 형태 학적 분석 (그림 3 하단 중앙 패널을) 할 수 있습니다. 마지막으로, 4 채널은 그림과 품질 관리 목적으로 (그림 3 오른쪽 아래 패널)에 대한 병합됩니다. 자동화 된 이미지 분석에서 얻은 정보는 &quot;다중 표현형 산포도&quot;를 얻기 위해 서로에 대해 도시 될 수있다. 예로서, Coxiella 콜로니도 4a (μm의 2)의 평균 면적에 Coxiella (복제 표현형) 및 / 또는 세포 복제에 영향을주는 돌연변이를 확인하기 위해, 세포 (도 4a) 당 콜로니의 수에 대해 플롯 숙주 세포에 침입하는 세균의 용량 (INTERNA사용 효율 표현형). 통계 분석은 경증 (-4 &lt;Z 점수 ≤ -2) 및 중증 (Z 점수 ≤ -4) 표현형에 해당하는 결과 산포도의 영역을 정의하는 데 사용되었다. 돌연변이는 3 주 클러스터에서 관찰되었다 : Coxiella의 결함이있는 세포 내 성장의 결과 돌연변이가 플롯 (그림 4A, 핑크와 레드 도트)의 가장 왼쪽 부분에 그룹화 하였다 세포에서 Coxiella의 국제화에 영향을 돌연변이가 플롯의 하단 부분에 그룹화되었다 (그림 4a는, 빛과 어둠 파란색 점) 그리고 마지막으로, 플롯의 가장 오른쪽 지역에서 녹색 점 (비 상당한 표현형의 결과 돌연변이에 해당 Z 점수&gt; -2). 중요한 것은, 복제에 실패하지만 여전히 숙주 세포에 침입 할 수있는 돌연변이, 세포 핵 (그림 4C, 두 번째 패널) 호스트에 인접한 단일 박테리아, 또는 작은 식민지, 같은 감염 7 일 후에 검출된다. 따라서, Coxiella의 크기 &quot;콜로가 다진 &quot;가 크게 영향을 받게되지만 감염된 세포의 수는 WT Coxiella -infected 세포에 비해 차이가없는 것이다. 반면에, 숙주 세포에 침입 할 Coxiella의 용량에 영향을주는 돌연변이 콜로니 / 셀의 수의 감소를 초래한다. 이 값이 1보다 크게 될 때, 평균적으로, 감염된 세포의 총 수가 감소가 있음을 나타낸다. 대안 적으로, Coxiella 콜로니 (μm의 2)의 평균 면적은 Coxiella (세포 독성 표현형)에 세포 독성을 부여하는 돌연변이를 식별 감염 (도 4b)에 생존하는 숙주 세포의 수에 대해 도시 될 수있다. 상기와 같이, 통계 분석은 가벼운 (-4 &lt;Z 점수 ≤ -2) 및 중증 (Z 점수 ≤ -4) 표현형에 해당하는 결과 산포도에서 영역을 정의하는 데 사용되었다. 대부분의 돌연변이가 크게 숙주 박테리아 내에서 복제에 관계없이, 세포 생존에 영향을 미치지 않았다 스크리닝세포 (그림 3B 녹색 점). (37) 돌연변이 약간 영향을받는 숙주 세포의 생존 (그림 3B, 밝은 적색 점), 7 돌연변이는 세포 생존 (그림 3B, 어두운 붉은 점) 호스트 특히 해로운했다. 실험의 필요에 따라, 자동 화상 분석 방법에 의해 얻어진 부가적인 파라미터가 다른 차트를 유도하는데 이용 될 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> 그림 1. 시퀀싱 및 Coxiella 트랜스포존 돌연변이 주석 (A) 단일 콜로니 PCR 프라이머는 트랜스포존 삽입 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭하기 위해 사용된다. 증폭 프라이머 (앰프)를 어닐링 온도의 엄격도에 따라 특정 및 불특정 프라이머 모두를 사용한다. (B) 하나의 프라이머 식민지 PCR의 전형적인 결과. 각각의를 ReactiON은 트랜스포존 삽입 부위를 포함하는 일부는 가변 크기의 단편의 개수를 생성한다; 일부 다른 무작위 부산물 낮은 엄격 PCR 사이클로 증폭된다. (C) 트랜스 포슨 서열에 혼성화 시퀀싱 프라이머 (서열)의 사용은 관심의 단편의 서열 분석을 허용한다. (D) 서열 분석 소프트웨어는 세균 게놈에 트랜스포존 삽입의 자동 주석을 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> 그림 2. 무균 및 Coxiella 트랜스포존 돌연변이 체의 세포 성장 (A)의 파일럿 화면에서, 우리는 16 코어 38 g 트랜스포존 돌연변이 염기 서열을 단리시키고, 스크리닝 한Coxiella 점 / ICM 분비 시스템의 ENES는 (빨간색 표시). 각 트랜스포존 돌연변이의 생존력을 평가하기 위해, (B), 각각의 성장은 무균 배지에서 분리가이 형광 DNA에 인터 에이전트를 이용하여 태그 팔일 통해 모니터링된다. (C) 각 돌연변이 후 상피 세포를 감염시키기 위해 사용된다. 트랜스포존은 GFP 카세트를 가지고로서, 세포 내 세균의 성장은 마이크로 플레이트 리더를 사용하여, Coxiella 복제와 관련된 GFP의 형광의 변화에 따라 감염의 7 일 이상을 모니터링합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> 그림 3 : Coxiella 감염의 자동화 된 이미지 분석 자동.메이트 표면 형광 현미경 이미지를 삼중으로 96 웰 플레이트의 웰 당 21의 위치를​​ 사용한다. 이미지 분석 소프트웨어 세그먼트 정량 분석​​을 위해 각 채널에서 오브젝트를 취득. 모든 경우에, 이미지의 경계를 터치 물체는 제외된다. (A) 훽스트 채널 (녹색 동그라미) 숙주 세포의 핵을 식별하는 데 사용된다. (B) 이들 채널을 Cy3에서 숙주 세포의 윤곽을 파악하기 위해 시드로서 사용되는이 (핵의 위치를 파란색으로 선회되어, 셀 등고선은 녹색이다). (C) Cy5의 채널 LAMP1 양성 구획을 식별하는 데 사용된다 (녹색 원); 만 (빨간색) 이전에 확인 된 세포 윤곽에 포함 된 객체는 이미지 분석을 위해 유지됩니다. (D) 채널은 GFP (녹색 동그라미) Coxiella 콜로니를 식별하는 데 사용된다. (E)는 램프 1 양성 구획으로 Coxiella 식민지 상호 연계하는 것은 Coxiella의 식별을 할 수 있습니다 </em&gt; 함유 액포 (CCVS); 만 (녹색) 이전에 확인 된 세포 윤곽에 포함 된 객체는 이미지 분석을 위해 유지됩니다. 세포 윤곽으로 Coxiella 식민지의 상관 관계 (F)는 감염된 세포 (모조 착색)의 식별을 할 수 있습니다. 4 형광 채널에서 획득 한 (G) 사진 (Coxiella 콜로니 (녹색), 숙주 세포의 핵 (파란색), 숙주 세포의 원형질막 (회색) LAMP1 양성 구획 (적색)에 대응하는) 병합 및 그림 품질을 위해 사용된다 제어 할 수 있습니다. 규모는 10 μm의 바. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> 도 4 : 호스트에 관여 Coxiella 인자 대규모 성분 / 병원균 인터랙트이온. (A) Coxiella 콜로니 (2 μm의) 세포 당 콜로니의 상대적인 수에 대해 플롯 팅 평균 면적은, 관심 복제 및 내재화 표현형 동정을 행 하였다. 녹색 점은 Z 점수&gt; -2 (중요하지 않음)에 의해 WT Coxiella에서 벗어나는 표현형을 나타낸다. 핑크와 밝은 파란색 점 -2 -4 (가벼운 표현형) 사이의 Z 점수로, 각각 복제 및 내재화 표현형을 나타냅니다. 빨간색과 진한 파란색 점은 Z-점수 ≤ -4 (강한 표현형)과 표현형을 나타냅니다. Coxiella 콜로니 (B) (2 μm의) 평균 면적은 트랜스포존의 삽입에 의한 세포 독성 효과를 추정하기 위해 감염 후 7 일 살아남은 세포 (감염과 감염되지 않은)의 총 수에 대해 도시 하였다. 녹색 점은 Z 점수&gt; -2 (중요하지 않음)에 의해 WT Coxiella에서 벗어나는 표현형을 나타낸다. 핑크 도트는 세포 독성 산도를 나타내는-2 -4 (가벼운 표현형) 사이의 Z-점수 enotypes. 빨간 점은 Z-점수 ≤ -4 (강한 표현형)와 세포 독성 표현형을 나타냅니다. 화살표 (C) (C)에 대응하는 소문자에 의해 설명 돌연변이 복제, 국제화 및 세포 독성 표현형의 대표 이미지를 나타냅니다. 모든 경우에있어서, 숙주 세포의 핵이 적색이고, Coxiella 콜로니는 녹색이다. 규모는 50 μm의 바. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Coxiella burnetii의는 인수 공통 질병 Q 열병에 대한 책임 의무적 세포 내 그람 음성 세균이다. 여기에서 우리는 Coxiella 형광 트랜스포존 돌연변이의 발생뿐만 아니라 자동 식별 및 결과 국제화, 복제 및 세포 독성 표현형의 분석 방법을 설명합니다.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 대규모로 식별하는 것입니다. 숙주 세포 침투, 박테리아 복제 틈새 생성 및 지속성을 포함하여 감염 주기의 주요 단계에 관여하는 COE 인자들을 식별하는 것입니다. 이는 먼저 전이성 돌연변이 유발법(transpose on mutagenesis)을 통해 GF PT 공동 돌연변이 라이브러리를 생성함으로써 수행됩니다.다음으로, 분리된 모든 돌연변이체로 숙주 세포를 감염시킵니다. 그 후, Coxiella 감염에 가장 치명적인 돌연변이를 식별하기 위해 마이크로플레이트 리더를 사용하여 모든 돌연변이체의 세포 내 복제를 실시간으로 추적합니다. 마지막으로, Coxiella에 감염된 세포를 자동 현미경으로 분석합니다.최종적으로, 자동화된 이미지 분석을 통해 얻어진 모든 표현형의 형태학적 특성을 규명함으로써, 각 돌연변이 유전자를 Coxiella 감염 주기 내의 추정 기능과 연관시킬 수 있습니다. 이 방법은 특정 병원체가 전체 세포와 상호작용하고 그 분자 기전을 자신에게 유리하게 이용하는 데 필요한 필수 유전자를 대규모로 식별하는 것과 같이, 숙주-병원체 상호작용 분야의 핵심 과제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. COE 콜로니의 도말 및 분리가 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.실제로 COE는 매우 작은 콜로니를 형성하므로 부드러운 ACCM two aro에서 조심스럽게 추출해야 합니다. 이 방법은 구균 실험실 감염에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 salmonella, burel, mycobacterium 등과 같은 다른 세포 내 병원성 박테리아에도 적용할 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 따라 트랜스포존 및 트랜스포사제 코팅 플라스미드로 컴피턴트 coxiella를 형질전환한 후, 개별 돌연변이체를 분리하기 위해 미생물 안전 작업대(MSC)에서 10 mL의 녹인 0.5% agar와 10 mL의 2X ACCM-2를 혼합하여 하단 agar를 준비하고 적절한 항생제를 첨가합니다. 즉시 페트리 접시에 붓고 덮개 없이 30분 동안 식힌 후 20분 동안 공기 건조합니다. 상단 bag agar를 준비하려면 15 mL 폴리스티렌 튜브에 1.25 mL의 2X ACCM-2와 0.75 mL의 물을 혼합합니다. 적절한 항생제를 첨가하고 37 °C에서 배양합니다.그 다음, 1~100 µL의 박테리아 배양액을 첨가하고 5초 동안 볼텍싱합니다. 이어서, 녹인 aros 믹스 0.5 mL를 첨가하고 즉시 바닥 aros 위에 붓습니다. 플레이트를 20분 동안 냉각시킵니다.뚜껑을 덮고 4 °C에서 20분 동안 배양하여 응고를 돕습니다. 그 후 뚜껑을 제거하고 플레이트를 20분 동안 공기 건조시킨 다음, 5% carbon dioxide와 2.5% oxygen이 공급되는 37 °C 가습 배양기에 넣어 6~7일 동안 배양합니다. 콜로니가 관찰되면, 1 mL 피펫 팁의 끝을 잘라 단일 콜로니가 포함된 플러그를 분리하여 수집합니다.그런 다음, 1.5 milliliters의 accm two가 들어 있는 24 well plate의 well로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 표준 곡선을 작성한 후, well당 5 microliters의 10%Triton X 100을 분주하여 각 박테리아 현탁액을 정량합니다. 벽면과 바닥이 검은색인 96 well microplate의 각 well에 박테리아 현탁액 50 microliters를 첨가하고 plate shaker에서 10분 동안 배양합니다.실온에서 XTE 버퍼를 사용하여 이중 가닥 DNA 정량 시약을 1:200으로 희석하고, 희석된 시약 55 µL를 각 시료에 첨가합니다. 96-웰 마이크로플레이트를 플레이트 쉐이커로 잘 섞은 후 실온의 암소에서 2~5분 동안 배양하고, 형광 마이크로플레이트 리더와 표준 플루오레세인 파장용 필터를 사용하여 시료의 형광을 측정합니다. 박테리아 DNA 농도 그래프를 얻기 위해, 이전에 준비한 표준 곡선의 형광 측정값을 활용하며, DNA 농도를 Coxiella 게놈 질량으로 나누어 박테리아 농도를 구합니다.텍스트 프로토콜에 따라 단일 프라이머 콜로니 PCR 및 DNA 시퀀싱을 수행한 후, 결과를 mL당 게놈 당량으로 표기하십시오. 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 Coxiella Burnett I 4 93 NM의 전체 주석 게놈을 참조 서열 정렬 기능을 통해 불러오고, blast N을 사용하여 시퀀싱 결과를 불러와 정렬한 뒤 전이 부위를 결정하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 RPMI 배지에서 10⁵ cells/mL의 Vero 세포 현탁액을 준비한 후, 바닥이 평평하고 투명한 블랙 96웰 플레이트의 각 웰에 현탁액 100 µL를 분주하고, 플레이트를 400 ×g에서 실온으로 5분간 원심 분리한 뒤 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, Coxiella 변이주가 포함된 96-웰 플레이트를 상온에서 준비하고, 딥-웰 96-웰 플레이트에 phenol red와 FBS가 없는 RPMI 300 µL를 사용하여 박테리아 현탁액 150 µL를 희석합니다. 다음으로, Vero 세포의 배지를 제거하고 희석된 Coxiella 변이주를 웰당 100 µL씩 분주합니다. A1 웰을 음성 대조군으로, A2 및 A3 웰을 양성 대조군으로 사용합니다. 에어로졸 밀폐형 원심분리 플레이트 홀더를 사용하여 플레이트를 상온에서 400 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 그 후, 5% CO2의 가습 분위기 속 37 °C에서 플레이트를 2시간 동안 배양한 다음, 박테리아가 포함된 배지를 웰당 100 µL의 신선한 완전 RPMI 배지로 교체합니다. 형광 마이크로플레이트 리더와 fluorescein용 필터를 사용하여 측정합니다.7일 동안 매일 GFP 형광을 측정합니다. 감염 후 7일째에 플레이트에서 배지를 제거하고, 1:1000로 희석한 세포 투과성 형광 염료가 포함된 신선한 완전 배지 웰당 50 µL로 교체합니다. 세포를 30~60분 동안 배양한 후, 배지를 PBS에 희석된 4% PFA 웰당 50 µL로 교체하고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음 PFA 함유 완충액을 제거하고 PBS를 사용하여 웰을 3회 세척합니다. 마지막 세척액을 제거한 후, 각 웰에 블로킹 용액 50 µL를 분주하고 상온에서 30분 동안 배양합니다.그다음 블로킹 용액을 웰당 40 µL의 신선한 블로킹 용액과 1:500으로 희석한 anti lamp 1 항체로 교체합니다. 실온에서 30분 동안 배양한 후, 용액을 제거하고 플레이트 워셔를 사용하여 웰당 100 µL의 PBS로 5회 세척합니다. 그런 다음 적절한 형광 2차 항체와 5 µg/mL의 hooked 3 3 2 5 8이 포함된 블로킹 용액을 웰당 40 µL씩 첨가합니다.실온에서 30분 동안 배양합니다. 샘플을 5회 세척하고, 웰이 건조되는 것을 방지하기 위해 마지막 PBS 세척액을 웰에 그대로 둡니다. 이미지 획득을 위해, 20 x 대물렌즈와 3 4 88 5 55 및 6 15 nanometer 채널이 장착된 에피 형광 자동 현미경을 사용하십시오.샘플당 최소 5,000개의 세포를 이미지화하기 위해 웰당 21개의 독립적인 시야(field)를 획득합니다. 숙주 세포 핵 채널을 참조로 사용하여 자동 초점을 맞춥니다. 마지막으로, 자동 이미지 분석을 통해 획득한 이미지에서 다수의 관련 특징들을 도출합니다.이 그림은 16개 지점의 ICM Coxe L 유전자에서 38개 전이인자 돌연변이체의 성장 곡선을 통해 돌연변이체의 생존력을 평가한 결과를 보여줍니다. 상피 세포와 함께 배양된 Coxiella 돌연변이체의 세포 내 성장 곡선은 Coxiella 게놈의 전이인자 삽입과 관련된 표현형에 대한 정량적 분석을 제공합니다. 이 그림에서는 호스트 세포 핵, 세포 윤곽, 리소좀 및 Coxiella 군락을 식별하고 특성화하기 위해 자동 이미지 획득이 수행되었습니다.Coxiella 콜로니를 세포 및 리소좀과 상관 분석함으로써 Coxiella 함유 액포의 형태학적 분석이 가능합니다. Coxiella 콜로니를 숙주 세포의 윤곽과 상관 분석함으로써 감염된 세포의 형태학적 분석이 가능합니다. 마지막으로, 네 가지 채널을 병합합니다.Coxiella 콜로니의 평균 면적을 세포당 콜로니 수에 대해 도식화하여, Coxiella의 세포 내 복제 또는 박테리아의 숙주 세포 침입 능력에 영향을 미치는 돌연변이를 식별합니다. 돌연변이체는 세 가지 클러스터, 즉 Coxiella의 세포 내 성장에 영향을 미치는 돌연변이, 세포 내 Coxiella 내재화에 영향을 미치는 돌연변이, 그리고 유의미하지 않은 표현형으로 관찰되었습니다. 여기서는 Coxiella의 발달 후 세포 독성을 부여하는 돌연변이를 식별하기 위해, Coxiella 콜로니의 평균 면적을 감염 후 생존한 숙주 세포 수에 대해 도식화하였습니다.이 기술은 박테리아 감염 분야의 연구자들이 대규모로 호스트-병원체 상호작용을 탐구할 수 있는 길을 열어주었으며, 감염성 질환에 대응하는 새로운 치료법 개발을 위한 호스트 및 박테리아 표적을 식별해냈습니다.

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Research

연구

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앞으로 유전학이 어떻게 분자 수준을 해명하기위한 강력한...

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형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

이 비디오는 배양된 상피 세포 내에서 GFP 태그가 지정된 Coxiella 돌연변이의 세포 내 성장을 평가하는 방법을 보여줍니다. 돌연변이 표현형은 면역염색 및 형광 현미경을 사용하여 시각화되어 세포 내 성장에 대한 돌연변이의 영향을 연구할 수 있습니다.

진핵 세포 내 Coxiella 돌연변이의 세포 내 성장 평가

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생성 엔테로 박터 SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

스트레스 저항은 장수의 특징 중 하나이며 유 전적으로 규율하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 장수 연구에 마우스 모델을 개발하기 위해있는 배아 줄기 세포에 스트레스 저항을 부여 돌연변이 선별 편견 높은 처리량 방법을 개발했다.

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고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

학습하세요 Coxiella burnetii 형광 트랜스포존 돌연변이체를 생성하고 세포 내 복제 및 세포독성 표현형을 자동 분석하는 방법을. 이 기법은 병원균 감염 주기의 필수 유전자를 대규모로 식별하는 데 활용됩니다.

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